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Scientia Agricola

On-line version ISSN 1678-992X

Sci. agric. vol.57 n.1 Piracicaba Jan./Mar. 2000

https://doi.org/10.1590/S0103-90162000000100007 

Calogênese, embriogênese somática e isolamento de protoplastos em variedades de laranja doce

 

Vagner Augusto Benedito1,4; Francisco de Assis Alves Mourão Filho2,5*; Beatriz Madalena Januzzi Mendes3,5
1Pós-Graduando do Depto. de Produção Vegetal - USP/ESALQ.
2Depto. de Produção Vegetal - USP/ESALQ, C.P. 9 - CEP: 13418-900 - Piracicaba, SP.
3Laboratório de Biotecnologia Vegetal - USP/CENA, C.P. 96 - CEP: 13400-970 - Piracicaba, SP.
4Bolsista CAPES.
5Bolsista CNPq.
*Autor correspondente <famourao@carpa.ciagri.usp.br>

 

 

RESUMO: Com o objetivo de produzir calos embriogênicos de citros, óvulos abortados de frutos maduros de 6 variedades de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck), ‘Bahia Cabula’, ‘Baianinha’, ‘Hamlin’, ‘Orvalho de Mel’, ‘Rubi’ e ‘Valência’ foram introduzidos em meio de cultivo MT modificado com adição de extrato de malte, com e sem adição de 5 mg L-1 benziladenina (BA). Os calos obtidos das variedades ‘Bahia Cabula’, ‘Orvalho de Mel’, ‘Rubi’ e ‘Valência’ foram cultivados em meio basal MT, contendo os carboidratos maltose, galactose, lactose, glicose ou sacarose nas concentrações de 18; 37; 75; 110 e 150 mM para a indução da embriogênese somática. Os calos destas mesmas variedades foram submetidos ao isolamento de protoplastos, com o uso de 3 soluções enzimáticas. Os resultados revelaram que há influência do genótipo sobre a calogênese. A embriogênese somática foi estimulada na presença de galactose, para a maioria das variedades. A solução enzimática composta de 1% de celulase, 1% de macerase e 0,2% de pectoliase foi a mais adequada para o isolamento de protoplastos a partir de calos das variedades de laranja doce estudadas.
Palavras-chave: Citrus sinensis, cultura de tecido, melhoramento vegetal

 

Callus induction, somatic embryogenesis and protoplast isolation from sweet orange varieties

ABSTRACT: Intending to produce embryogenic citrus calli (Citrus sinensis L. Osbeck), aborted ovules of ripe fruits from six sweet orange varieties (‘Bahia Cabula’, ‘Baianinha’, ‘Hamlin’, ‘Orvalho de Mel’, ‘Rubi’ and ‘Valencia’) were introduced onto modified MT medium with and without benzyladenine (BA). Calli obtained from ‘Bahia Cabula’, ‘Orvalho de Mel’, ‘Rubi’ and ‘Valencia’ varieties were grown on MT basal medium modified with the carbohydrates maltose, galactose, lactose, glucose and sucrose at 18; 37; 75; 110 and 150 mM. The effect on somatic embryogenesis was studied. Calli from the same genotypes were submitted to protoplast isolation, using three different enzymatic solutions. Results revealed the genotype effect in the callus induction. Somatic embryogenesis was stimulated in the presence of galactose, for most varieties. Enzymatic solution composed of 1% cellulase, 1% macerase and 0,2% pectolyase was the best for protoplast isolation from calli of all genotypes tested.
Key words: Citrus sinensis, tissue culture, cultivar improvement

 

 

INTRODUÇÃO

O Brasil é o principal produtor de frutas cítricas do mundo, perfazendo 23,7% da produção mundial, com mais de 24 milhões de toneladas de citros. Cerca de 95% da produção brasileira de citros está baseada em variedades de laranja doce, especialmente para o processamento industrial (FAO, 1999; Nonino, 1995; FNP Consultoria & Comércio, 1999).

Apesar da hegemonia brasileira na produção cítrica mundial, há vários fatores que impedem aumento na produtividade da cultura, como a susceptibilidade das variedades utilizadas a diversas doenças, pragas e anormalidades fisiológicas, a exemplo de cancro cítrico, clorose variegada dos citros, declínio dos citros, pinta-preta, leprose e, ainda, baixa adaptação às condições edafoclimáticas (Fundecitrus, 1999; Domingues, 1997).

O melhoramento genético é imprescindível para a transposição destas adversidades e deve ser utilizado para a manutenção da liderança brasileira na produção mundial. Entretanto, o melhoramento convencional têm sido limitado devido a fatores inerentes à biologia dos citros, como alta heterozigose, longo período juvenil, esterilidade do grão de pólen, incompatibilidade sexual e poliembrionia nucelar (Grosser & Gmitter Junior, 1990; Ling et al., 1989; Vardi & Galun, 1989). A fusão de protoplastos constitui-se em nova e viável alternativa no melhoramento de citros, produzindo híbridos somáticos potencialmente capazes de gerar variedades superiores, especialmente por produzir plantas tetraplóides, sem segregação genética (Gmitter Junior et al., 1992).

A calogênese das espécies cítricas em cultivo in vitro pode ocorrer a partir de diversos tecidos, como óvulos (abortados, não fertilizados, inteiros fertilizados) e nucelos, sendo esta a fonte mais utilizada (Gmitter Junior & Moore, 1986; Sim et al., 1988; Starrantino & Russo, 1980). O meio de cultivo mais frequentemente utilizado é o MT (Murashige & Tucker, 1969), suplementado com 500 mg L-1 de extrato de malte (Lorenzo et al., 1994). A adição de reguladores de crescimento, como benziladenina (BA), cinetina, ácido indolilacético (IAA) e ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), pode beneficiar o processo (Cristofani, 1991; Vardi et al., 1982; Oliveira, 1993).

A embriogênese somática a partir de calos também é um processo crítico na regeneração de plantas e deve ser otimizada para cada variedade em estudo, especialmente em relação à fonte de carbono adicionada ao meio de cultivo (Kochba et al., 1982). O carboidrato mais utilizado em meios de cultivo, para o crescimento de calos e células em suspensão de citros, é a sacarose (145 mM) (Jumin & Nito, 1996a, 1996b), não sendo esta, necessariamente, a melhor condição para a expressão da embriogênese somática.

A hibridação somática de citros utiliza protoplas-tos isolados de suspensões celulares, de calos embriogênicos ou do mesofilo. Assim, o isolamento de protoplastos a partir de calos deve ser estudado e maximizado para cada espécie e variedade (Kunitake & Mii, 1995).

Este trabalho teve por objetivo o estudo dos procedimentos básicos para a adequação das técnicas de fusão de protoplastos, incluindo a produção de calos a partir de óvulos abortados de variedades de laranja doce, o estudo da embriogênese somática e o isolamento de protoplastos a partir destes calos.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Os experimentos foram realizados no Laboratório de Biotecnologia de Plantas Hortícolas, do Departamento de Produção Vegetal (ESALQ/USP), e no Laboratório de Biotecnologia Vegetal (CENA/USP), em Piracicaba-SP.

Calogênese: foram coletados frutos maduros de 6 variedades de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck) do Banco de Matrizes do Centro de Citricultura ‘Sylvio Moreira’ (IAC), em Cordeirópolis (SP): ‘Bahia Cabula’, ‘Baianinha’, ‘Hamlin’, ‘Orvalho de Mel’, ‘Rubi’ e ‘Valência’. Óvulos abortados foram extraídos dos frutos, colocados em solução de hipoclorito de sódio a 1%, por 20 minutos. Após a assepsia, o material foi lavado com água desmineralizada e autoclavada. O meio de cultura basal utilizado foi o MT (Murashige & Tucker, 1969), modificado com 500 mg L-1 de extrato de malte, com ou sem a adição de BA (5 mg L-1). Foram inoculados 20 óvulos por placa de Petri (100 x 15 mm) e o material foi incubado à temperatura de 27oC, em ausência de luz por um período de 28 semanas, subcultivado para meio de cultura fresco em intervalos de 4 semanas. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, no esquema fatorial 6 variedades x 2 meios de cultivo. O número de óvulos implantados variou entre os tratamentos em função da disponibilidade do material e contaminações posteriores, a saber, nos meios de cultura sem e com BA: ‘Bahia Cabula’, 100 e 120; ‘Baianinha’, 140 e 100; ‘Hamlin’, 120 e 160; ‘Orvalho de Mel’, 80 e 60; ‘Rubi’, 60 e 40 e ‘Valência’, 20 e 40 óvulos abortados. As avaliações foram realizadas após 4, 8 e 16 semanas de incubação, determinando-se o número de óvulos abortados que originaram calos friáveis. A manutenção destes calos foi realizada por subcultivos mensais, em meio de cultivo MT (Murashige & Tucker, 1969) modificado, sem adição de reguladores.

Embriogênese somática: os calos das variedades ‘Bahia Cabula’, ‘Orvalho de Mel’, ‘Rubi’ e ‘Valência’ foram incubados em meio de cultura MT (Murashige & Tucker, 1969), modificado com 500 mg L-1 de extrato de malte, contendo maltose, galactose, lactose, glicose e sacarose, nas concentrações de 18; 37; 75; 110 e 150 mM, à temperatura de 27oC, sob luz difusa (2500 lux). O delineamento experimental utilizado foi inteiramente ao acaso, com 4 repetições, sendo cada repetição constituída de uma placa de Petri (100 x 15 mm), com 50 mg de calo. A avaliação foi realizada após 4 semanas, determinando-se o número de embriões somáticos desenvolvidos, com o auxílio de microscópio esterioscópico (7,5x). Cada variedade foi analisada independentemente.

Isolamento de protoplastos: para a obtenção dos protoplastos das mesmas variedades usadas no experimento de embriogênese, foram utilizadas 3 soluções enzimáticas: 1) 1% celulase Onozuka RS (Yakult Honsha), 1% macerase R-10 (Yakult Honsha) e 0,2% pectoliase Y-23 (Seishin), dissolvidas em solução de 0,7 M manitol, 24,5 mM CaCl2.2H2O, 0,92 mM NaH2PO4 e 6,15 mM ácido 2-[N-morfolino]-etanossulfônico (MES), pH 5,6 (Grosser & Gmitter Junior, 1990), utilizando-se 2 mL desta solução por placa de isolamento, diluído em 2 mL de meio BH3 0,7M (Mourão Filho, 1995); 2) 0,2% celulase Onozuka R-10, 0,3% macerase R-10 e 0,1% driselase (Kyowa Hakko Kogyo), dissolvidas em solução com metade dos macroelementos do meio de cultura MT e 0,7 M manitol, pH 5,7, utilizando 5 mL desta solução por placa de isolamento (Kobayashi et al., 1983); 3) 1% celulase Onozuka R-10, 0,2% macerase R-10 e 0,1% driselase (D’útra-Vaz et al., 1993), dissolvidas em CPW 13M (Frearson et al., 1973) com 5 mM MES, pH 5,6, utilizando-se 10 mL da solução em cada placa de isolamento. Aproximadamente 500 mg de calo foram colocados em cada placa de isolamento (60 x 15 mm), juntamente com a solução enzimática, incubando-se por 16 horas, sob agitação orbital de 40 rpm, em ausência de luz, à temperatura de 27oC. Para purificação utilizou-se peneira de nylon (malha de 50mm) e centrifugações a 700 rpm, por 5 minutos. A avaliação foi realizada com auxílio de câmara de Neubauer, determinando-se o número de protoplastos/mL. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente ao acaso, com 3 repetições, sendo cada repetição constituída por uma placa de isolamento.

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A calogênese dos óvulos abortados não ocorreu até 8 semanas de cultivo. A TABELA 1 apresenta os dados da porcentagem de óvulos abortados, que resultaram em calos friáveis, após 16 semanas de incubação.

 

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Observa-se superioridade da variedade ‘Rubi’, que apresentou calogênese em 12,5% e 15% dos óvulos introduzidos, nos meios de cultura com e sem BA, respectivamente, enquanto em outras variedades não foi conseguido induzir calogênese em ambos os meios utilizados. A variedade ‘Baianinha’ e a ‘Orvalho de Mel’ não apresentaram formação de calos em meio de cultivo com BA e a ‘Valência’ não apresentou formação de calos em meio de cultivo sem BA.

Outros autores também constataram o efeito do genótipo sobre a resposta à indução da calogênese. Mendes-da-Glória (1998), trabalhando com diversas variedades de citros, não obteve formação de calos nas variedades ‘Natal’ e ‘Pêra’, enquanto as variedades ‘Serra d’água’ e ‘Valência’ foram menos responsivas em relação às variedades de tangerinas ‘Cravo’ e ‘Ponkan’ e tangor ‘Murcote’ estudadas no experimento, que chegaram a mais de 40% de resposta. Oliveira et al. (1994) também observaram o efeito do genótipo na calogênese em tangerina ‘Cleópatra’, limão ‘Cravo’ e Poncirus trifoliata, obtendo 48,8% de resposta para a primeira variedade, sem conseguir sucesso, no entanto, com trifoliata. Mourão Filho & Grosser (1992), ao trabalhar com 30 seleções de citros, incluindo espécies relacionadas, constataram que a resposta foi variável, desde genótipos que não produziram calos, como Clausena, até outros que produziram calos friáveis de rápida proliferação, como o limão ‘Rugoso’. Outra constatação neste mesmo trabalho foi a influência do meio de indução sobre a calogênese. O limão ‘Rugoso’ apresentou calos friáveis em meio de cultura com 2,4-D e cinetina, enquanto em meio de cultura com cinetina e NAA apresentou calos duros. Oliveira et al. (1994) observaram que nucelos de tangerina ‘Cleópatra’ em meio de cultura com IAA e cinetina responderam em 78,8%, enquanto a mesma variedade, em meio com BA resultou em 16,3% de resposta. Tangerinas ‘Cleópatra’ e ‘Sunki’ clone "CNPMF 02" e laranja ‘Hamlin’ clone "20" apresentaram 34,6; 30,7 e 23,5% de formação de calos embriogênicos, respectivamente, em meio MT com 500 mg L-1 de extrato de malte e 10 mg L-1 de BA (Zanol et al., 1997). Entretanto, no mesmo trabalho, não se obteve resultado na indução à calogênese com limão ‘Cravo’ clone "Santa Bárbara", limão ‘Volkameriano’, limão ‘Rugoso Mazoe’, laranja ‘Hamlin’ clone 04, laranja azeda, Poncirus trifoliata seleção "Flying Dragon" e citranges ‘Carrizo’, ‘Troyer’ e ‘C-35’.

Um eficiente sistema de regeneração de plantas a partir de cultura de tecidos e células é reconhecidamente um pré-requisito para a aplicação das técnicas de bio-tecnologia no melhoramento vegetal (Litz & Gray, 1992). A embriogênese somática é reconhecida como o processo mais comum na regeneração das plantas cítricas.

Vários autores observaram que a alteração do carboidrato no meio de cultivo gera resposta na indução da embriogênese somática em citros. Button (1978) observou que a sacarose promove bom crescimento de calos cítricos, entretanto, Kochba et al. (1982) relataram que este carboidrato não estimulou a embriogênese somática, enquanto a galactose e a lactose foram os que mais estimularam o processo. Mendes-da-Glória (1998), ao trabalhar com calos cítricos oriundos de fusão de protoplastos, concluiu que a maltose foi o melhor carboidrato para a indução da embriogênese somática, sendo este efeito mais intenso em algumas combinações que em outras. Ben-Hayyim & Neumann (1983) e Vu et al. (1993) relatam que a embriogênese somática pode ser estimulada quando a sacarose é substituída por glicerol no meio de cultivo.

O presente experimento explorou o potencial embriogênico dos calos das variedades ‘Bahia Cabula’, ‘Orvalho de Mel’, ‘Rubi’ e ‘Valência’ em relação a diversos carboidratos (TABELA 2). Verificam-se diferenças na resposta à indução de formação de embriões entre as variedades de citros. Enquanto as variedades ‘Bahia Cabula’ e ‘Rubi’ chegaram a produzir de 1887 e 2077 embriões por 50 mg de calo, ‘Valência’ e ‘Orvalho de Mel’ apresentaram 738 e 621 embriões para mesma massa de calo, respectivamente. Ainda, os dados apontam para a galactose como responsável pelas melhores respostas, embora a sua melhor concentração seja diferente para cada variedade em estudo. Este carboidrato, nas suas doses mais baixas, foi o que apresentou os melhores resultados, com exceção da ‘Valência’, que teve seu pico a 150 mM. A glicose foi o segundo carboidrato que melhor estimulou a embriogênese somática, resultando no maior número de embriões, depois da galactose, para todas as variedades. Os bons resultados de estímulo à embriogênese obtidos com lactose e maltose por Kochba et al. (1982) e Mendes-da-Glória (1998), respectivamente, não foram observados para as variedades estudadas, fortalecendo a afirmação de que existem diferenças na resposta ao estímulo embriogênico aos diversos carboidratos entre as espécies e variedades de citros (Vardi et al., 1982).

 

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Entre as hipóteses para explicar o efeito da galactose no estímulo à embriogênese somática e ao desenvolvimento ontogenético do embrião tem-se que este carboidrato poderia inibir a biossíntese de auxina ou o seu transporte (Anker, 1974; Yamamoto et al., 1988; Krul & Colclasure, 1977), inibindo, assim, a embriogênese somática em Citrus pela modificação do balanço endógeno da auxina. Reforçando esta hipótese, Epstein et al. (1977) observou que ocorre acúmulo de auxinas conjugadas com aspartato em células embriogênicas de laranja doce, o que não acontece com as não embriogênicas. A galactose estimulou a biossíntese de etileno em trabalhos feitos por Colclasure & Yopp (1976), especialmente em sinergismo com auxinas (Jongkee et al., 1987). A adição de ethephon em meios de cultura de calos de citros induziu a embriogênese somática (Kochba et al., 1978), indicando que o efeito da galactose pode ser o de estimular a biossíntese de etileno. Uma terceira hipótese para o efeito da galactose na embriogênese somática coloca este carboidrato como inibidor da síntese de UDP-glicose, um intermediário da síntese da fração não celulósica das paredes celulares (Masuda, 1990) ou da conversão da UDP-glicose a glicose-1-fosfato, pelo acúmulo de galactose-1-fosfato (Kochba et al., 1982). Em cana-de-açúcar, culturas em suspensão com galactose continham 35% mais galactose-quinase que as células em meio com sacarose, tendo, ainda, dez vezes mais UDP-galactose-4-epimerase, uma enzima-chave para a entrada da galactose na glicólise (Maretzki & Thom, 1978).

Outro passo importante nos procedimentos biotecnológicos de melhoramento de citros é a obtenção de protoplastos viáveis. Os calos de citros são, muitas vezes, recalcitrantes à digestão da parede celular, dificultando, o isolamento de protoplastos. Diversos fatores estão envolvidos neste processo, como o tipo e concentração das enzimas digestivas utilizadas, o potencial osmótico da solução de isolamento e a estrutura física da parede das células do calo em estudo. A maximização do isolamento é uma etapa fundamental na adequação das técnicas que utilizam o protoplasto como base, tal qual a hibridação somática.

Vardi & Galun (1988; 1989) relatam que as espécies de citros e as variedades de uma mesma espécie, mostram grande variação na eficiência de isolamento perante as diversas soluções enzimáticas empregadas, concluindo que uma combinação enzimática apropriada deve ser determinada para cada calo especificamente. As soluções enzimáticas relatadas para citros permitem classificá-las em dois grupos com relação ao tempo de digestão enzimática: soluções fortes, em que o isolamento de protoplastos ocorre em 4 horas (Goldman, 1988) e soluções fracas, nas quais o isolamento se dá em cerca de 16 horas (Vardi et al., 1982).

Os resultados do experimento realizado, constrastando três soluções enzimáticas, estão representados na Figura 1. Observa-se claramente que a solução enzimática descrita por Grosser & Gmitter Junior (1990) foi a melhor para todas as variedades estudadas, nas condições realizadas. As variedades que apresentaram maior rendimento no isolamento, na solução descrita por Grosser & Gmitter Junior (1990), foram a ‘Valência’ e a ‘Rubi’, com 66,25 x 104 e 52,63 x 104 protoplastos isolados a partir de 500 mg de calo (ou 1,32 x 106 e 1,05 x 106 protoplastos por grama de calo, respectivamente), enquanto a ‘Orvalho de Mel’ e a ‘Bahia Cabula’ tiveram rendimento de 23,63 x 104 e 7,88 x 104 protoplastos por 500 mg de calo (ou 0,47 x 106 e 0,16 x 106 protoplastos por grama de calo, respectivamente). Oliveira et al. (1995), ao isolar protoplastos de tangerina ‘Cleópatra’, obtiveram rendimento de 4,7 x 106 protoplastos por grama de calo, enquanto Cristofani (1991) e Goldman (1988), trabalhando com laranja ‘Pêra’, conseguiram médias de 1,43 x 106 e 1,37 x 106 por grama de calo, respectivamente. Contrastando-se estes resultados ao conseguido no presente trabalho, pode-se afirmar que, além da solução enzimática, outros fatores devem ser estudados para a maximização do isolamento de protoplastos das variedades estudadas, tais quais o subcultivo de calos em meio de cultura com menor quantidade de carboidrato e pré-tratamento enzimático, ambos propostos por Oliveira et al. (1995).

 

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CONCLUSÕES

Os resultados obtidos neste trabalho permitem afirmar:

  • A calogênese é altamente influenciada pelo genótipo em laranja doce;

  • A embriogênese somática, para a maioria das variedades, tem tendência de ser mais responsiva à indução pela galactose;

  • A solução enzimática composta por 1% celulase, 1% macerase e 0,2% pectoliase é a mais adequada para todas as variedades estudadas, mostrando-se a mais apropriada para o isolamento das variedades de laranja doce.

 

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem o auxílio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa no Estado de São Paulo (FAPESP) e à disponibilidade da Profa. Dra. Adriana P. M. Rodriguez, do CENA/USP, durante a realização do trabalho.

 

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Recebido em 31.05.99

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