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Arquivos do Instituto Biológico

Print version ISSN 0020-3653On-line version ISSN 1808-1657

Arq. Inst. Biol. vol.82  São Paulo  2015  Epub Nov 03, 2015

https://doi.org/10.1590/1808-1657000052013 

SCIENTIFIC ARTICLE

Alterações na morfologia e na viabilidade no desenvolvimento de embriões bovinos fecundados in vitro com sêmen contaminado experimentalmente à Escherichia coli produtora da toxina Shiga stx2

Changes in morphology and viability on the development of bovine embryos in vitro fertilized with experimentally contaminated semen to Escherichia coli Shiga toxin producing stx2

Mariana Moraes Piccolomini1  * 

Ana Carolina Goes1 

Marcia Catroxo1 

Simone Miyashiro1 

Alessandra Figueiredo de Castro Nassar1 

Magali D'Angelo1 

1Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Animal; Instituto Biológico - São Paulo (SP), Brasil.


RESUMO:

O objetivo deste trabalho foi avaliar, por meio de micros- copia óptica e eletrônica de transmissão, as alterações na morfologia e a viabilidade do desenvolvimento de embriões bovinos fecundados com sêmen contaminado experimentalmente à Escherichia coli produtora da toxina shiga stx2 (STEC). Para tanto, oócitos foram aspirados de ovários de vacas abatidas e selecionados para maturação in vitro. Após 20-24 horas de maturação, os oócitos foram divididos em 2 grupos. Sendo o primeiro grupo o controle (n = 418), fertilizado com sêmen testado e sem nenhum tipo de contaminante e o segundo, o grupo contaminado (n = 415), fertilizado com sêmen exposto a STEC. Cada sêmen foi tra tado pela técnica de gradiente descontínuo de Percoll. Após o período de fecundação, os embriões foram avaliados quanto a sua morfologia e viabilidade, com o auxílio da microscopia óptica e eletrônica. Na ava liação morfológica, os oócitos fecundados com o sêmen contaminado apresentaram retração citoplasmática, falhas na divisão, assimetria de blastômeros, ooplasma granuloso, coloração castanho-escuro, formação de vacúolos, degeneração e rompimento da zona pelúcida. Essas alte rações não foram observadas no grupo controle. A avaliação de todos oócitos incluídos mostrou taxas de clivagem de 70,3 e 52,8%, respec tivamente, para embriões controle e contaminado (p = 0,0001). Após o 5° dia de desenvolvimento embrionário foram observadas 44,7% de mórulas no grupo controle e 22,4% no grupo contaminado, apresen tando diferença significativa (p=0,0001). A presença da STEC interfere na taxa de clivagem dos embriões e também inviabiliza e provoca queda no desenvolvimento embrionário ao estádio de mórula, além de causar alterações morfológicas durante esse desenvolvimento.

PALAVRAS-CHAVE: sêmen bovino; Escherichia coli produtora da shiga toxina stx2; produção in vitro ; microscopia eletrônica de transmissão

ABSTRACT:

The objective of this study was to evaluate by optical microscopy and transmission electron, changes in morphology and viability of the development of bovine embryos, fertilized with semen experimentally contaminated (STEC). Oocytes were aspirated from ovaries of slaughtered cows and the intact zona pellucida were selected and matured. After 20-24 hours of maturation, the oocytes were divided into 2 groups. The first, control group (n = 4l8),fertilized with semen tested and without any type of contaminant and the second, the infected group (n = 415), fertilized with sperm exposed to STEC. Both semen were treated by the technique of discontinuous Percoll gradient. After the period of fertilization, embryos were evaluated for their morphology and viability by optical and electron microscopy. In morphologic evaluation, the oocytes fertilized with contaminated semen showed cytoplasmic shrinkage, gaps in the division, asymmetry of blastomeres, ooplasm grainy, dark brown color, vacuoles formation, degeneration and zona pellucid disruption. These changes were not observed in the control group. The cleavage rate was 70.3 and 52.8%, respectively, for control and infected groups, significant differences (p = 0.0001). After the 5th day of embryonic development, where it was observed 44.7% of morula in the control group, and 22.4% in the contaminated group, showing a significant difference (p = 0.0001). The presence of STEC interferes with the cleavage rate of embryos and also prevents and causes a decline in embryonic development to the morula stage and cause morphological changes during this development.

KEYWORDS: bovine semen; Escherichia coli shiga toxin-producing stx2; in vitro fertilization; transmission electron microscopy

INTRODUÇÃO

Embora cada vez mais utilizadas, as técnicas de reprodução assis tida ainda necessitam de pesquisas que avaliem os riscos sani tários das doadoras, dos oócitos e dos embriões (Magajevski, 2007). É importante e necessário o aprimoramento contínuo de métodos de controle sanitário do rebanho e das biotécnicas ligadas à reprodução, uma vez que as mortalidades embrioná ria e fetal têm um grande impacto na rentabilidade de qual quer sistema de produção animal.

A contaminação do sêmen pode alterar suas caracterís ticas, tendo uma ação direta no espermatozoide, e também pode infectar a fêmea, resultando assim, em baixas taxas de concepção. Muitos micro-organismos podem se localizar na cavidade prepucial, na pele e mesmo no solo, de modo que a contaminação do sêmen pode ocorrer na hora da colheita (Costa; Prado, 2008).

D'angelo et al. (2006), após relatarem contaminação de embriões produzidos in vitro por amostras de sêmen contami nadas com: Acinetobacter spp. (5.000 unidades formadoras de colônia-UFC/mL), Enterobacter aerogenes (5.000 UFC/mL), Escherichia coli (E. coli) (5.000 UFC/mL), Streptococcus spp. (incontáveis/mL) e Alcaligenes faecalis (incontáveis/mL), con cluíram que a amostra de sêmen deve ser isenta de contami nantes, pois a condição in vitro promove ambiente favorável para o seu crescimento.

A presença de bactérias no sêmen torna o procedimento de produção in vitro (PIV) inviável quando a concentração de micro-organismos é alta. Quando a concentração é baixa, sua presença não será facilmente detectada, uma vez que pode não afetar a fecundação e o desenvolvimento dos embriões e, portanto, retardar a aplicação de medidas de controle, podendo facilitar a disseminação do agente (Stringfellow; Givens, 2000).

A E. coli produtora de toxina Shiga (STEC) é encontrada no intestino de animais sadios, sendo o gado bovino principal reservatório, e também no meio ambiente, no qual os animais são mantidos (Feng, 2000). Possui resistência às condições desfavoráveis do meio ambiente, podendo sobreviver por mais de dez meses (Varma et al., 2003).

O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) tem discutido a obrigatoriedade da realização de espermocultura de cada partida de sêmen industrializado, em função das frequentes falhas na PIV, devido às contami nações dos oócitos com bactérias ubiquitárias e oportunistas da microbiota prepucial (Carvalho et al., 2007).

Dessa forma, torna-se relevante a avaliação da infectividade e o efeito em embriões produzidos com sêmen contaminado com STEC, para podermos subsidiar a proposta de que o sêmen precisa ser isento de qualquer micro-organismo, sendo ele patogênico ou não. Alguns desses micro-organismos podem não acarretar doenças para fêmea receptora ou causar disseminação para o rebanho, mas podem comprometer a técnica de reprodução, causando, também, prejuízos ao produtor.

Este trabalho teve como objetivo avaliar, por meio de microscopia óptica e eletrônica de transmissão, as alterações na morfologia e a viabilidade do desenvolvimento de embriões bovinos fecundados com sêmen contaminado experimental mente a STEC.

MATERIAL E MÉTODOS

Foi utilizada, para contaminação do sêmen, a bactéria STEC isolada de bovinos em abatedouros do estado de São Paulo (SP), por swab retal e da carcaça, logo após o abate, identi ficada por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR), apresentando o gene responsável pela produção da toxina stx2 (Miyashiro et al., 2009). Sua suspensão foi preparada na con centração de 200 UFC.

Os ovários foram colhidos em abatedouro de São José dos Campos (SP) e mantidos em solução salina com 1% de antibióticos (Gentamicina). O procedimento acima foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal do Instituto Biológico - CETEA-IB, (protocolo n° 40/08). Foram necessárias duas idas ao abatedouro para coleta de ovários que foram analisados quanto à presença de E. coli, e somente o líquido folicular que estava sem contaminação foi utilizado.

Os folículos ovarianos foram aspirados e os oócitos foram selecionados e maturados em gotas de 100 µL meio de matu ração (MIV - In Vitro(r)), em placa de Petri, na qual permane ceram por 20 horas em estufa à temperatura de 38°C, 5% de CO2 e 90% de umidade. Foram selecionados apenas os oócitos que apresentavam células da granulosa, com ou sem expan são, para maturação. Foram mantidos até 20 oócitos por gota.

Para cada procedimento de fecundação in vitro (FIV), foram descongeladas, em temperatura de 37°C, por 30 segun dos, duas palhetas de sêmen da mesma partida de um mesmo touro (Central Bela Vista/Genética Bovina). Sendo uma utilizada como sêmen controle e outra como contami nado, exposto a 200 UFC de E. coli. A amostra foi conta minada logo após o descongelamento da palheta e incubada durante 30 minutos em estufa a temperatura de 38°C, 5% de CO2 e 90% de umidade, em um tubo de microcentrífuga. O grupo controle também foi mantido durante 30 minutos na incubadora após o descongelamento. Após a exposição, as amostras de sêmen foram submetidas, separadamente, à técnica de gradiente descontínuo de Percoll(r), para separar o plasma seminal, células, debris e espermatozoides imóveis; dessa forma, selecionamos apenas os espermatozoides de melhor qualidade. A concentração espermática foi ajustada em aproximadamente 100 mil espermatozoides móveis para cada oócito, antes de ser colocada na placa de fecundação, com gotas de 100 µL de meio de fecundação (In Vitro ). Os oócitos maturados foram transferidos para essas novas gotas (até 20 por gota) em grupos separados.

Após 18 horas da fecundação, os presumíveis zigotos foram transferidos para nova placa com gotas de 100 µL de meio Synthetic Oviduct Fluid - SOF (In Vitro(r)), mantendo 20 por gota. As células da granulosa foram retiradas e as placas levadas à estufa a 38°C, 5% de CO2 e 90% de umidade até o 5° dia de desenvolvimento, trocando-se o meio no 3° dia. Foram feitas observações para análise morfológica, por meio de possíveis alterações, como retração citoplasmática, assime tria de blastômeros, ooplasma granuloso, coloração castanho -escuro, vacúolos, degeneração e rompimento da zona pelúcida. Também foi observada a viabilidade embrionária, por intermédio da taxa de clivagem e do desenvolvimento, verifi cando o número de células até o 5° dia de desenvolvimento, na presença ou ausência do patógeno. Para análise estatística da taxa de clivagem dos embriões, foi utilizado o teste do X2 com correção de Yates, sendo o nível de significância de p < 0,05.

No 3° dia de desenvolvimento, alguns embriões (50 de cada grupo) foram fixados, colocados em resinas e corta dos com ultramicrótomo em corte semifino (2 µm), sendo levados para análise ultraestrutural os blocos em que foram seccionados e os cortes ultrafinos recolhidos e fixados em telas de níquel (Knutton, 1995; Padrón, 1998). As telas foram examinadas em microscópio eletrônico de transmis são Philips EM208.

É importante ressaltar que os meios de cultivo utilizados eram acrescidos de antibiótico (sulfato de gentamicina 50 mg/L).

Este trabalho foi realizado de acordo os princípios éticos da experimentação animal estabelecidos pela CETEA-IB, con forme consta em declaração de 23 de abril de 2008.

RESULTADOS

Para a análise morfológica e da taxa de clivagem dos embriões, foram identificados e selecionados 833 oócitos de 154 ovários, sendo 418 oócitos fecundados com sêmen controle e 415 oócitos fertilizados com sêmen exposto à STEC.

A avaliação da viabilidade foi verificada por alterações na taxa de clivagem dos embriões e a taxa de desenvolvimento embrionário dos dois grupos pode ser observada conforme Tabela 1. De acordo com o teste do χ2, verificou-se que houve diferença significativa na taxa de clivagem (p = 0,0001) entre os embriões dos grupos con trole e contaminado. Isso implica que, possivelmente, a presença da bactéria no sêmen interferiu na clivagem dos embriões. Após o 5° dia de desenvolvimento embrionário também houve diferença significativa entre os dois grupos (p = 0,0001). A presença da bac téria pode ter influenciado esse resultado, pela ação direta sobre o espermatozoide e/ou embrião, ou indireta, pela ação de sua toxina ou por competir pelo mesmo substrato do embrião.

Tabela 1: Desenvolvimento embrionário dos grupos controle e contaminado. São Paulo (SP), 2009. 

A análise morfológica dos embriões demonstrou muitas diferenças entre os embriões dos dois grupos, como retração citoplasmática, falhas na divisão, assimetria de blastômeros, ooplasma granuloso, com coloração castanho-escuro, forma ção de vacúolos, degeneração e rompimento da zona pelúcida no grupo contaminado.

Com o auxílio da microscopia óptica de corte semifino, foram observadas células granulosas e vacuolizadas, apresen tando estruturas semelhantes às da E. coli (Fig. 1). A avalia ção ultraestrutural com o auxílio de microscópio eletrônico de transmissão também mostrou que o grupo contaminado com E. coli apresentava alta formação de vacúolos e granula ção no ooplasma, além de confirmar presenças de estruturas semelhantes às da E. coli no embrião (Fig. 2). Esses resulta dos indicam que, apesar da utilização da técnica de gradiente descontínuo de Percoll(r), a E. coli permaneceu nos meios e os espermatozoides atuaram como vetor para a transmissão desse patógeno. A presença do patógeno alterou morfologicamente o embrião, podendo prejudicar o seu desenvolvimento até a fase de blastocisto.

Figura 1: Embrião do grupo contaminado após o 4° dia de desenvolvimento em microscopia óptica de corte semifino (aumento de 100x). (A) Zona pelúcida. Estruturas semelhantes às da E. coli estão representadas pela seta. 

Figura 2: Embrião do grupo contaminado após o 4° dia de desenvolvimento em microscopia eletrônica de transmissão (aumento de 10.000x). (A) Zona pelúcida. (B) Citoplasma. As setas indicam estruturas semelhantes às da bactéria. 

DISCUSSÃO

Como pôde ser observado em nossos resultados, a taxa de cliva gem alcançada para o grupo controle (70,3%) foi equivalente às taxas encontradas em uma PIV comercial. Foram relatadas, em alguns estudos, taxas de 52% (Saliba; Alvim, 2005), 61,5% (Pfeifer et al., 2005), 67,2% (Jasmin et al., 2005), 70,33% (Iguma et al., 2005) e 82,1% (Martins Junior et al., 2004). A taxa de clivagem observada no grupo contaminado (52,8%) foi baixa, comparada com o grupo controle e com esses estu dos. Por meio da análise estatística foi observada diferença sig nificativa entre os grupos. Isso implica que, possivelmente, a presença da bactéria no sêmen interferiu na fecundação.

Bielanski (1997), ao contrário dos resultados apresen tados, não observou diferença significativa na taxa de cliva gem entre embriões fecundados com sêmen controle (60%) e embriões fecundados com sêmen exposto experimental mente ao Campylobacter fetus subsp venerealis (10g organismos/mL) (52%).

Piccolomini et al. (2008) infectaram experimentalmente embriões murinos com E. coli produtora da toxina shiga stx1, antes da primeira divisão embrionária. Foi verificada taxa de clivagem de 53,8% para o grupo controle e de 39,7% para o grupo contaminado, também não apresentando significância nos resultados.

De acordo com Diemer et al. (1996) e Auroux et al. (1991), a E. coliapresenta um efeito direto sobre a moti lidade progressiva da célula espermática; no entanto, esse efeito é dependente da concentração bacteriana. Del Porto et al. (1975) observaram que a concentração de 106 UFC por mL de sêmen causava uma queda significativa na moti lidade espermática. Contraditoriamente, Edmondson et al. (1948) não encontraram qualquer correlação entre o número de bactérias presentes no sêmen bovino e o período de tempo que tal fluido apresentava células móveis. No entanto, obser varam que fatores de virulência bacteriana, como capacidade hemolítica, estavam relacionados à diminuição da motili dade espermática.

Após o 5° dia de desenvolvimento embrionário foram observadas 44,7% de mórulas no grupo controle e apenas 22,4% no grupo contaminado, havendo diferença signifi cativa entre os dois grupos. A presença da bactéria pode ter influenciado esse resultado, pela ação direta sobre o espermatozoide e/ou embrião, ou indireta, pela ação de sua toxina ou por competir pelo mesmo substrato do embrião. Bielanski (1997) não observou diferença significativa em embriões que se desenvolveram até a fase de blastocisto (31% grupo contaminado e 41% grupo controle) com o sêmen exposto experimentalmente ao Campylobacter fetus subsp venerealis(10 g organismos/mL).

Pela análise morfológica dos embriões, muitas diferenças foram observadas após o 4° dia de desenvolvimento, como retração citoplasmática, falhas na divisão, assimetria de blastômeros, ooplasma granuloso, com coloração castanho-escuro, formação de vacúolos, degeneração e rompimento da zona pelúcida no grupo contaminado. Alterações semelhantes em embriões murinos expostos experimentalmente à E. coli pro dutora da toxina shiga stx1 foram observadas por Piccolomini et al. (2008), porém nenhum embrião apresentou rompimento da zona pelúcida.

Na análise dos embriões, com o auxílio de microscopia óptica de corte semifino e eletrônica de transmissão, foram observadas células granulosas e vacuolizadas apresentando estruturas semelhantes às da E. coli inseridas no ooplasma. Esses resultados indicam que o espermatozoide pode atuar como vetor para a transmissão desse patógeno.

Stringfellow et al. (1997) descreveram um caso de uso acidental de sêmen contaminado criopreservado com Pseudomonas maltophilia na PIV de bovinos. Apesar do tra tamento do sêmen por gradiente de Percoll(r) e da adição de antibióticos nos meios utilizados para PIV, a bactéria persis tiu nos meios de cultivo e causou degeneração dos embriões.

Amostras de sêmen de touros persistentemente infectadas com o vírus da Diarréia Viral Bovina (BVDV) foram submetidas a técnicas de seleção de espermatozoides normalmente utiliza dos antes da PIV (swim up e gradiente de Percoll(r)) para deter minar se essas técnicas selecionariam espermatozoides livres de BVDV. Utilizando a técnica de imunoperoxidase, foi verificado que todos os testes foram positivos para o BVDV, demonstrando que os métodos físicos comumente utilizados para preparação do sêmen não removem completamente os vírus. Esse sêmen foi utilizado para a PIV, e as taxas de clivagem e desenvolvi mento para o estágio de blastocisto do grupo experimental foram inferiores aos do grupo controle. (Bielanski; Jordan, 1996)

D'angelo et al. (2006) relataram contaminação de embriões de PIV por amostras de sêmen contaminadas com Acinetobacterspp. (5.000 unidades formadoras de colônia - UFC/mL), Enterobacter aerogenes (5.000 UFC/mL), E. coli (5.000 UFC/mL), Streptococcusspp (incontáveis/mL) e Alcaligenes faecalis (incontáveis/mL). A presença dessas bactérias no sêmen tornou o procedimento da FIV inviável.

Devido ao grande desenvolvimento tecnológico ocorrido nesses últimos anos em relação às técnicas empregadas na PIV de embriões bovinos, do ponto de vista epidemiológico, deve -se ressaltar que, a cada fase de desenvolvimento, criam-se novos desafios em relação ao controle de doenças. Conforme as tecnologias vão se tornando mais complexas, como no caso da injeção intracitoplasmática de espermatozoide (ICSI) e da clonagem, criam-se novas oportunidades para a introdução de patógenos no sistema (Stringfellow; et al. 2004). Portanto, a introdução de agentes infecciosos e oportunistas por meio da PIV é óbvia e, consequentemente, pesquisas sobre os riscos de transmissão de doenças por embriões são de extrema impor tância, assim como pesquisas que visam o melhoramento das técnicas de PIV para aumentar cada vez mais as taxas de blastocistos e de sucesso na transferência de embriões.

Para a biotécnica de PIV, devem ser revistas as normas de coleta, processamento e armazenamento de sêmen, para garantir que o fluido seja isento de micro-organismos. As boas práticas na coleta e no laboratório durante o processamento e armazena mento são fundamentais, uma vez que o muco prepucial possui uma microbiota normal muito rica, além de micro-organismos oportunistas, sendo um risco potencial para contaminação do sêmen. É importante ressaltar que os meios de cultivo utili zados durante a fertilização in vitro são ricos em nutrientes e tornam-se propícios ao desenvolvimento de contaminantes.

A boa higienização do prepúcio do touro e dos materiais utilizados durante a coleta, com descontaminantes adequados, é de extrema importância, assim como o uso de antibióticos eficientes durante a diluição do sêmen, já que o procedimento utilizado durante a FIV (Percoll(r)) e meios de cultura acres cidos de antibióticos não se mostraram eficazes para reduzir ou eliminar a STEC.

CONCLUSÃO

Com base nos resultados apresentados, pode-se concluir que a presença da STEC interfere na taxa de clivagem dos embriões e também provoca queda no desenvolvimento embrionário ao estádio de mórula, além de causar alterações morfológicas durante esse desenvolvimento. O sêmen contaminado pode atuar como vetor para a transmissão desse patógeno.

AGRADECIMENTOS

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), ao Laboratório de Biologia Celular, Bacteriologia Geral e de Microscopia Eletrônica do Instituto Biológico, ao abatedouro Mantiqueira, localizado em São José dos Campos (SP), à Empresa In Vitro Brasil e à Central Bela Vista/Genética Bovina.

REFERÊNCIAS

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Recebido: 15 de Janeiro de 2013; Aceito: 28 de Janeiro de 2015

*Autor correspondente: mariola_mmp@hotmail.com

Creative Commons License This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium provided the original work is properly cited.