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Revista Brasileira de Engenharia Biomédica

versión ISSN 1517-3151

Rev. Bras. Eng. Bioméd. vol.28 no.3 Rio de Janeiro jul./set. 2012

https://doi.org/10.4322/rbeb.2012.029 

ARTIGO DE REVISÃO

 

Optogenética e estimulação óptica neural: estado atual e perspectivas

 

Optogenetics and neural optical stimulation: current state and perspectives

 

 

Eddy KruegerI,*; Tiago ManczakI; Edwing Martin Holguin WilsonII; Wilson José da SilvaIII; Percy NohamaIV

ILaboratório de Engenharia de Reabilitação, Pós-graduação em Engenharia Elétrica e Informática Industrial – CPGEI, Universidade Tecnológica Federal do Paraná – UTFPR, Curitiba, PR, Brasil
IIInstituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil
IIIPós-graduação em Engenharia Elétrica e Informática Industrial – CPGEI, Universidade Tecnológica Federal do Paraná – UTFPR, Curitiba, PR, Brasil
IVLaboratório de Engenharia de Reabilitação, Pós-graduação em Engenharia Elétrica e Informática Industrial – CPGEI, Universidade Tecnológica Federal do Paraná – UTFPR, Curitiba, PR, Brasil. Laboratório de Engenharia de Reabilitação, Pontifícia Universidade Católica do Paraná – PUCPR, Curitiba, PR, Brasil

 

 

 


RESUMO

Ao longo dos últimos 50 anos, o uso da luz, em especial o laser, vem promovendo grandes avanços em diversas áreas da ciência e da tecnologia. Na última década o uso de estímulos ópticos no campo da biomédica tem despertado grande interesse no meio acadêmico e na indústria. Dois ramos que se destacam pelo seu crescimento são: a estimulação óptica direta e a optogenética. A primeira utiliza diferentes parâmetros da luz para adequar o efeito desejado na interação com o tecido biológico. A segunda faz uso de engenharia genética para tornar os tecidos biológicos sensíveis à luz. A estimulação neural por infravermelho (estimulação óptica direta) não necessita de contato direto com o tecido e apresenta maior seletividade especial se comparada à estimulação elétrica, mas tem a capacidade restrita de ativar (despolarizar) os neurônios. A optogenética, entretanto, pode ser utilizada para manipular o tecido neural tornando-o sensível à luz; sendo, então, possível despolarizar ou hiperpolarizar os neurônios codificados, assim como monitorar as ativações por meio de codificação de proteínas fluorescentes sensíveis à tensão elétrica. Tanto a técnica de estimulação óptica por infravermelho ou a técnica de optogenética, vêm sendo aplicadas apenas à modelos animais. Os resultados mostram, entretanto, que há grande viabilidade de aplicação da estimulação óptica em seres humanos. Futuramente, tais técnicas poderão substituir o atual padrão ouro para a ativação neural, a estimulação elétrica, em aplicações envolvendo doenças neurológicas específicas.

Palavras-chave: Optogenética, Estimulação óptica neural, Fotoreceptores.


ABSTRACT

Within the last 50 years the light and specially the laser has fomented great advances in several areas of science and technology. During the past decade the use of optical stimuli in the biomedical research field have been of great interest for both academy and industry. Two research branches that can be highlighted due to its growth are: direct optical stimulation and optogenetic. The first one uses different parameters of light to optimize the desired effect on the tissue interaction. The other branch works with genetic engineering technics to make cells sensitive to light. The neural stimulation by infrared (direct optical stimulation) does not require direct contact with the tissue and has higher spatial selectivity when compared to electrical stimulation, but it has restricted ability to activate (depolarize) neurons. The optogenetic, however, can be used to manipulate the neural tissue depolarizing or hyperpolarizing encoded neurons, as well as monitor activations by encoding fluorescent proteins sensitive to voltage. The stimulation by infrared optical or optogenetic, has been applied only to animal models although there is a great possibility for human applications. In the future, it may even replace existing techniques such as electrical brain stimulation to treat specific neurological diseases.

Keywords: Optogenetic, Optical stimulation of neural tissue, Photoreceptors.


 

 

Introdução

A utilização de tecnologia óptica é muito ampla e bem difundida na atualidade. O laser, por exemplo, causa diferentes alterações fotoquímicas, fototérmicas e fotomecânicas (Wells et al., 2007a) em tecidos biológicos conforme a variação de suas características (intensidade, tempo de aplicação, comprimento de onda). Ao longo dos anos, o laser popularizou-se tendo hoje inúmeras aplicações médicas e cirúrgicas em oftalmologia, odontologia, ginecologia, urologia, neurocirurgia, angioplastia e cardiologia, dermatologia, ortopedia, gastroenterologia, otorrinolaringologia e pneumologia (Niemz, 2004); além do uso em fisioterapia, como o laser HeNe (630 nm) na dermatologia (Ling e Wu, 2005), do laser GaAs (904 nm) na ortopedia (Naeser et al., 2002) e o laser AlGaInP (685 nm) em pontos de acupuntura (Valchinov e Pallikarakis, 2005).

Pesquisas recentes mostram duas novas aplicações de interação entre luz e tecidos biológicos, mais especificamente tecido neuronal. A primeira é a estimulação óptica, na qual um feixe de luz, geralmente na faixa do infravermelho (comprimento de onda > 770 nm) (Cayce et al., 2010a; Duke et al., 2009; Harris et al., 2009; Izzo et al., 2006a, 2006b; Izzo et al., 2007; Wells et al., 2007b; Wininger et al., 2009) é aplicado diretamente ao neurônio deflagrando, assim, um potencial de ação (PA). O uso de estimulação óptica estende-se à fabricação de próteses especiais como implante coclear (Izzo et al., 2006a; Richter et al., 2008), visual (Kim et al., 2004), vestibular (Harris et al., 2009), e estimulação encefálica profunda (Cayce et al., 2010b).

Outra técnica para promover a interação entre neurônios e luz é a optogenética, que está embasada na introdução de um vírus no tecido nervoso com o DNA modificado (Liu e Tonegawa, 2010; Zhang et al., 2010). O vírus contém rodopsinas, proteínas presentes em fotorreceptores da retina que podem também ser extraídas de microalgas e eubactérias. Com essas proteínas, é possível manipular funções de células como os neurônios (Hegemann e Möglich, 2010), tornando-os sensíveis à luz para uma faixa compreendida entre 470 a 960 nm (Andrasfalvy et al., 2010; Carter et al., 2010; Goold e Nicoll, 2010; Gunaydin et al., 2010; Kravitz et al., 2010) ou fazendo com que emitam luz em um comprimento de onda (λ) igual a 360 nm (Kötter et al., 2005).

 

Materiais e Métodos

A busca de informações foi realizada nas bases Wiley Online Library, ScienceDirect, Scielo, Biomed Central, Google Scholar, IEEE Xplorer, IOP e livros. O idioma de preferência selecionado foi o inglês com as Palavras-chave: optogenetic, optical stimulation, infrared neural stimulation e photoreceptors. Seguindo o método retrospectivo, efetuou-se a procura de trabalhos com uma janela de tempo de 1979 a 2011. Foram descartados os trabalhos que não estavam de acordo com o escopo do artigo. Após a realização da busca nas bases de dados, foram lidos os abstracts e eliminadas as duplicações. Dos trabalhos selecionados, foram extraídas informações a respeito dos seguintes tópicos: optogenética e estimulação óptica neural.

 

Resultados

Todos os trabalhos selecionados versavam sobre: optogenética, estimulação neural óptica e assuntos afins, como fotoreceptor, potencial de ação, neuroanatomia, dentre outros. A Tabela 1 mostra os trabalhos utilizados e suas respectivas bases de pesquisa. A Tabela 2 mostra os artigos e livros divididos por ano.

 

 

Discussão

Optogenética

O termo optogenética (do inglês optogenetic) foi cunhado por Deisseroth et al. (2006) para se referir às proteínas codificadas que respondem à luz para monitorar e controlar a atividade específica de circuitos neurais. Os fotorreceptores, amplamente utilizados na optogenética e também presentes na retina, são receptores neurais especiais que respondem à absorção de luz com uma mudança na atividade biológica como o potencial da membrana do neurônio (Möglich e Moffat, 2010). Esses fotorreceptores são formados por rodopsinas, proteínas contendo sempre dois terminais polares, basicamente um grupamento amina (NH2) e outro carboxila (COOH) (Hegemann e Möglich, 2010). Quando fótons incidem nos fotorreceptores localizados na retina, reações bioquímicas alteram o potencial elétrico da membrana celular. O bastonete, quando incidido por um fóton, transforma o 11-cis retinal (proveniente da rodopsina) (Kraft et al., 1993) em all-trans retinal, com uma reação em cascata proporcionada pela proteina G (guanosina trifosfato) (Hubbell e Bownds, 1979) no meio intracelular. Assim, ocorre a inibição dos canais de cátions da membrana, gerando hiperpolarização devido à diminuição da condutância dos íons de Na+ e Ca++ (Baylor, 1996).

Os fotorreceptores de canais de rodopsina foram isolados primeiramente do organismo marinho flagellate algae (Möglich e Moffat, 2010). Genes de opsina podem ser introduzidos no tecido neural utilizando-se vetores virais (Zhang et al., 2010), os quais tornam canais de cátions, sódio e potássio (Mutoh et al., 2010), de neurônios sensíveis à luz podendo responder com alteração no potencial da membrana quando incididos por luz (Mutoh et al., 2010). A modificação gênica (Liu e Tonegawa, 2010) é realizada pela enzima Cre-recombinase (Gradinaru et al., 2010), sendo a despolarização da membrana celular decorrente da codificação dos genes microbianos de opsina (Hegemann e Möglich, 2010). A Figura 1 mostra os microorganismos utilizados para codificar os canais iônicos que respondem ao estímulo luminoso. O canal iônico codificado channelrhodopsin-2 (ChR2), como mostra a Figura 2, provém do microorganismo Chlamydomonas Reinhardtii. O channelrhodopsin-1 (VChR1) (Hegemann e Möglich, 2010) provém da Volvox Carteri e o canal halorhodopsin (NpHR) (Gradinaru et al., 2010) da estrutura microbiana Natronomonas Pharaonis.

 

 

Os canais codificados ChR2 e o canal VChR1 respondem ao estímulo luminoso, como mostra a Figura 3, com a abertura dos canais de cátions da membrana despolarizando-a (Hegemann e Möglich, 2010). O canal NpHR ativa a entrada de ânions na membrana gerando á hiperpolarização do meio intra celular (Gradinaru et al., 2010). O ChR2 tem sua ativação maximizada pela luz azul cujo comprimento de onda (λ) é 470 nm (Zhang et al., 2010) e o canal VChR1 pela luz amarela (λ próximo de 590 nm) (Mancuso et al., 2011). As faixas de comprimento de onda que respondem aos canais iônicos codificados (Zhang et al., 2010) ChR2, VchR1 e NpHR são mostrados na Figura 4.

 

 

 

 

Andrasfalvy et al. (2010) identificaram os parâmetros ótimos para a excitação focal de ChR2 a dois fótons. Desses parâmetros, destacam-se o comprimento de onda para uma faixa de 800 nm < λ < 960 nm, para uma potência (P) compreendida entre 0 < P < 400 mW. O pico de absorção para apenas dois fótons foi encontrado para λ igual a 880 nm. Em relação à potência, foi verificada uma relação não linear com o tempo de despolarização da célula, apresentando acima de 300 mW pouca variação (< 2 ms) com o aumento de potência. Aumentando a duração do pulso sobre neurônios inibitórios (canais NpHR), não há um valor diferenciado do potencial de membrana hiperpolarizada (Andrasfalvy et al., 2010), pois a célula obedece à lei do efeito tudo ou nada (Bean, 2007).

Os canais de íons ChR2 tem uma constante de desativação de ~12 ms, e os canais de VChR1 tem uma constante de desativação de ~120 ms (Zhang et al., 2010). Receptores conseguem transmutar sinais de flashes luminosos na faixa de milissegundos (~12 ms a ~120 ms), para uma frequência de ativação (Fatv) compreendida entre 30 e 50 Hz (Zhang et al., 2010). Algumas células com canais ChR2 podem apresentar certas anomalias na resposta à luz como a não produção de potenciais evocados à frequências de estímulo acima de 40 Hz, além de apresentarem a frequências mais baixas uma espícula extra para cada pulso individual (Gunaydin et al., 2010). Entretanto, novos receptores vêm sendo desenvolvidos e aperfeiçoados para a optogenética (Liu e Tonegawa, 2010). Gunaydin et al. (2010) codificaram o gene de opsina ChETA para trabalhar com frequências que atinjam até 200 Hz, faixa de trabalho cinco vezes maior que os canais ChR2.

A optogenética pode ser utilizada na manipulação de mensageiros intracelulares secundários como a adenosina monofosfato cíclico (cAMP) e da Guanosina monofosfato cíclico (cGMP) (Ryu et al., 2010). Teh et al. (2010) desenvolveram o fotossensibilizador KillerRed que, exposta à luz branca ou a verde, estimula fortemente a interação bioquímica do oxigênio. Em baixos níveis, a ativação do oxigênio pode promover a mitose, mas em altos níveis provoca apoptose (morte celular). A utilização do KillerRed estende-se à simulação de patologias cardíacas, com a perspectiva de aplicação em tecido neoplásico (canceroso).

A optogenética é viável ainda para a estimulação da plasticidade neural, que envolve os sistemas de aprendizado e memória nas regiões cornos de Amon (CA) 1 e 3 do hipocampo (Gradinaru et al., 2010), com enorme viabilidade para futuras aplicações médicas (Fiala et al., 2010). A aplicabilidade da optogenética pode se estender à monitorização da atividade celular (movimentação de Ca++) dos astrócitos (Figueiredo et al., 2011), que são células do tecido conjuntivo (neuroglias) do sistema nervoso central e periférico (Haines, 2008; Machado, 2006). Como ilustrado na Figura 5, a optogenética ativa/inibe o neurônio com os canais codificados e consequentemente despolariza ou hiperpolariza os neurônios com os quais faz conexão, como se o neurônio fosse ativado/inibido fisiologicamente (Palmer, 2010).

 

 

Desenvolvimentos recentes na optogenética estão abrindo novas possibilidades para o campo da neurociência (Fiala et al., 2010; Zhang et al., 2010). Pesquisadores como Mutoh et al. (2010) vem trabalhando no ultimo decênio em cultura celular e em modelos animais com biosensores por meio de modificação gênica em proteínas fluorescentes sensíveis à tensão elétrica (do inglês voltage sensitive fluorescent proteins (VSFPs)). Quando o neurônio modificado gera uma sinapse, o mesmo responde com um estimulo luminoso. Para a Produção das VSFPs, são utilizadas modificações das proteínas de animais marinhos como a ascídia (Ciona intestinalis) e da água-viva (Aequorea Victoria) (Mutoh et al., 2010). As VSFPs tendem a ser monocromáticas como mostra a Figura 6, respondendo a um comprimento de onda de luz específico entre o vermelho e o azul.

 

 

Pode-se codificar neurônios com a ChR2 (que responde com a despolarização) e/ou com a NpHR (que responde com a hiperpolarização) e codificar neurônios adjacentes com VSFPs, assim, um estímulo pós sináptico pode ser expresso por um sinal luminoso (Mancuso et al., 2010) como mostra a Figura 7. Lee et al. (2010) aplicaram laser azul (comprimento de onda igual a 473 nm) a 20 Hz (duração do pulso 15 ms) no tálamo motor, onde foi evidenciada a ativação do córtex motor de ratos adultos, tendo sido o vírus implantado no córtex motor. Esses resultados mostram que utilizando as técnicas da optogenética é possível alterar as codificações das vias neurais, viabilizando a identificação de vias encefálicas.

 

 

A técnica de ressonância magnética funcional BOLD (Blood oxygenation level dependent, dependente do nível de oxigênio no sangue) avalia a atividade neural (Lee et al., 2010). Mesmo sendo aplicada em modelo animal, a ressonância magnética com BOLD, em conjunto com a técnica de optogenética, mostra-se futuramente possível para determinação de mapas neurais em humanos (Palmer, 2010). As vias tálamo-corticais e cortiço-talâmicas são entrelaçadas, o que torna difícil o estudo das suas conexões. A optogenética aplicada a essas vias viabiliza seu estudo isolado (Cruikshank et al., 2010).

Kravitz et al. (2010) estudaram estimulações direta e indireta das células espinhosas médias dos gânglios basais (estriato) de ratos com Parkinson e com alteração transgênica dos receptores de dopamina D1 e D2. Realizaram a expressão viral de ChR2 nos receptores e utilizaram um laser com comprimento de onda de 473 nm e 1 mW de potência. Durante a estimulação óptica, os receptores de dopamina tipo D1 sofreram aumento da frequência de despolarização, de 0,03 para 1,16 Hz. Já os receptores D2 sofreram incremento na frequência, de 0,06 para 0,76 Hz. Os resultados mostraram que a excitação bilateral das vias indiretas das células espinhosas médias gera bradicinesia e paralisação. Do contrário, a estimulação em vias diretas da célula espinhosa média, reduz a paralisação e aumenta a locomoção.

A ativação das vias dopaminérgicas D1 e D2 que formam projeções presentes no núcleo accumbens (localizado no lobo frontal), centro de recompensa durante o uso de cocaína, ainda são superficialmente conhecidos. Lobo et al. (2010) avaliaram o efeito a estimulação óptica e optogenética com codificação dos receptores dopaminérgicos D1 e D2 sobre a ausência do TrkB (receptor do brain-derived neurotrophic factor). Utilizou-se um feixe de luz azul (λ igual a 473 nm) com frequências de 1, 1,4 e 10 Hz e pulsos com duração de 200 ms e 1 s. Os resultados mostraram que a ativação do receptor D2 suprimiu o sistema de recompensa da cocaína e efeitos contrários foram encontrados com a ativação do receptor D1.

Arrenberg et al. (2010) testaram a viabilidade de um marca-passo cardíaco por meio de controle optogenético. Realizaram alteração gênica de NpHR e ChR2 em células do miocárdio de peixes zebras. Os pesquisadores conseguiram simular: (1) taquicardia, (2) bradicardia, (3) bloqueio atrioventricular e parada cardíaca, tornando promissora a futura aplicação de optogenética em marca-passo cardíaco.

O locus coeruleos é uma estrutura noradrenérgica localizada no tronco cerebral com função de coordenar os estados de vigília e alerta (Saper et al., 2005). Carter et al. (2010) avaliaram, por meio de optogenética, a resposta do locus coeruleos de ratos ao estímulo óptico. Os neurônios do locus coeruleos foram modificados com o (I) ChR2 (excitatório) que responde à cor azul, e (II) NpHR, que é uma bomba de cloreto (inibitório), sensível a cor amarela. Foram utilizados dois lasers para o experimento: um (I) laser de cor azul (comprimento de onda igual a 473 nm) com 20 mW potência, com função estimulatória e um (II) laser de cor amarela (593 nm) com efeito inibitório (hiperpolarização dos neurônios). Foram utilizadas as técnicas de medição de eletroencefalografia (EEG) e eletromiografia (EMG) da musculatura do pescoço. A fotoinibição do locus coeruleos causa a redução da duração de vigília. A fotoestimulação do locus coeruleos causa mudança do estado de sono para vigília, imediatamente após a estimulação no período de sono não REM, e alguns segundos após o início da estimulação no estágio de sono REM. Os resultados mostraram que com 1 h de aplicação contínua, o laser azul (estimulatório) aumentava-se a duração do período de vigília. Entretanto, frequências acima de 5 Hz causaram estado de paralisação temporária do movimento, assemelhando-se à cataplexia, registrado pela EMG, que cessava apenas 15-20 s após a interrupção do estímulo (Carter et al., 2010).

O deslocamento do globo ocular com o objetivo de redirecionar a fixação visual de um objeto qualquer é denominado de sacada (Costa, 2007). Por meio da optogenética, Schoonheim et al. (2010) conseguiram localizar o centro neural do movimento de sacada no tronco cerebral de larvas de peixe zebra (Danio Rerio). Recentemente, Leifer et al. (2011) estudaram o circuito motor e mecano-sensorial de vermes (Caenorhabditis elegans) também com técnicas da optogenética. Foram utilizados os canais ChR2 (estimulatório) e NpHR (inibitório) com comprimentos de onda (λ) de 473 nm (azul) e 532 nm (amarelo), respectivamente. Goold e Nicoll (2010), aplicaram optogenética a cultura de neurônios piramidais de ratos envolvidos na formação da memória da área CA1 do hipocampo. Os canais codificados foram os receptores do neurotransmissor glutamato AMPA e NMDA. Foi utilizado diodo operando com um comprimento de onda igual a 470 nm e uma potência de 195 mW, aplicada em uma área de 1.963 mm2, onde o estudo mostrou a viabilidade do uso em neurônios piramidais.

Paralikar et al. (2010) desenvolveram um protótipo de estimulador óptico para optogenética implantável, com configurações ajustáveis no comprimento de onda em 473 nm e 535 nm, ativador do ChR2 e inibidor do NpHR, respectivamente. A densidade de potência de saída pode ser regulada em até 5,3 mW/cm2, para cada um dos dois canais independentemente. A frequência pode ser ajustada entre 0,153 e 200 Hz, e a duração do pulso ajustada de 100 µs à períodos acima de 10 ms. Im et al. (2011) projetaram e desenvolveram uma sonda neural com aplicação em optogenética como mostra a Figura 8. Possibilitando estimulação com luz azul e amarela, com potência de saída de até 50 µW, intensidade suficiente para despolarizar/inibir regiões neurais codificadas com optogenética.

 

 

Iwai et al. (2011) desenvolveram um dispositivo de baixo custo, pequeno, acionado por LED para estimulação óptica dos neurônios corticais de ratos e proporciona movimentação livre por ser controlado com tecnologia sem fio. O dispositivo é facilmente montado sobre a cabeça de um rato com um bloco de polímero e opera com uma tensão de 5 V - 6 V. Zhang et al. (2009), como mostra a Figura 9, desenvolveram uma matriz de cem elementos, onde um era a sonda óptica e os outros eletrodos de medição eletrofisiológica, com a capacidade de aplicar a estimulação óptica e gravar os sinais neurais sem gerar interferência no sinal captado, o que ocorre quando o estímulo utilizado é elétrico.

 

 

Estimulação óptica neural

A utilização de laser na faixa do infravermelho de baixa intensidade (Wells et al., 2005) sobre o tecido neural com o objetivo de deflagrar potenciais de ação denomina-se estimulação neural por infravermelho, do inglês infrared neural stimulation (Cayce et al., 2010b). Ao contrário da estimulação elétrica funcional, a estimulação neural por infravermelho não necessita do contato direto de eletrodos com o tecido e é muito seletiva a feixes nervosos dentro do nervo (Duke et al., 2009; Izzo et al., 2006b).

O estimulador neural por infravermelho comercial com aplicações não humanas Capella (modelo R 1850), da marca Aculight®, como mostra a Figura 10, apresenta uma profundidade de aplicação de 300 a 600 mm, necessitando que sua sonda esteja muito próxima ou adjacente ao tecido nervoso (Aculight, 2010). A estimulação óptica aplicada a 300 mm do modíolo (estrutura óssea da cóclea) reduz em aproximadamente 68% a amplitude dos potenciais de ação compostos do nervo auditivo comparado quando ele está totalmente em contato (Izzo et al., 2006b). Em ratos com o nervo ciático exposto, a estimulação é realizada a aproximadamente 700 mm da superfície do nervo (Duke et al., 2009). A Tabela 3 mostra os parâmetros utilizados nesse tipo de aplicação entre os anos de 2006 a 2010.

Da mesma forma que na estimulação elétrica, na EO, quanto maior a frequência, menor a amplitude necessária para despolarizar um neurônio (Cayce et al., 2010b). Wells et al. (2007b) estudaram a aplicação de EO com laser de YAG (Y3Al5O12) em nervos periféricos com testes histológicos para avaliarem as alterações ocorridas. Segundo Wells et al. (2007b), a frequência de pulsos desse laser para estimulação segura está limitada em aproximadamente 5 Hz. Nessa faixa não foram observadas lesões tissulares em nervos periféricos (nervos femorais, fibulares e tibiais de ratos) como flictenas (bolhas) e edema. Além disso, radiações de EO entre 0,66 – 0,70 J/cm2 apresentam probabilidade menor que 1% de ocasionarem danos térmicos (Wells et al., 2007b) já em intensidades acima de 50 J/cm2 causam desidratação do tecido nervoso (Wells et al., 2007a). Ainda conforme Wells et al. (2007a), para comprimentos de onda (λ) entre 2,1 a 1,87 µm (infra-vermelho), o limiar de despolarização da célula nervosa (0,3 – 0,4 J/cm2) é aproximadamente 2,5 vezes menor que a intensidade lesiva ao tecido (0,8 – 1,0 J/cm2).

Uma das vantagens da EO é a garantia de seletividade das estruturas estimuladas, como quando aplicada sobre o nervo auditivo em implantes cocleares (Izzo et al., 2006b), além do uso para futuros implantes visuais (Kim et al., 2004). Richter et al. (2008) aplicaram EO sobre feixes do nervo auditivo em surdez aguda e crônica de ratos Gerbil (Meriones unguiculatus). Os resultados foram positivos em ambos os estágios de surdez; entretanto, o limiar de despolarização foi maior na surdez crônica, necessitando de uma intensidade maior para gerar um potencial evocado. Izzo et al. (2006b) mostraram que a EO pode ativar o nervo auditivo de ratos adultos com respostas em 20 a 40 dB sem ocasionar dano tecidual ao nervo auditivo.

Izzo et al. (2007) utilizaram laser de diodo sobre o sistema auditivo (central) de ratos Gerbil (Meriones unguiculatus) para avaliar os potenciais de ação evocados pela EO. O laser foi fixado a aproximadamente 0,5 mm das células do gânglio espiral. Os resultados mostraram que os parâmetros de duração de pulso de 35 ms a uma frequência de 13 Hz mantinham a despolarização das células constante e estável. Esses resultados indicam que um laser pulsado com uma frequência acima de 10 Hz é favorável para a EO, diferenciando-se dos resultados de Wells et al. (2007b), que afirmam que uma frequência segura seria aproximadamente 5 Hz. Izzo et al. (2007) estudaram também a relação entre o comprimento de onda (λ) e a penetração óptica mantendo os demais parâmetros fixos. Os resultados demonstraram que a penetração óptica partiu de 308 mm para um (λ) de 1,88, para 1.129 mm para um (λ) de 1,84, evidenciando que quanto menor o comprimento de onda, maior a penetração do laser no tecido.

A estimulação elétrica é considerada como padrão ouro para ativação artificial do sistema nervoso central (Azoulay-Zyss et al., 2011) e periférico (Yu e Chang, 2010), mas pode estimular estruturas adjacentes resultando em artefatos indesejados. A estimulação neural por infravermelho pode ser aplicada ao sistema nervoso central sem gerar artefatos por ser pontual (Cayce et al., 2010b). Além disso, podemos citar o uso de tecnologia óptica para aquisição de imagem (como Yanai et al. (2005), que desenvolveram uma tomografia óptica com diodos laser de emissão para λ iguais a 780 nm e 830 nm) e recepção, para medir a variação de oxigênio na região cerebral.

Dentre as aplicações viáveis para a EO encontra-se a estimulação encefálica profunda (Cayce et al., 2010b). Cayce et al. (2010a) aplicaram no córtex somatossensorial (região do lobo parietal) de ratos, trens de pulsos durante 500 ms com um tempo inativo de 15 a 30 s. Comparou-se o estímulo óptico aplicado ao córtex com o estímulo mecânico (piezoelétrico) a 8 Hz aplicado à pata do animal com registro eletrofisiológico. Uma coleta de imagem por microscopia cirúrgica do córtex cerebral mostrou que a EO não gerou dano ao tecido encefálico. Os resultados mostraram que a estimulação neural por infravermelho no córtex somotassensorial causou um efeito inibitório, levando-os a concluir que implantes neurais por meio de estimulação neural por infravermelho podem ser viáveis para a concepção de próteses neurais para controle em malha fechada.

Wininger et al. (2009) estudaram em nervos ex vivo de patas de lagosta (Homarus americanus) a EO e elétrica, com registro elétrico e óptico. Utilizaram estimulação elétrica pulsada com duração de 0,2 ms em intervalos de 1-2 s, corrente de 10 µA a 2 mA e tensão de 3 V a 30 V. A EO (sonda) ficou posicionada a aproximadamente 0,75 mm da inervação. Um LED com emissão em 665 nm irradiava os feixes nervosos, enquanto um fotodiodo e polarizadores cruzados posicionados adjacentes ao tecido captavam a variação de birrefringência do LED durante a estimulação nervosa. Os resultados mostraram que foi possível reconhecer o potencial de ação por meio da birrefringência, mas que a resposta teve um atraso maior que do sinal eletrofisiológico. O sinal óptico mostrou menor interferência que o elétrico no sinal eletrofisiológico. Para Wininger et al. (2009), a combinação de EO com a gravação óptica vem a ser uma promissora ferramenta na engenharia neural, tornando futuramente desnecessário o uso de fios hoje utilizados durante gravações eletrofisiológicas.

A aplicação de EO amplia-se da utilização para implante coclear (Izzo et al., 2006a) para o uso no sistema vestibular responsável pelo equilíbrio e funções proprioceptivas (Bear et al., 2002). Como nas pesquisas de Harris et al. (2009), que ativaram o ramo vestibular do oitavo par craniano por meio de estimulação neural por infra-vermelho e compararam com a ativação por estimulação elétrica. O posicionamento dos eletrodos e do laser de diodo foi na região da ampola dos canais do labirinto. A estimulação elétrica foi bifásica com um conversor tensão-corrente entre 160 - 710 µA, para uma frequência de 100 Hz. A EO teve sua calibração com um pico de potência que fornecia até 1,26 W. As ativações ópticas e elétricas deveriam proporcionar movimentos oculares com registros. Os resultados foram negativos para a EO, na qual não se obteve os mesmos efeitos fisiológicos (movimentos oculares evocados) que com estimulação elétrica.

Alternativamente à aplicação de EO por infra-vermelho no tecido neural, Kötter et al. (2005) utilizaram EO na faixa de ultra-violeta nos neurônios piramidais da V camada do córtex de ratos para liberação do neurotransmissor glutamato enjaulado. A experiência consistia em aplicar luz de xenon sobre uma estrutura química com o ácido L-glutâmico e γ-[α-carboxi-2-nitrobenzil]-ester que após a aplicação óptica, liberava um grupo carboxi-nitrobenzil e o neurotransmissor glutamato. A ativação do flash de xenon pode influenciar na liberação de glutamato em até 200 mm do ponto de ativação, tornando o uso de ultra-violeta uma perspectiva para outros fármacos no tecido encefálico.

Teudt et al. (2007) utilizaram a estimulação por infra-vermelho no nervo facial de ratos Gerbil (Meriones unguiculatus). Foi medida a ativação dos músculos faciais: orbicular do olho, levantador do lábio superior e da asa do nariz e o músculo orbicular da boca e analisado o nível de lesão tissular causada pelo laser sobre o nervo facial e seus ramos. Histologicamente, comprovou-se danos aos feixes nervosos com uma radiação de 2,2 J/cm2, mas não ficou comprovada lesão aparente em uma intensidade de 2,0 J/cm2. Esses resultados viabilizam a EO para ativar seletivamente ramos do nervo fácil, principalmente em processo cirúrgico com o objetivo de poupar estruturas sadias da extirpação. Com o mesmo escopo de utilizar a estimulação neural por infravermelho para poupar estruturas sadias, Fried et al. (2007) fizeram uso da EO do nervo cavernoso durante cirurgia de câncer de próstata para preservar a condição sexual após a cirurgia.

 

Conclusão

A aplicação de estímulos ópticos no campo da biomedicina vem crescendo gradativamente. A estimulação neural óptica e a optogenética despontam positivamente, tanto como ferramenta de pesquisa como em aplicações clínicas.

A estimulação neural por infravermelho não necessita contato direto com o tecido, o que lhe confere uma grande vantagem em relação à estimulação elétrica, mas tem efetividade restrita ao evocar resposta nos neurônios (ativação-despolarização). Por outro lado, a seletividade do estímulo óptico é superior ao estímulo elétrico, tornando o estímulo óptico mais indicado para implantes do sistema nervoso (coclear, vestibular).

A optogenética pode ser utilizada para manipular o tecido neural despolarizando ou hiperpolarizando os neurônios codificados, além de monitorar as ativações por meio de codificação de proteínas fluorescentes sensíveis à tensão elétrica. Isso permite rastrear estímulos viabilizando a identificação de circuitos intra-cerebrais de um modo não invasivo. Além disso, é possível mapear os circuitos alterados, sendo de grande valia em avaliações e aplicações neuro-psicológicas.

A estimulação óptica por infravermelho e a optogenética são dois campos de pesquisa novos, mas em expansão, cujas pesquisas vem sendo aplicadas apenas a modelos animais. Entretanto, os resultados apresentados nos trabalhos relacionados a tais temas mostram um horizonte promissor de aplicações em seres humanos, podendo até mesmo vir a substituir métodos considerados padrão ouro (estimulação elétrica) na ativação e pesquisa de circuitos neurais.

 

Agradecimentos

Os autores agradecem à CAPES e ao CNPq pelas bolsas concedidas para a realização deste trabalho.

 

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Recebido: 18/11/2011
Aceito: 02/05/2012

 

 

*e-mail: kruegereddy@gmail.com

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