Aproveitamento da casca de citros na perspectiva de alimentos: prospecção da atividade antibacteriana

Utilization of citrus by-products in food perspective: screening of antibacterial activity

Aproveitamento da casca de citros na perspectiva de alimentos: prospecção da atividade antibacteriana

Utilization of citrus by-products in food perspective: screening of antibacterial activity

Carin Gerhardt^I; José Maria Wiest^II; Giovani Girolometto^III; Magnólia Aparecida Silva da Silva^IV; Simone WeschenfelderV, ^*

^IUniversidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos Departamento de Ciência dos Alimentos Av. Bento Gonçalves, 9500 Caixa Postal: 15090 CEP: 91505-970 Porto Alegre/RS - Brasil e-mail: [e-mail]

^IIUniversidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos Departamento de Ciência dos Alimentos Porto Alegre/RS - Brasil e-mail: [e-mail]

^IIIUniversidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) Faculdade de Ciências Veterinárias Porto Alegre/RS - Brasil e-mail: [e-mail]

^IVUniversidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) Departamento de Horticultura e Silvicultura Faculdade de Agronomia Porto Alegre/RS - Brasil e-mail: [e-mail]

^VUniversidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos Departamento de Ciência dos Alimentos Porto Alegre/RS - Brasil e-mail: [e-mail]

RESUMO

Os citros são as frutas mais produzidas e consumidas no mundo. O Brasil ocupa primeiro lugar na produção mundial e na exportação de suco de laranja, sendo o Estado do Rio Grande do Sul um importante produtor. Ao longo do cultivo e do processamento dos citros, são geradas toneladas de resíduos de baixo valor comercial, mas com grande potencial de aproveitamento dentro da indústria de alimentos. Esses resíduos possuem elevados teores de nutrientes, pigmentos e componentes bioativos, bem como possuem baixa toxicidade e baixo custo. Há evidências de que a casca de diferentes espécies de citros possui princípios ativos antibacterianos e antifúngicos. O objetivo deste trabalho, portanto, foi verificar a atividade antibacteriana de extratos alcoólicos da casca de citros na perspectiva da desinfecção e da conservação de alimentos, propondo alternativas sustentáveis e naturais voltadas a consumidores cada vez mais preocupados com sua saúde. Foram obtidos extratos alcoólicos da casca crua de bergamota-ponkan (Citrus reticulata Blanco), pomelo (Citrus maxima (Burm.) Merr.) e limão-bergamota (Citrus limonia Osbeck ou limão-cravo) maduros, provenientes de cultivo agroecológico, cujas atividades antibacterianas foram avaliadas quanto à Concentração Inibitória Mínima (CIM) e à Concentração Bactericida Mínima (CBM) frente a cinco diferentes bactérias. O extrato de limão-bergamota apresentou a melhor atividade antibacteriana, apresentando CIM em torno de 24 mg.mL^-1 e CBM de 42 mg.mL^-1 para as bactérias mais resistentes. A bactéria mais sensível a todos os extratos foi Pseudomonas aeruginosa, com CIM entre 16 e 36 mg.mL^-1 e CBM entre 28 e 49 mg.mL^-1. Os extratos inibiram ou inativaram na sua totalidade as bactérias testadas, indicando a possibilidade de se tornarem alternativas naturais na desinfecção e na conservação de alimentos.

Palavras-chave: Casca de citros; Atividade antibacteriana; Extrato alcoólico; Desinfetante natural; CIM; CBM.

SUMMARY

Citrus are the most produced fruits in the world. Brazil ranks first in global production and export of orange juice. The State of Rio Grande Do Sul is an important producer of citrus. During farming and processing of citrus, tons of residues are generated, with low commercial value and great potential for use in the field of food production. These residues possess many nutrients, pigments and bioactive compounds, as well as low toxicity and cost. There is evidence that the peel of citrus have antibacterial and antifungal activity. In this work, we aim to determine the antibacterial activity of ethanolic extracts of citrus peels in the perspective of disinfection and preservation of food, presenting sustainable and natural alternatives directed at consumers concerned with health. Ethanolic extracts of crude peel of ripe ponkan tangerine (Citrus reticulata Blanco), pomelo (Citrus maxima (Burm.) Merr.) and rangpur lime (Citrus limonia Osbeck) were obtained from ecological family farms. Their antibacterial activities were evaluated regarding Minimal Inhibitory Concentration (MIC) and Minimal Bactericidal Concentration (MBC) against five different bacterial strains. The rangpur lime extract presented the best antibacterial activity, with about 24 mg.mL^-1 MIC and 42 mg.mL^-1 MBC for the most resistant strain. Pseudomonas aeruginosa was the most sensitive strain. All ethanolic extracts inhibited or inactivated all tested strains, indicating they could be used as natural alternatives in food disinfection and preservation.

Key words: Citrus peel; Antibacterial activity; Crude ethanolic extract; Natural disinfectant; MIC; MBC.

1 Introdução

Os Citrus são as frutas mais produzidas e consumidas no mundo, principalmente laranjas, tangerinas, limas e limões (OLIVEIRA et al., 2008). O Brasil é o país que mais produz esse gênero, com 18.538.100 MT em 2008 (FAO, 2011). O Rio Grande do Sul (RS) se destaca na produção de tangerinas, sendo o terceiro produtor, depois de São Paulo e Paraná (EMBRAPA, 2011). O Estado tem produção estimada de 537 mil toneladas de citros, sendo que a atividade gera 250 milhões de reais anualmente (AGRIANUAL, 2009). Neste Estado, a citricultura é mais evidente nas regiões do Vale do Caí e Taquari, Alto Uruguai e Campanha, cuja base das três primeiras é fortemente familiar, gerando renda a cerca de 20 mil produtores (OLIVEIRA et al., 2010). Além disto, as indústrias envolvidas no beneficiamento e na comercialização são responsáveis por centenas de empregos, sendo importante fonte de renda para vários municípios (MONTENEGRO, 2011).

Tanto no cultivo quanto no processamento de citros podem ser gerados grandes volumes de resíduos. No manejo dos pomares de citros é realizado o raleio, que é a remoção e o descarte de parte dos frutos verdes para atingir melhor qualidade final de frutos. Já na extração de suco de citros, praticamente 50% do fruto é considerado subproduto (CHON e CHON, 1997). Atualmente, os resíduos de suco de laranja são aproveitados na forma de farelo de polpa cítrica peletizada, polpa congelada, melaço, d-limoneno, suco extraído da polpa (Pulp Wash), óleos essenciais, essência oleosa e essência aquosa (DARROS-BARBOSA e CURTOLO, 2005).

As características de fruto são esfericidade e presença de flavedo (porção superficial da casca) rico em flavonoides, fino e com pigmentação entre laranja escuro ou avermelhado, a laranja claro, amarelo ou verde (ORTIZ, 2002).

A casca dos frutos de citros possui diversos metabólitos secundários, responsáveis por sua proteção contra fatores bióticos e abióticos, como terpenoides, carotenoides, cumarinas, furanocumarinas e flavonoides, principalmente flavononas e flavonas polimetoxiladas, raras em outras plantas (AHMAD et al., 2006). Esses compostos estão presentes em extratos e óleos de citros, e têm despertado interesse em diversas áreas em virtude da bioatividade, como atividade antibacteriana (FRIEDMANN et al., 2004; DABBAH et al., 1970; BISIGNANO e SAIJA, 2002; FISHER e PHILLIPS, 2008; GIRENNAVAR et al., 2008; ASHOK KUMAR et al., 2011; STANLEY e JURD, 1971), antifúngica (LIU et al., 2012; CACCIONI et al., 1998; MABRY e ULUBELEN, 1980; STANLEY e JURD, 1971), antioxidante (PATIL et al., 2009; CHOI et al., 2000), inseticida (SISKOS et al., 2008), anti-inflamatória (MABRY e ULUBELEN, 1980), entre outras atividades. Estudos etnológicos encontraram registros da utilização de citros para fins medicinais em 500 a.C. (ARIAS e RAMÓN-LACA, 2005). Apesar da extensa bioatividade, apenas recentemente as características antimicrobianas dos óleos de citros foram mais bem exploradas (FISHER e PHILLIPS, 2008). Óleos de citros já compõem diversas preparações farmacêuticas nas áreas de ginecologia, oftalmologia e cirurgia em função das suas propriedades antissépticas (BISIGNANO e SAIJA, 2002), porém ainda são pouco utilizados em alimentos.

Antimicrobianos naturais parecem ser alternativas viáveis na substituição de conservantes ou desinfetantes químicos (ASHOK KUMAR et al., 2011), estes muitas vezes poluidores, alérgenos (FREEDMAN, 1977; GOODMANN et al., 1990) e com pouca aceitação dos consumidores. Além disso, óleos de citros são considerados GRAS (Generally Recognised as Safe). Em alimentos, essas vantagens poderiam ser exploradas nas indústrias de bebidas e alimentos infantis, bem como em produtos orgânicos.

Na desinfecção convencional, a substância mais utilizada é o cloro. Porém, podem-se formar compostos organoclorados carcinogênicos, como os trihalometanos, na presença de matéria orgânica (ZARPELON e RODRIGUES, 2002). Além disso, o cloro é considerado altamente poluidor, podendo contaminar rios, solo e ar, causando prejuízos à fauna e à flora (MOREIRA, 2011), já que é utilizado em grandes quantidades e possui alto nível de DBO. Há uma tendência atual de eliminação do cloro em processos de desinfecção (ÖLMEZ e KRETZSCHMAR, 2009).

Neste trabalho propôs-se estudar a atividade antibacteriana dos extratos alcoólicos de três variedades diferentes de citros cultivadas no Rio Grande do Sul frente a bactérias importantes à segurança e à qualidade de alimentos, com vistas ao desenvolvimento de desinfetantes e conservantes naturais, de baixo custo, baixa toxicidade e biodegradáveis, aproveitando resíduos da indústria de alimentos.

2 Material e métodos

2.1 Material vegetal

As variedades testadas foram bergamota-ponkan (Citrus reticulata Blanco), pomelo (Citrus maxima (Burm.) Merr.) e limão-bergamota (ou limão-cravo, Citrus limonia Osbeck). Todas as variedades foram colhidas maduras, no estádio de consumo. As amostras foram coletadas em propriedades agroecológicas de agricultura familiar, da cidade de Porto Alegre-RS (limão-bergamota e bergamota ponkan) e do Parque das Acácias, Parque Eldorado, Eldorado do Sul-RS, Região Metropolitana de Porto Alegre (pomelo).

2.2 Determinação da Matéria Seca (MS)

Foi determinada a matéria seca das amostras vegetais por meio de secagem de 30 g de material em estufa com circulação forçada de ar, a 40 °C, até atingir peso constante, em três repetições.

2.3 Preparação de alcoolaturas e extratos alcoólicos

Foram preparadas alcoolaturas de epicarpo e mesocarpo do limão-cravo e da bergamota, bem como do epicarpo do pomelo, na proporção de 400 g para 1.000 mL de álcool 96 °GL. O material foi moído em moedor de carne, com diâmetro de saída de 6 mm, para a abertura das vesículas de óleo e melhor solubilização das substâncias da casca. Logo em seguida foi adicionado o álcool, agitado vigorosamente e armazenado em recipiente hermético, ao abrigo de luz, sob temperatura ambiente. Após maceração mínima de 15 dias, as alcoolaturas foram filtradas e armazenadas sob as mesmas condições. A partir dos valores de MS, extrapolou-se para a concentração de matéria seca por mL de alcoolatura.

Para a obtenção dos extratos alcoólicos as alcoolaturas foram submetidas à destilação fracionada sob pressão reduzida em sistema rota vapor até a retirada do álcool (aproximadamente 2/3 do volume inicial de alcoolatura). No momento da análise de sensibilidade a antimicrobianos, esses extratos foram diluídos em tubos de ensaio com água estéril, às proporções de 90% a 10%, em intervalos de 10%. Para a determinação da concentração dos extratos, utilizou-se o volume de alcoolatura inicial antes da evaporação, o volume de extrato obtido após a evaporação e o resultado da proporção de matéria seca na alcoolatura. Os extratos não foram totalmente secos durante a evaporação para que os compostos não se tornassem insolúveis (ELOFF, 2004).

2.4 Determinação da atividade antibacteriana dos extratos

As cepas utilizadas são provenientes da bacterioteca do Laboratório de Higiene de Alimentos, do Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, compreendendo: Escherichia coli (ATCC^® 25992), Enterococcus faecalis (ATCC^® 29212), Staphylococcus aureus (ATCC^® 25923), Salmonella Enteritidis (ATCC^® 13076) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC^® 27853).

O teste de sensibilidade a antimicrobianos foi realizado pelo Método de Macrodiluição, através do qual foram determinadas a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração Bactericida Mínima (CBM) dos extratos, segundo as normas M7-A6 (CLSI, 2005) e M-26A (CLSI, 1999) do Clinical Laboratory and Standards Institute, respectivamente, com modificações. Foram preparados tubos de 10 mL contendo diferentes concentrações de extrato alcoólico, dos quais foi retirado 1 mL de cada concentração e adicionado a tubos contendo 1 mL de Caldo Mueller-Hinton (Himedia) duplamente concentrado e 3% de Polisorbato 80. Para a preparação do inóculo foi suspendida uma alçada da cultura bacteriana, previamente incubada em Ágar BHI e armazenada sob refrigeração, em 5mL de Caldo BHI (Himedia) e incubada por 18-24 horas (bactérias gram-negativas) ou por até 6 horas (bactérias gram-positivas), a 36 °C (±1 °C). O inóculo foi ajustado para atingir 0,5 na escala de turbidez de McFarland (1 a 2 × 10⁸ UFC.mL^-1 de E. coli ATCC^® 25922) e diluído de modo que o inóculo desafio fosse 5 × 10⁵ UFC.mL^-1. Foram adicionados 100 µL de inóculo aos tubos com extrato e caldo Mueller-Hinton, que foram incubados a 36 °C (±1 °C) por 24 horas. A CIM foi a menor concentração em que não se apresentou crescimento bacteriano visível. Para determinação da CBM, retiraram-se alíquotas de 10 µL, em duplicata, dos quatro tubos de menor concentração sem crescimento visível, plaqueou-se em Ágar BHI (Himedia) e incubou-se a 36 °C (±1 °C) por 24 horas. A CBM foi considerada a menor concentração de extrato na qual ocorreu inativação 3 log UFC/mL do inóculo inicial. Os testes de sensibilidade foram realizados em triplicata.

2.5 Análise estatística

Os resultados de CIM e CBM para os diferentes extratos e bactérias foram submetidos à análise de variância e teste de Tukey (p < 0,05) no software SAS 9.0.

3 Resultados e discussão

Os resultados do percentual de Matéria Seca (MS)obtidos das amostras vegetais podem ser visualizados na Tabela 1. Pode-se observar que a bergamota-ponkan apresentou o maior teor de matéria seca, ou seja, a menor umidade. A casca do limão-bergamota apresentou maior umidade entre as variedades. Atribui-se esse resultado ao método de retirada da casca, já que, ao contrário das outras variedades, foi inicialmente extraído o suco e retirada a polpa. Nesse processo, a casca absorveu parte do suco, o que pode ter influenciado neste parâmetro. Considerando-se que, nos outros casos, não houve contato do suco com a casca, esses componentes podem ter interferido positivamente na atividade antimicrobiana da casca de limão-bergamota, já que alguns estudos apontam que o suco de limões possui atividade antimicrobiana (TOMOTAKE et al., 2006; ARAÚJO et al., 2007).

Os resultados de atividade antimicrobiana podem ser visualizados na Tabela 2. Todas as variedades apresentaram ação frente às bactérias testadas, tanto de inibição quanto de inativação. A variedade mais eficiente foi o limão-bergamota, que apresentou CIM em torno de 35 mg.mL^-1 para E. faecalis, S. aureus, S. Enteritidis e E. coli. A bergamota-ponkan e o pomelo apresentaram atividades menores e não houve diferença significativa entre os valores de CIM e CBM destes cítricos. O melhor resultado obtido para limão-bergamota pode ter ocorrido em razão da interferência do suco, rico em ácidos orgânicos, como o ácido ascórbico. Há trabalhos que demonstram efeitos aditivos deste composto na ação de outros antimicrobianos (CURSINO et al., 2005; TAJKARIMI e IBRAHIM, 2011).

A bactéria mais sensível foi P. aeruginosa, com CIM entre 16 e 36 mg.mL^-1. Já a bactéria mais resistente aos extratos foi E. faecalis, que não foi inativada por nenhum dos extratos e apresentou os maiores valores necessários de CIM e CBM, seguida de E. coli. Em média, a diferença de concentração entre a CIM e a CBM ficou em torno de 30 mg.mL^-1, exceto para a bactéria E. faecalis, que não foi inativada em todas as concentrações testadas e para todos os extratos. Ashok Kumar et al. (2011) realizaram análises de atividade antimicrobiana com extratos etanólicos de Citrus lemon e encontraram valores semelhantes aos obtidos nestas análises. Para a bactéria E. coli, foram obtidas CIM de 25 mg.mL^-1 e CBM de 50 mg.mL^-1 (24 e 43 mg.mL^-1 neste experimento, respectivamente), e para S. aureus, os valores de CIM foram 50 mg.mL^-1 e CBM > 50 mg.mL^-1 (24 e 32 mg.mL^-1, respectivamente).

Os resultados para CIM para os extratos de citros mostram que as bactérias testadas apresentaram inibição semelhante, porém a bactéria P. aeruginosa diferiu significativamente de E. faecalis. Nos resultados para CBM, as bactérias E. faecalis e E. coli não diferiram entre si, mostrando-se significativamente mais resistentes do que as outras (p < 0,05). E. coli diferiu somente de P. aeruginosa (p < 0,05), para CBM. Esses resultados indicam que os extratos não foram seletivos quando ao tipo de parede celular bacteriana, ao contrário do que se tem encontrado para óleos essenciais. Alguns estudos verificaram menor suscetibilidade de bactérias gram-negativas a óleos essenciais, provavelmente por causa da maior complexidade da parede celular (DABBAH et al., 1970; BISIGNANO e SAIJA, 2002; SMITH-PALMER et al., 2001). O mecanismo de ação dos óleos de citros, contudo, ainda não é conhecido (BISIGNANO e SAIJA, 2002). Na medida em que a maior parte das doenças transmitidas por alimentos (DTAs) é causada por bactérias gram-negativas, como Salmonella e E. coli, os extratos alcoólicos de citros se tornam interessantes na perspectiva de alimentos.

Na 6ª Edição da Farmacopeia Europeia (PAULI e SCHILCHER, 2010), são listadas as atividades médias de óleos de algumas espécies de citros comprovadamente antimicrobianas. Segundo essa farmacopeia, o CIM do óleo de limão e da bergamota-mandarina variou entre 0,5 e >20 mg.mL^-1. Contudo, o percentual de óleos nas cascas de citros é relativamente baixo. Segundo Júnior (2009), o rendimento de óleo para casca crua variou de 0,37 a 2,04%, em Citrus aurantium L. e Citrus sinensis Osbeck var. Mimo, respectivamente. Considerando-se esses valores, é interessante a utilização da casca inteira, já que existem outros componentes antimicrobianos que poderiam ser mais bem aproveitados, como as cumarinas (GIRENNAVAR et al., 2008) e os flavonoides (BISIGNANO e SAIJA, 2002), que poderiam agir sinergeticamente entre si. Eloff et al. (2008) encontraram efeitos sinergéticos para diferentes componentes de Combretaceae, o que justificaria a utilização da casca integralmente, permitindo seu melhor aproveitamento.

As frutas testadas são provenientes de agricultura familiar agroecológica, a qual não utiliza fertilizantes, herbicidas e inseticidas químicos. Segundo Boue et al. (2009), plantas submetidas a esse tipo de prática cultural ficam mais vulneráveis a ataques de patógenos e, por isso, produzem maiores teores de metabólitos secundários, como os polifenóis. Além disso, a prática orgânica aumentaria o sistema de defesa antioxidante da planta. Lester et al. (2007) demonstrou que a toranja orgânica (Grapefruit) apresentou maiores quantidades de naringenina e ácido ascórbico. Além do ácido ascórbico, a naringenina também demonstrou possuir atividade antibacteriana (MANDALARI et al., 2007). É possível que os extratos testados sejam mais eficientes do que os de agricultura convencional, porém a comparação é difícil, já que poucos trabalhos utilizam o tipo de extração testado.

Em relação ao tipo de material vegetal utilizado, muitos dos trabalhos utilizam a casca seca na extração dos princípios ativos. Porém, Chanthaphon et al. (2008) encontraram melhores resultados de inibição utilizando cascas frescas, indicando que alguns inibidores podem ter sido perdidos durante a secagem, principalmente componentes voláteis. Além disso, a secagem em nível industrial é um processo caro e que exige investimentos altos. Por isso, indústrias de menor porte têm buscado alternativas para utilização de resíduos frescos de citros (SANTOS et al., 2001).

4 Conclusão

Todos os extratos de diferentes variedades de citros foram capazes de inibir e/ou inativar as bactérias testadas. Isso demonstra que, possivelmente, outras variedades de citros também possuam ação antibacteriana e que podem ser estudadas na mesma perspectiva.

O aproveitamento de resíduos agroindustriais é vital para que seja minimizado seu impacto ambiental. Por isso, é fundamental que sejam exploradas alternativas para sua utilização. Os consumidores estão a cada dia mais preocupados com sua saúde, buscando produtos mais naturais, ecológicos e que atendam, ao mesmo tempo, suas expectativas quanto à segurança e à qualidade. Os resultados encontrados sugerem novas pesquisas acerca da sua efetividade como desinfetantes naturais ou conservadores.

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Autor Correspondente | Corresponding Author

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  22 Nov 2012
• Data do Fascículo
  Maio 2012