Propagación in vitro de Bucquetia glutinosa, especie endémica de los Paramos colombianos

In vitro propagation of Bucquetia glutinosa, endemic species of the Colombian Paramos

Resumen

Utilizando semillas colectadas en el Páramo de Rabanal (Boyacá-Colombia), se estableció un protocolo de multiplicación in vitro de B. glutinosa, especie útil para programas de conservación y restauración de ecosistemas paramunos. Durante el establecimiento de cultivos in vitro, un 57% de semillas asépticas se obtuvo con NaOCl al 5 y 10%, después de 30 días de cultivo en MS-1 el 61,4% de estas desarrollaron plántulas de apariencia normal; el 75% de los microtallos cultivados en MS/2+0,5 mg l-1 AIB, alcanzó una longitud promedio de 2,06 cm, formaron hasta 10 yemas axilares y de estos se individualizaron entre dos y cuatro brotes basales. El desarrollo de raíces fue simultáneo con la fase de multiplicación. Las plantas, mostraron un 94,4% de sobrevivencia durante la aclimatación en invernadero, en sustrato compuesto por tierra y capote (1:1). Este es el primer protocolo de micropropagación de melastomáceas nativas colombianas, de uso potencial en la restauración y conservación de ecosistemas alto andinos en estado de deterioro y vulnerabilidad.

Palabras clave:
melastomatáceas nativas; páramo; propagación in vitro; restauración; semillas

Abstract

In vitro multiplication protocol of B. glutinosa was established by seeds collected in the Paramo of Rabanal (Boyacá-Colombia), this species is useful in programs for the conservation and restoration of moorland ecosystems. During the establishment of in vitro cultures, 57% of aseptic seeds were obtained with 5 and 10% NaOCl, after 30 days of culture in MS-1, 61.4% of them developing normal appearance seedlings; 75% of the micro-stems cultivated in MS / 2 + 0.5 mg l-1 IBA reached an average length of 2.06 cm, formed up to 10 axillary buds and among these, around two and four basal shoots were individualized. Root development was parallel to multiplication phase. Plants showed a 94.4% survival rate during acclimation in the greenhouse, on a substrate composed of soil and ground mulch (1:1). This is the first micropropagation protocol of native Colombian melastomáceas with a potential use for restoration and conservation of high Andean ecosystems in a state of deterioration and vulnerability.

Key words:
native melastomatáceas; paramo; in vitro propagation; restoration; seeds

Introducción

Los ecosistemas paramunos vienen siendo afectados negativamente por la alteración de las condiciones climáticas y por ciertas actividades antrópicas; el uso que el hombre le ha dado a los suelos de páramo ha causado la alteración y deterioro de muchas especies nativas importantes para el equilibrio natural del ecosistema (Leon et al. 2011; Sarmiento et al. 2013). Un caso real de esta situación ha sucedido en el Macizo Páramo de Rabanal, ecosistema de gran interés para los departamentos de Boyacá y Cundinamarca por ser zona de nacimiento de fuentes abastecedoras de numerosos sistemas hídricos (IAvH et al. 2008) y, sin embargo, las comunidades que lo habitan lo han transformado, afectando su paisaje y su riqueza natural; por tanto, es evidente la necesidad de abordar acciones que, de manera inmediata, contribuyan a la conservación y/o restauración de dicho sistema estratégico, que presta servicios imprescindibles como la captación de carbono atmosférico (contribuyendo al control del calentamiento global) y el suministro de agua potable (Sarmiento et al. 2013).

Los procesos de restauración ecológica se ven considerablemente afectados por la escasez de propágulos de especies claves (nativas) que inicien la sucesión, o de especies de estados sucesionales avanzados que permitan recuperar la estructura y composición del área a restaurar (Romero et al. 2016). Numerosas especies nativas, entre ellas algunas Melastomataceae, como Bucquetia glutinosa (L. f.) DC, presentan una gran utilidad potencial en procesos de restauración y conservación del paisaje, así como en la recuperación de las cuencas hidrográficas; además, su óptimo crecimiento en zonas de potrero, la caracteriza como especie colonizadora de los bordes de los parches que se han formado después de la fragmentación que han sufrido algunos bosques (Díaz et al. 2008).

Adicionalmente, debido a sus vistosas flores y follajes llamativos, algunos de los géneros de la familia, entre estos Bucquetia, tienen uso potencial ornamental (Woodgyer 2009), aspecto que puede ser explotado por las comunidades cercanas a los páramos (Ibáñez-Alcocer 2013). Sin embargo, se debe tener en cuenta que la mayoría de especies nativas se reproducen por semilla sexual, cuya disponibilidad depende de la duración de los ciclos de floración, de la capacidad de fecundación, fertilidad y germinación (Pacheco & Castellanos 2005) y, además, dicha reproducción puede presentar dificultades por falta de una dispersión adecuada y de sitios para su establecimiento y desarrollo (Schupp et al. 2010).

Aunque, en B. glutinosa a través de métodos tradicionales y en condiciones de laboratorio, se han cuantificado porcentajes de germinación hasta del 60%, no es posible establecer un patrón que explique claramente la viabilidad de las semillas a través del tiempo, algunos estudios reportan porcentajes entre el 15-60% (Peréz-Martinéz et al 2014); además, por ser una especie con amplia distribución la germinación se ve limitada a mayor elevación (Salehani et al. 2013), esto por el aumento de la severidad de la condiciones climáticas (Wagner & Simons 2008), que en los páramos es bastante extrema. Sumado a esto, en especies leñosas con semillas de un tamaño reducido, como la mayoría de las melastomatáceas (Mendoza & Ramírez 2006), tanto la exigencia de altos requerimientos de luz como la presencia de reservas nutricionales limitadas, restringen el establecimiento y la supervivencia de las plántulas (Moles & Westoby 2004), que a su vez no toleran los altos niveles de radiación y bajas temperaturas (Puentes 2010), característicos de estos ecosistemas

Al respecto, el desarrollo de biotecnologías relacionadas con procedimientos de propagación masiva de especies silvestres, sobre todo de aquellas que por muy diversas razones se encuentran en estado de vulnerabilidad y amenaza de extinción (Pathak & Abido 2014) o que son necesarias para procesos de restauración, pueden contribuir de manera efectiva a la conservación de los páramos (Cruz-Cruz et al. 2013). No obstante, la mayoría del material vegetal colectado en campo contiene patógenos endógenos que limitan su viabilidad (Andreolli et al. 2016); en las semillas, que son los explantes que garantizan el mantenimiento y aumento de la diversidad genética de una especie, estos contaminantes afectan negativamente su sobrevivencia retrasando el crecimiento de las plántulas (Rache & Pacheco 2012), pues generan una relación de competencia (Ramírez et al. 2016); de esta forma la propagación in vitro permite producir plantas libres de patógenos que al ser llevadas a campo, con seguridad tendrán mayor probabilidad de sobrevivencia (Cruz et al. 2013) Por tal razón, el objetivo de este estudio fue establecer, a partir de semilla sexual, un procedimiento para multiplicar in vitro plántulas de B. glutinosa, utilizables en procesos de restauración y conservación del Páramo de Rabanal (Boyacá: Samacá y Ventaquemada).

Materiales y Métodos

El estudio se desarrolló en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales BIOPLASMA-UPTC de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia. Se colectaron, entre febrero y marzo de 2016, frutos maduros de plantas adultas de Bucquetia glutinosa, localizadas en el Páramo de Rabanal (Ventaquemada, Boyacá-Colombia), en el sector Matanegra de la Vereda Montoya (05°24’N y 73°32’W), a 3370 m de altitud.

Asepsia superficial y establecimiento in vitro

En el laboratorio, las semillas se extrajeron manualmente de los frutos usando pinzas de punta fina y estereomicroscopio. En cámara de flujo laminar, las semillas se agruparon en lotes de 250, contenidas en bolsas de muselina estéril; posteriormente, se sumergieron en 50 ml de agua destilada estéril con Tween 20 (0,1%, v/v) por 10 min, en Alcohol 70% (v/v) durante 30 segundos y posteriormente se sumergieron en Hipoclorito de Sodio (NaOCl) al 5 y 10% durante 10 minutos (T1 y T2), Hipoclorito de Calcio (Ca(ClO)₂), al 5 y 10% durante 10 minutos (T3 y T4), NaOCl al 5 y 10% durante 15 minutos (T5 y T6, respectivamente).Finalmente, las semillas se enjuagaron cuatro veces consecutivas con agua destilada estéril.

Posteriormente, las semillas desinfectadas se cultivaron en medio MS (Murashige & Skoog 1962) sin reguladores de crecimiento (T1), MS con sales minerales diluidas a ½ (MS/2, T2) y ¼ (MS/4, T3), MS/2 con 3 mg l^-1 de Tiamina, Piridoxina, Ácido Nicotínico y Pantotenato de Calcio (MS^-1, T4) (Cid et al. 1997) y agua destilada estéril (T5). Se realizaron observaciones cada cinco días durante 30 días y se cuantificó el porcentaje de semillas germinadas y la ocurrencia de contaminación por hongos y bacterias.

Multiplicación y enraizamiento de brotes

Previa eliminación de la raíz, las plantas obtenidas en la etapa anterior fueron transferidas, teniendo como referencia los trabajos de Cid et al. (1997) y Kozak & Wnuk (2012), a los siguientes medios de multiplicación: MS completo y/o MS/2 suplementado con Ácido Indolacético (AIA), 6-bencilaminopurina (BAP), Ácido Giberélico (GA₃) y/o Ácido Indolbutírico (AIB) (Tab. 1). Después de 60 días de cultivo, con un subcultivo a 30 días, se cuantificó la longitud total promedio de microtallos, el promedio de yemas axilares basales desarrolladas y de brotes individualizables, así como el porcentaje de microtallos enraizados.

Tabla 1
Medios de cultivo utilizados durante la etapa de multiplicación y enraizamiento de brotes de B. glutinosa. T1 (Barrueto et al. 1997), T2 (Kozak & Wnuk 2012), T3-T4 (modificaciones realizadas con base en T1 y T2). MS (Murashige & Skoog, 1962). ANA: Ácido Naftalen-acético, AIA: Ácido Indol-acético, BA: Bencil-adenina, AIB: Ácido Indol-butírico; GA3: Ácido Giberélico. Cantidades dadas en mg l-¹
Table 1
Culture media used during the stage of multiplication and rooting of B. glutinosa shoots. T1 (Barrueto et al., 1997), T2 (Kozak and Wnuk 2012), T3-T4 (modifications made based on T1 and T2). MS (Murashige and Skoog, 1962). ANA: Naphthalene-acetic acid, AIA: Indole-acetic acid, BA: Benzyl-adenine, AIB: Indole-butyric acid; GA3: Gibberellic acid. Amounts given in mg l^-1

Componentes	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7
Macroelementos	MS/2	MS	MS	MS/2	MS/2	MS/2	MS/2
Microelementos	MS	MS	MS	MS	MS	MS	MS
Mioinositol	50	100	100	100	100	100	100
Pantotenato de Calcio	1,0	--	--	--	--	--	--
Tiamina	1,0	0,1	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
Ácido Nicotínico	1,0	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Piridoxina	1,0	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Glicina	--	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0
ANA	0,1	-	1,0	--	--	--	--
AIA	--	0,5	--	--	--	--	--
BAP	0,2	1,0	2,0	--	--	0,5	1,0
GA3	0,7	--	0,7	--	--	--	--
AIB	--	--	--	0,5	0,2	0,2	0,5

• Todos los medios de cultivo se suplementaron con 30 g l^-1 de Sacarosa y se gelificaron con 6,5 g l^-1 de Agar.
  All culture media were are supplemented with 30 g l^-1 of Sucrose and gelled with 6.5 g l^-1 Agar.

Aclimatación

Plántulas desarrolladas en la etapa anterior se extrajeron de los recipientes de cultivo, se les eliminó el agar adherido a las raíces con agua corriente y se transfirieron a bandejas de icopor (poliespam) de 21 × 21 × 5,5 cm con tierra y capote (mantillo de bosque) en proporción 1:1. Las bandejas se colocaron dentro de cajas de vidrio de 50 × 30 × 10 cm, cubiertas con plástico extensible; las condiciones ambientales del interior de las cajas fueron 23 ºC y humedad relativa de 97%. Las cajas se mantuvieron con fotoperiodo de 16 h luz, en cuarto de incubación y las plántulas se regaron diariamente por aspersión manual. Después de 15 días, el plástico extensible se eliminó de forma progresiva y, posteriormente, las plántulas se transfirieron a bolsas de encapachar de 10 × 15 cm con tierra y capote (1:1) y se llevaron a invernadero, con riego cada tres días por aspersión manual durante 30 días. En esta etapa se cuantificó el porcentaje de plántulas viables.

Condiciones generales de cultivo y análisis de datos

La unidad experimental en la etapa de germinación fue un recipiente de vidrio con 25 semillas con diez repeticiones para un total de 250 semillas por tratamiento. En la etapa de multiplicación la unidad experimental fue un recipiente de vidrio con cinco explantes (explante = microtallo con uno o dos segmentos nodales) con 15 repeticiones.

Los explantes se cultivaron en recipientes de vidrio de 100 ml, con alícuotas de 20 ml de medio de cultivo con pH 5,8 ajustado con HCl y/o NaOH (1N) y esterilizado en autoclave a 15 psi y 121 °C durante 20 minutos. Los cultivos se incubaron a 24±1 °C con iluminación continua de 70-80µmol m^-2 s^-1, suministrada por lámparas fluorescentes de 75W.

Los datos obtenidos se procesaron en el programa IBM SPSS Statisctics versión 22. Para determinar diferencias significativas entre los tratamientos de asepsia superficial y germinación, se realizó la prueba de Chi-cuadrado; para los datos de multiplicación y enraizamiento, la prueba H de Kruskal-Wallis para muestras independientes; y finalmente, para observar el comportamiento multivariable de los tratamientos ensayados, se realizó un análisis de componentes principales (ACP) utilizando el programa PAST versión 3.06. Los datos de aclimatización se registraron y analizaron como porcentajes.

Resultados

Asepsia superficial y establecimiento in vitro

Los distintos procedimientos de desinfección permitieron obtener un 42,8% (642) de semillas asépticas, registrándose el mayor porcentaje, 57% (570 de 1000 semillas) utilizando NaOCl como agente desinfectante (T1, T2, T5 y T6), frente a un 14,4% (72 de 500 semillas) con Ca(ClO)₂ (T3 y T4); no obstante, los tratamientos T1 y T3 (con 23,6 y 26% de semillas asépticas) y, T2 y T4 (con 4,4 y 2,8% de semillas asépticas) (NaOCl y Ca(ClO)₂, respectivamente) registran un comportamiento semejante.

Los resultados de la prueba Chi-cuadrado mostraron un efecto significativo entre la concentración y el tiempo de inmersión en NaOCl, observándose que a medida que aumenta el tiempo de exposición disminuye el porcentaje de contaminación (T1 y T2 vs. T5 y T6), de tal manera que en los tratamientos T5 y T6 se registraron los mayores porcentajes de desinfección, 100%, diferenciándose significativamente de los demás tratamientos (p=9,325E-256).

En los tratamientos en los que se presentó contaminación, las bacterias fueron el contaminante más frecuente, observándose en el 57,8% de las semillas cultivadas, mientras que el 30,6% del total de semillas cultivadas presentó contaminación por hongos; no obstante, se observó que algunas semillas mostraron contaminación tanto bacteriana con fúngica.

Después de 30 días de cultivo, se observó una cantidad progresiva de semillas germinadas en todos los tratamientos aplicados, alcanzándose un 38,1% (761) de semillas germinadas (Tab. 2). Del total de semillas germinadas, el 2,5% (19 semillas) germinaron en medio MS (T1), el 5,1% (39) en MS/2 (T2), el 5.3% (40) en MS/4 (T3), el 61.4% (307) en MS^-1 (T4) y el 71.2% (356) en agua (T5), estableciéndose diferencias significativas entre los tratamientos (p=0,00).

Tabla 2
Semillas germinadas y plántulas en desarrollo de Bucquetia glutinosa cultivados en diferentes medios.
Table 2
Germinated seeds and seedlings in development of Bucquetia glutinosa grown in different media

Respuesta	Medios de cultivo
	MS	MS/2	MS/4	MS-1	Agua	TOTAL
Semillas germinadas	0,05±0,21 a	0,10±0,30 b	0,10±0,30 b	0,77±0,42 c	0,89±0,31 c	0,38±0,49
Plántulas viables	0,26±0,45 a	0,15±0,37 b	0,15±0,36 b	0,39±0,49 c	0,56±0,50 d	0,44±0,50

• Letras distintas en na misma fila indican diferencias entre tratamientos. Los valores se presentan como promedio ± la desviación estándar.
  Different letters in the same row indicate differences between treatments. Values are presented as average ± the standard deviation.

De las 761 plántulas obtenidas, el 44.2% (336 plántulas) fueron viables después de 70 días de cultivo, registrándose respuestas variables entre los tratamientos (p=0,001254); sin embargo, se debe resaltar que los medios que exhibieron los más altos porcentajes de plántulas viables, 39% y 56% son los mismos que permitieron alcanzar mayor porcentaje de germinación, MS^-1 y agua, respectivamente (Tab. 2).

En general, las plántulas presentaron un adecuado crecimiento y desarrollo con tallos gruesos (0,4-0,7 cm de diámetro), con 2 o 3 entrenudos y 3 a 5 cm de longitud, formación y desarrollo vigoroso de hojas y yemas; no obstante, aquellas que germinaron en agua mostraron hiperhidratación en tallos y hojas, razón por la cual, aunque en este tratamiento se registró un elevado promedio de germinación (Tab. 2), las plántulas desarrolladas presentaron una apariencia anormal.

Multiplicación y enraizamiento de brotes

Durante esta etapa los datos registrados para cada una de las variables evaluadas mostraron diferencias significativas (Prueba H de Kruskal-Wallis; P≤0,05) Aunque en los tratamientos realizados no se observó un alto incremento en la elongación, los microtallos con mayor longitud promedio se obtuvieron en T4 (MS/2 + 0,5 mg l^-1 AIB), en el cual el 75% alcanzó una longitud entre 2,5 cm 3,5 cm, mientras en T1 (medio propuesto por Cid et al. 1997), T2 (Kozak & Wnuk, 2012) y T6 (MS/2+0,2 mg l^-1 AIB + 0,5 mg l|^-1 BA) el 75% de los microtallos presentaron una longitud promedio de 0,7 cm (Fig. 1).

Figura 1
Longitud de microtallos, número de yemas axilares desarrolladas, número de raíces desarrolladas y número de brotes individualizables registrados en diferentes medios de proliferación de microtallos de B. glutinosa
Figure 1
Length of micro-stems, number of developed axillary buds, number of developed roots and number of individualizable outbreaks registered in different proliferation media of B. glutinosa micro-stems.

Por otra parte, se observó que la formación de yemas axilares y el desarrollo de brotes individualizables fueron afectados, principalmente, por el tipo de auxina utilizada y su combinación o no con otros reguladores. De esta forma en T4 y T5 (medios suplementados solo con AIB) los microtallos desarrollaron el mayor número de yemas axilares basales, 10 y 8, respectivamente, los cuales produjeron 2-3 brotes individualizables; sin embargo, algunos de estos microtallos desarrollaron hasta 7 brotes. También se observó que, la concentración original de sales minerales del MS suplementada con auxina, citoquinina y giberelina (T3) no estimuló el desarrollo de yemas axilares, ya que en este tratamiento los microtallos formaron, en promedio, 2 yemas. Estos resultados contrastan con los obtenidos en T1, que solo difiere de T3 en la concentración de sales minerales y la presencia de Pantotenato de Calcio y Glicina y, en los cuales los microtallos formaron aproximadamente 8 yemas axilares (Fig. 1).

Con relación al enraizamiento, el AIB tuvo un efecto positivo sobre el desarrollo de raíces en los microtallos de B. glutinosa, ya que esta auxina en concentraciones de 0,5 y 0,2 mg l^-1 (T4 y T5) estimuló el desarrollo de 7 raíces en promedio; sin embargo, en T4 algunos microtallos desarrollaron hasta 18 raíces (Fig. 1) con apariencia normal, forma típica fasciculada, de consistencia semileñosa, color blanquecino y ápice meristemático rojizo. En los demás tratamientos (T1, T2, T3, T6 y T7) los microtallos solo formaron entre 1 y 3 raíces , con valores máximos y atípicos de 8 y 4 raíces (T7 y T6 respectivamente) (Fig. 1). Por otro lado, la individualización de hasta 7 brotes por explante (y un promedio de 3 brotes/explante) en el tratamiento cuatro, confirma el efecto positivo del AIB solo, sobre la multiplicación in vitro de B. glutinosa, ya que en los tratamientos suplementados con otros reguladores fue casi imposible individualizar microtallos desarrollados a partir de yemas axilares (Fig. 1).

La correlación de las variables evaluadas mediante el análisis de componentes principales (ACP), permitió corroborar las diferencias encontradas con el estadístico H de Kruskal Wallis. El análisis muestra que la variación de las respuestas obtenidas durante la etapa de multiplicación y enraizamiento está explicada con un 97,39% en dos componentes principales y separa los tratamientos evaluados en dos grupos: el primero compuesto por los medios de cultivo correlacionados positivamente con la longitud, el número de yemas, brotes y raíces de los microtallos (T4 y T5) y el segundo en los que la correlación no es significativa, es decir, los medios con microtallos con menor longitud y número de yemas, sin desarrollo de brotes axilares ni raíces (T1, T2, T3, T6 y T7) (Fig. 1); no obstante se puede inferir que T4 es el más apropiado para llevar a cabo una propagación masiva de B. glutinosa, ya que en este se obtuvo la mejor correlación para las cuatro variables: microtallos con una longitud promedio de 2,06 cm, los cuales formaron hasta 10 yemas axilares basales, desarrollaron en promedio siete raíces y de estos microtallos se individualizaron entre dos y cuatro brotes basales (Fig. 1 y 2). El tratamiento T3 no mostró correlación entre los componentes resultantes ni con las variables evaluadas (Fig. 2), confirmando así que en los medios con sales minerales MS al 100% suplementados con auxinas, citoquininas y giberelinas, por lo menos en las concentraciones utilizadas en este estudio, no se obtiene una proliferación adecuada de B. glutinosa.

Figura 2
Análisis de componentes principales (ACP) para la etapa de multiplicación de microtallos de B. glutinosa cultivados en diferentes medios de proliferación.
Figure 2
Principal component analysis (PCA) for the multiplication stage of B. glutinosa micro-stems cultivated in different proliferation media.

Aclimatación

La adaptación progresiva de las plántulas a condiciones ex vitro fue exitosa; tallos y hojas conservaron su turgencia, y se observó crecimiento activo como respuesta al adecuado funcionamiento activo del sistema radical. Después de 30 días de aclimatización, se encontró una correspondencia significativa entre el sustrato (tierra y capote) y la viabilidad de las plantas, registrándose un 94,4% de sobrevivencia.

Discusión

Se ha descrito una indudable interacción entre plantas y microorganismos, en los que se establecen relaciones de tipo patogénico, benéfico o neutral (Hardoim et al. 2015; Andreolli et al. 2016); generalmente, la contaminación in vitro causada por hongos y bacterias retrasa el crecimiento de los explantes, al competir con ellos y generar modificaciones en el medio que afectan negativamente su sobrevivencia y desarrollo (Ramírez et al. 2016), por lo tanto, establecer un adecuado procedimiento de asepsia superficial de los tejidos es indispensable para alcanzar una elevada viabilidad y facilitar la reactivación del crecimiento y desarrollo de los explantes (Rache & Pacheco 2012).

El NaOCl al 5% y 10% durante 15 minutos permitió establecer in vitro semillas de B. glutinosa, haciendo efectiva la eliminación de microorganismos sin afectar su viabilidad; en este sentido Diomedi et al. (2017), han afirmado que la relación dependiente entre la concentración y el tiempo de inmersión es determinante en la eliminación de poblaciones de microorganismos, principalmente de bacterias, contaminantes más frecuentes en el cultivo de B. glutinosa. Resultados semejantes se han reportado con NaOCl para Miconia squamulosa en concentración de 6% durante 3 y 6 minutos, en donde el incremento del tiempo de inmersión registra una desinfección del 80-90% (Jardin Botanico de Bogota 2011) y en Dioscorea alata en concentraciones de 1,5% (Borges et al. 2009).

Aunque los procedimientos de asepsia con NaOCl al 5% y 10% fueron efectivos, se observó un elevado porcentaje de contaminación en los demás tratamientos (T1, T2, T3 y T4), respuesta que puede estar influenciada por la morfología de las semillas reniformes, con superficie papilosa granulada de Bucquetia (Vargas & Pérez-Martínez 2014), carácter que permitió que gran parte de la población de microorganismo haya escapado a la acción de los productos desinfectantes, pues permanecen protegidos en las superficies irregulares del explante (Ramírez et al. 2016); además, las características del origen de la planta madre (factores bioclimáticos, suelo, ph, condiciones fitosanitarias, etc.) afectan heterogéneamente las condiciones de cultivo (Ramirez 2013), ya que usualmente la contaminación expresada en el medio corresponde a los mismos patógenos presentes en su habitad natural (Rodriguez et al. 2008).

La germinación y viabilidad embrionaria no se vio afectada por el procedimiento de asepsia, alcanzándose un porcentaje de germinación favorable, 38,1%. Algunos autores consideran que el NaOCl estimula la germinación, mantiene la vialidad y facilita la reactivación del crecimiento, brotación y/o desarrollo del explante (Rache & Pacheco 2012; Ramirez 2013), debido a que dicho compuesto activa la diferenciación celular, con bajo daño fitotóxico, facilitando una regeneración más rápida y eficiente (Elinorovololona & Martial 2014).

En cuanto al medio de cultivo, el medio MS^-1 (T4) y el agua (T5), permitieron recuperar mayor número de semillas germinadas, esto indica que las semillas de B. glutinosa presentan un balance nutricional endógeno adecuado y por lo tanto no requieren elevadas cantidades de inductores orgánicos y/o químicos externos que estimulen su germinación, resultado que concuerda con observaciones anteriores en especies afines como M. squamulosa, en la que se obtuvo un 33,33% de germinación en medio MS reducido a la mitad de su concentración original y sin reguladores de crecimiento (Jardín Botánico Bogotá 2011). De lo anterior se infiere, que tal como las semillas de M. squamulosa, las de B. glutinosa se encontraban en estado de madurez fisiológico adecuado, y que las condiciones nutricionales y ambientales suministradas a través del cultivo in vitro fueron óptimas para estimular su proceso germinativo. No obstante, los explantes desarrollados en agua destilada estéril presentaron hiperhidratación que progresivamente fue causa de inviabilidad de plántulas, por lo que se prefirió el medio semisólido (MS^-1), para continuar el proceso de establecimiento.

El medio MS^-1 demostró un efecto significativo sobre el crecimiento, desarrollo y vigor de las plántulas, principalmente sobre los procesos de diferenciación, formación y extensión de hojas y crecimiento y desarrollo de tallos, tal como fue descrito por Borges et al. (2009) para Dioscorea alata, especie en la que el contenido nutritivo del medio de cultivo permitió un crecimiento y desarrollo vegetativo continuo, expresado en la formación de nuevas hojas y yemas, producto de una importante actividad de crecimiento y diferenciación desplegada por los tejidos meristemáticos.

La fase de establecimiento in vitro permitió obtener el material vegetal necesario para continuar con las etapas siguientes, de tal forma que la dificultad germinativa observada en condiciones naturales, a causa de la germinación no homogénea de las semillas, fue superada de manera eficiente en condiciones in vitro

Durante la multiplicación de B. glutinosa, el medio de cultivo más adecuado resultó ser MS/2 suplementado con 0,5 mg l^-1 de AIB (T4), en el que el desarrollo y elongación de brotes basales fue simultáneo con la formación de raíces. Respuestas similares fueron obtenidas por Cid et al. (1997) quienes indujeron la formación de raíces en la fase de multiplicación en Miconia sp. cultivada en un medio suplementado con 0,5 mg l^-1 AIB. Ma et al. (2007) también estimularon la regeneración de plantas y desarrollo de raíces en Melastoma affine en medio MS/2 enriquecido con 0,1 mg l^-1 de AIB y, de manera semejante, He et al. (2010), obtuvieron microtallos de Tigridiopalma magnifica con desarrollo de raíces en MS/2 suplementado con 4,92 µM de AIB. Cabe señalar, que el enraizamiento espontáneo durante la multiplicación fue una respuesta benéfica, ya que permitió a los explantes absorber adecuadamente los nutrientes presentes en el medio de cultivo, entre estos el AIB, una de las auxinas sintéticas más utilizadas en procesos de propagación, ya que es fotoestable y de poca sensibilidad a la degradación biológica (Rodríguez et al. 2012), estimula el crecimiento y tiene acción sobre la división o elongación de las células, el desarrollo de la raíz embrionaria y postembrionaria, así como también el gravitropismo (Overvoorde et al. 2010)

Durante los primeros días de cultivo para la multiplicación de B. glutinosa, las plántulas mostraron un desarrollo continuo; sin embargo, se observó que el tejido foliar en contacto con el medio de cultivo se necrosó produciendo fenolización y senescencia de tejidos. Según Azofeifa (2009) las plantas superiores en condiciones adecuadas, producen varias sustancias secundarias (metabolitos) que son de naturaleza fenólica y su acumulación, con frecuencia, altera la composición química del medio, inhibiendo el crecimiento del explante y causando progresivamente su muerte (Borges et al. 2009); por esta razón, y para evitar la fenolización del medio, en cada transferencia a los microtallos se les eliminó los primeros dos pares de hojas basales, lo cual produjo resultados favorables a través de varios subcultivos.

Por otra parte, el desarrollo de 8 a 10 yemas axilares y la individualización de hasta 7 brotes basales, en medios suplementados solo con AIB (T4 y T5), son resultados contrastantes con los obtenidos en otras melastomatáceas, puesto que se ha reportado respuesta proliferativa óptima en medios suplementados con citoquininas y auxinas diferentes al AIB (Ravoniarison & Ephrem 2014; Zhang et al. 2015; Prudente et al. 2016). En este sentido y, aunque al BA se le conoce como una citoquinina de gran efectividad durante la regeneración de brotes en varias especies de Melastomataceae (Elavazhagan & Arunachalam 2010; Kozak & Wnuk 2012; Mahmud 2013), los medios suplementados con esta hormona no resultaron efectivos para B. glutinosa ya que los brotes presentaron retraso en el crecimiento. Las variaciones de comportamiento en cultivo in vitro de melastomatáceas se pueden explicar por diferencias en la capacidad de regeneración y multiplicación celular de cada especie (Pedroza-Manrique & Caballero-Arévalo 2009), pues a pesar de pertenecer a la misma familia, dicha capacidad está definida por el estado fisiológico de cada planta y su carga genética (Viñas & Jiménez 2011).

Son notorias las respuestas registradas en los tratamientos T4 y T5, cuyos medios fueron suplementados solo con auxina, respuesta que en la gran mayoría de las plantas es estimulada, principalmente, solo por la presencia de citoquininas (Pedroza-Manrique & Caballero-Arévalo 2009); no obstante el control que ejercen las auxinas (en concentraciones adecuadas) sobre los niveles de citoquininas endógenas activas, puede mediar la formación de N-glucósidos o la activación de citoquinina oxidasa, la que regula la biosíntesis de citoquininas endógenas producidas por el tejido meristemático (Segura 2008).

Finalmente, es de destacar la importancia de la utilización de semillas sexuales como explantes iniciales, para llevar a cabo la micropropagación, por ejemplo de B. glutinosa, ya que, al reintroducir material vegetal producido bajo condiciones in vitro se mantiene y/o aumenta la diversidad genética existente en las poblaciones y ecosistemas de origen. Así mismo, micropropagar este tipo de especies, además de ser una alternativa eficaz para incrementar el número de individuos en poblaciones con problemas de reproducción y/o extremadamente reducidas (González-Benito & Martín 2011), es una estrategia para contribuir a la conservación de la biodiversidad de los ecosistemas paramunos y altoandinos (Bohórquez et al. 2016) que se encuentran en alto riesgo de vulnerabilidad.

El tiempo de permanencia de las plantas de B. glutinosa en condiciones iniciales de aclimatación (en bandejas cubiertas), afectó significativamente la sobrevivencia y crecimiento de las mismas, resaltándose la importancia de la regulación de humedad/aireación y corroborándose que el cambio de atmósfera saturada de agua en condiciones in vitro, a un ambiente con humedad variable, (en todo caso menor) en condiciones ex vitro, debe ser realizado de forma gradual, para evitar la muerte de las plántulas micropropagadas (Chandra 2010). El sustrato compuesto por tierra y capote aportó los requerimientos necesarios para el acondicionamiento y funcionalidad progresiva de raíces y tallos, proponiéndose como sustrato adecuado para el endurecimiento de vitroplantas de B. glutinosa; Estos resultados son consistentes con estudios realizados con Miconia squamulosa, (Jardín Botánico de Bogotá 2011) bajo la premisa que la aclimatación es la etapa más importante de la micropropagación, puesto que debe garantizar que las plantas que se extraen de un ambiente controlado deben permanecer viables y, de esta manera mostrar la calidad de todo el proceso in vitro. (Borges et al. 2009).

El protocolo establecido, es el único estudio de micropropagación de melastomáceas nativas colombianas, constituyéndose en un referente replicable en otras especies relacionadas y que sean seleccionadas bajo criterios similares. El material vegetal micropropagado es utilizable en procesos de reintroducción, restauración y conservación de ecosistemas en estado de deterioro y vulnerabilidad, como lo es el Páramo de Rabanal.

Conclusiones

Para la propagación in vitro de Bucquetia glutinosa, la desinfección superficial de las semillas fue efectiva (57%) al emplear NaOCl al 5 y 10% mientras la germinación se vio favorecida en el medio MS^-1, estimulando los procesos de crecimiento y desarrollo de plántulas.

Después de 60 días de cultivo, con trasferencia a nuevo medio cada 30 días, los microtallos cultivados en MS/2+0,5 mg l^-1 AIB alcanzaron hasta 3,5 cm de longitud con 10 yemas axilares y dieron lugar hasta tres brotes basales individualizables; el desarrollo de raíces fue simultáneo con la multiplicación de microtallos. Estos resultados evidencian una alternativa efectiva para multiplicar B. glutinosa, ya que, además de usar un medio reducido en sales minerales y suplementado únicamente con AIB, las vitroplantas obtenidas demostraron un alto grado de adaptabilidad y funcionalidad durante el proceso de aclimatización en sustrato de tierra y capote, alcanzándose un elevado porcentaje de sobrevivencia.

Agradecimientos

Los autores agradecen a los integrantes de los grupos de investigación BIOPLASMA-UPTC y SISBIO, por la colaboración recibida durante el desarrollo de esta investigación, así como al convenio de colaboración No. 5211740 suscrito entre la UPTC y ECOPETROL S.A. el cual brindo apoyo logístico, en campo, en laboratorio, entre otros; también a la Dirección de Investigaciones (DIN) de la UPTC por los recursos económicos otorgados para tal fin.

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Fechas de Publicación

• Publicación en esta colección
  03 Oct 2019
• Fecha del número
  2019

Histórico

• Recibido
  23 Feb 2018
• Acepto
  10 Mayo 2018