Sistema enzimático gerador de peróxido de hidrogênio: NADPH oxidase na tireóide humana

artigo original

Sistema Enzimático Gerador de Peróxido de Hidrogênio - NADPH Oxidase na Tireóide Humana

Luciene C. Cardoso

Márcia D.L. Figueiredo

Manoel G. Domingos

Mario Vaisman

Denise P. Carvalho

Instituto de Biofísica Carlos Chagas

Filho (LCC, DPC) e Serviços de

Endocrinologia (MDLF, MV) e de

Cirurgia Geral (MGD), Hospital

Universitário Clementina Fraga

Filho, Universidade Federal do Rio de

Janeiro, Rio de Janeiro, RJ.

Recebido em 05/09/1999

Revisado em 18/02/2000

Aceito em 10/04/2000

RESUMO

No presente estudo avaliamos a atividade geradora de peróxido de hidrogênio (H₂O₂) em frações particuladas de tireóides suínas e humanas. Inicialmente, analisamos as propriedades bioquímicas da NADPH-oxidase - enzima geradora de H₂O₂ - localizada na membrana apical da célula tireóidea suína. Nossos resultados demonstram que a atividade geradora de H₂O₂ na tireóide suína ocorre, principalmente, na fração de membrana apical tireóidea (P 3.000g). Entretanto, no P 3.000g a enzima NADPH-oxidase é apenas parcialmente cálcio-dependente, ao contrário do que acontece em frações purificadas de membrana tireóidea suína, nas quais a enzima é completamente dependente de cálcio, conforme estudos anteriores. Nossos resultados confirmam os previartiente descritos para a NADPH-oxidase tireóidea suína. Em tecidos tireóideos humanos, a geração de H₂O₂ ocorreu, tanto na fração microsomal (P 100.000g) quanto na fração de membrana apical (P 3.000g). Nossos dados revelam ainda que a NADPH-oxidase humana é completamente cálcio-dependente, ativada por altas concentrações de fosfato e parece ser tão ativa na glândula humana quanto na suína. Além disto, a enzima humana é dependente de adenina-flavina-dinucleotídeo (FAD) no meio de reação, ou seja, parece ser uma flavoproteína, assim como a proteína suína. (Arq Bras Endocrinol Metab 2000;44/4: 352-357)

Unitermos: Peróxido de hidrogênio; NADPH-oxidase; Tireóide suína; Tireóide humana

ABSTRACT

In the present study we evaluated the enzyme responsible for hydrogen peroxide (H₂O₂) generation in porcine and human thyroid glands. First, we analyzed the biochemical properties of the hydrogen peroxide generating enzyme (NADPH-oxidase), localized in the apical membrane of porcine thyroid cells. Our results showed that the H₂O₂ generating activity in porcine thyroids occurs mainly in the apical membrane fraction (P 3.000g). In the porcine P 3.000g, thyroid NADPH-oxidase was partially calcium-dependent; however, in a purified porcine thyroid membrane fraction the enzyme is completely calcium-dependent, as previously determined. These data agree with those already reported for the porcine enzyme. In humans, H₂O₂ generation occurred both in the microsomal (P 100.000g) and in the apical membrane fractions (P 3.000g). Our data reveal that NADPH-oxidase seems to be as active in human thyroid glands as in porcine thyroids; both are activated by phosphate and calcium in high concentrations. Furthermore, the human NADPH-oxidase is completely calcium-dependent and requires flavine adenine dinucleotide (FAD) in the reaction mixture, suggesting the human NADPH-oxidase to be a flavoenzyme, as the porcine protein. (Arq Bras Endocrinol Metab 2000;44/4: 352-357)

Keywords: Hydrogen peroxide; NADPH-oxidase; Porcine thyroid; Human thyroid

A TIREÓIDE É RESPONSÁVEL PELA SÍNTESE e secreção da triiodotironina (T3) e da tiroxina (T4); em menor proporção é formada triiodotironina reversa (rT3). Os precursores destes hormônios são derivados da iodação de resíduos tirosila da molécula de tireoglobulina, originando a monoiodotirosina (MIT) e a diiodotirosina (DIT). Assim, formação de T3 e T4 ocorre em várias etapas: transporte ativo do iodeto para a tireóide, oxidação do iodeto, síntese da tireoglobulina (Tg), iodação dos resíduos tirosila da Tg para formação das iodotirosilas (MIT e DIT) e acoplamento das iodotirosilas (1).

A formação de quantidades adequadas dos hormônios tireóideos depende, em primeira instância, da disponibilidade de iodo. O transporte de iodeto para as células foliculares tireóideas é realizado contra um gradiente eletroquímico, através de um co-transportador Na+/I^-que é positivamente regulado pelo hormônio tireotrófico (TSH) (2). No interior da célula folicular tireóidea, o iodeto é rapidamente oxidado e, posteriormente, organificado na molécula de Tg (3). A enzima chave nestes processos de iodação e acoplamento dos resíduos iodotirosila da Tg é a tireoperoxidase (TPO) (4), uma hemoproteína glicosilada ancorada à membrana plasmática apical da célula tireóidea, com o domínio catalítico voltado para o colóide (5). A expressão do gene da TPO é restrita ao tecido tireóideo (6) e está sob controle do TSH (7). A reação de oxidação do iodeto catalisada pela TPO requer como cofator o peróxido de hidrogênio (H₂O₂), um aceptor de elétrons essencial para as reações de iodação e acoplamento (4). Nunez e cols. (8) postularam a existência de dois sítios catalíticos na TPO oxidada pelo peróxido de hidrogênio (composto I), um favorecendo o iodeto e o outro favorecendo a tirosina. Ambos os substratos sofrem oxidação monoeletrônica, havendo formação dos radicais livres I^- e Tyr^-. Estes radicais se unem, enquanto ligados à enzima, formando um complexo ternário, originando a MIT. Esta pode sofrer oxidação monoeletrônica e reagir com I^- , formando a DIT (4).

Vários sistemas enzimáticos foram propostos como responsáveis pela geração de H₂O₂ na tireóide, entre eles: NADPH-citocromo e redutase (9), NADH-citocromo bg redutase (10), monoamina oxidase (11) e xantina oxidase (12). Porém, estes sistemas estão mais associados às frações microsomal (10) ou mitocondrial das células tireóideas (11) do que com a fração relacionada à atividade TPO, ou seja, membrana apical. Bjorkman e cols. (13-15) demonstraram, em folículos tireóideos murinos e porcinos, que o sistema gerador de H₂O₂ está localizado na superfície apical da célula folicular tireóidea, que utiliza NADPH como substrato e que há aumento da sua atividade quando se adiciona ao meio o ionóforo de cálcio A23187, sugerindo que os níveis de cálcio intracelular poderiam regular a geração de H₂O₂. Posteriormente, demonstrou-se que a enzima responsável pela geração de H₂O₂ é cálcio-dependente (16,17). Foi sugerido que seria necessária a ligação do cálcio a uma sub-unidade inibitória da enzima, ou a um domínio auto-inibitório, para convertê-la da forma inativa para a forma ativa (17,18).

O sistema enzimático responsável pela geração de H₂O₂ foi melhor caracterizado em tireóides suínas, tendo sido demonstrado que a enzima é uma flavo-proteína, já que utiliza um dinucleotídeo flavina-adenina (PAD) como grupamento prostético (19). O mecanismo bioquímico da geração de H₂O₂ e a natureza molecular do transporte de elétrons associado à membrana tireóidea ainda não está completamente elucidado, porém este mecanismo foi muito estudado (16-26), com algumas divergências entre os resultados obtidos. Os autores concordam que o sistema gerador de H₂O₂ é dependente de cálcio e que envolve uma NADPH-oxidase.

O principal hormônio regulador da NADPH-oxidase tireóidea é o TSH. Bjorkman e cols. (15), utilizando folículos abertos de porcos, demonstraram que o efeito estimulador do TSH não seria através do aumento de AMPc, portanto, deveria estar ligado ao aumento intracelular de cálcio. Resultados similares foram obtidos em amostras tireóideas de bovinos (27). Em ratos, a geração de H₂O₂ estimulada por TSH parece ser mediada tanto pelo AMPc, quanto por aumento de fosfatidil-inositol/cálcio (28). Além disto, Raspe e Dumont (2) demonstraram que o H₂O₂ celular era liberado sob controle tônico do TSH, via cascata de AMPc, em tireócitos caninos. Estes dados estão de acordo com os descritos posteriormente por Carvalho e cols. (29) em tireócitos suínos, nos quais a enzima responsável pela geração de H₂O₂ também foi induzida pelo TSH através do aumento de AMPc. Desta maneira, assim como a TPO e a Tg, o sistema gerador de H₂O₂ (NADPH-oxidase tireóidea) parece ser um marcador de diferenciação celular tireóideo, já que sua síntese é regulada por TSH (2,29).

A caracterização deste sistema enzimático em tireóides humanas contribuirá para o melhor entendimento da fisiopatologia de algumas doenças desta glândula. Assim, no presente estudo, padronizamos a dosagem do sistema gerador de peróxido de hidrogênio na tireóide e o estudamos em tecidos para-nodulares de nódulos frios.

PACIENTES E MÉTODOS

Estudo do sistema gerador de H₂0₂ em particulados tireóideos de porco

A dosagem do sistema gerador de H₂O₂ tireóideo foi padronizada em particulados tireóideos de porco, gentilmente cedidos pelo Dr. Alain Virion (INSERM, França), para possibilitar a comparação de nossos resultados àqueles obtidos anteriormente no laboratório do grupo francês (17,19).

Diferentes volumes de particulado tireóideo suíno (25, 50, 100, 150 e 200ml) foram incubados em tampão fosfato de sódio 50mM ou 150mM, pH 7,2 contendo 10mM NaN₃ (para inibir qualquer enzima que pudesse destruir o peróxido gerado), 10mM EGTA, 12mM CaCl₂ e 100mM NADPH (substrato da enzima). As amostras foram incubadas em banho-maria a 30°C. Após 5, 10, 15 e 20 minutos de incubação 100ml do incubado foram transferidos para tubo contendo 10ml de HC1 2,4N para paralisar a reação e destruir o NADPH restante. Deste modo evitamos a geração adicional de H₂O₂ após os intervalos de tempo determinados. O H₂O₂ gerado foi medido pelo método da escopoletina, conforme anteriormente descrito (17).

Processamento dos tecidos humanos para caracterização da geração de H₂O₂

Utilizamos amostras de tecidos paranodulares tireóideos provenientes de quatro pacientes com bócio nodular atóxico (nódulos hipocaptantes). Todos os pacientes estavam eutireóideos no dia da cirurgia e não receberam nenhuma medicação no período pré-operatório. Este estudo foi analisado e aprovado pela Comissão de Ética do Hospital Universitário Clementine Fraga Filho, UERJ.

As amostras de tecido tireóideo foram dissecadas e as áreas hemorrágicas e o tecido conjuntivo foram removidos em placa de petri sobre gelo. O tecido com aspecto homogêneo foi pesado e homogeneizado em Ultra-Turrax, 1 g de tecido para 3ml de tampão H (fosfato de sódio 50mM, sucrose 250mM, EGTA 1mM, DTT 200mM, pH 7,2). O homogeneizado foi filtrado em gaze e centrifugado a 3.000g, 15 min, 4°C (rotor SS 34, Sorval - centrifugação I). O precipitado foi ressuspenso em 3ml de tampão A2 (fosfato de sódio 50mM, sucrose 250mM, cloreto de magnésio 2mM, pH 7,2) e centrifugado nas mesmas condições anteriores; o mesmo processo foi repetido duas vezes, sendo esses sobrenadantes desprezados. O último precipitado (P 3.000g) foi ressuspenso em 1 ml de tampão A2. O sobrenadante da centrifugação I foi centrifugado a 100.000g, 1h, 4°C (rotor 70.1 Ti, ultracentrífuga Beckmann - centrifugação II). O precipitado foi ressuspenso em 3ml de tampão A2 e centrifugado nas mesmas condições. O sobrenadante foi eliminado e o precipitado ressuspenso em 1ml de tampão A2 (P 100.000g).

Diferentes volumes das preparações P 3.000g (membrana apical) e P 100.000g (microsoma) foram incubados em tampão fosfato de sódio 50, 170 ou 200mM, pH 7,2 contendo 10mM NaN₃, 10mM EGTA, 0,4mM FAD, 15mM CaCl₂ e 200mM NADPH (30). As amostras foram incubadas em banho-maria a 30°C. Após 5, 10, 15 e 20 minutos de incubação 100ml do incubado foram transferidos para tubo contendo 10ml de HC1 2,4 N. O H₂O₂ gerado foi medido pelo método da escopoletina (30).

A dosagem protéica das amostras foi feita usando-se o método de Bradford (31). As dosagens enzimáticas foram feitas em pelo menos dois experimentos diferentes para cada amostra de tecido humano.

RESULTADOS

Inicialmente, padronizamos a metodologia de dosagem de peróxido de hidrogênio. Houve diminuição progressiva da fluorescência com o aumento da concentração de H₂O₂ adicionada ao meio de reação: a oxidação da escopoletina pelo H₂O₂ ocorreu praticamente na razão mol por mol.

A geração de H₂O₂ aumenta progressivamente em função do volume da preparação de particulado de tireóide suína utilizado (figura 1), sendo a atividade máxima alcançada com 100ml da preparação. Assim, utilizamos esse volume de amostra (100ml) para estudar algumas características do sistema gerador de H₂O₂. A quantidade de H₂O₂ gerada aumentou progressivamente com o aumento da molaridade de cálcio no meio de incubação (figura 2). Entretanto, não houve variação significativa entre as atividades medidas em diferentes concentrações de fosfato (50 e 150mM) (figura 3).

Nas tireóides humanas, detectamos atividade geradora de H₂O₂ tanto no P 3.000g (207nmol H₂O₂ • h^-1 • g^-1 ptn, em média) quanto no P 100.000g (190nmol H₂O₂ • h^-1 • mg^-1 ptn, em média) (figura 4), enquanto em tireóides suínas a atividade geradora se restringe à fração P 3.000g. As atividades enzimáticas em ambas as frações de tireóides humanas são completamente cálcio dependentes e ativadas por altas concentrações de fosfato (figura 5).

DISCUSSÃO

O método da escopoletina vem sendo utilizado por diversos autores (16,17,29) para medir a atividade de geração de H₂O₂ em particulados tireóideos de porco. No nosso laboratório, esta metodologia foi padronizada durante o presente estudo, sendo os resultados similares aos anteriormente obtidos em outro laboratório (17).

Dème e cols. (17), já demonstraram o papel ativador do cálcio na produção de H₂O₂ em particulados de tireóides suínas. Anteriormente, foi sugerido que a regulação da concentração intracelular de cálcio livre deve ter um papel relevante no controle da produção de H₂O₂ na tireóide (2,16). Mais recentemente, Carvalho e cols. (29) demonstraram que a geração de H₂O₂ dependente de cálcio é induzida pelo TSH através da cascata de AMPc, em culturas primárias de células tireóideas de porco. Nossos resultados corroboram os achados de outros autores, sugerindo haver estimulação específica do cálcio sobre o sistema gerador de H₂O₂. A cátion dependência do sistema gerador de H₂O₂ foi descrita por diversos autores como sendo específica para o cálcio, pois estudos in vitro utilizando Mg⁺⁺ demonstraram que a ativação do Ca⁺⁺ não era reproduzida por este cátion (17). Além disto, os nossos achados de completa cálcio-dependência da NADPH oxidase encontrada cm tireóides humanas reforça a idéia da estimulação da enzima por este cátion.

Recentemente, Leseney e cols. (30) descreveram a presença da NADPH oxidase em amostras de bócios difusos tóxicos. A NADPH oxidase descrita por esses autores tem características bioquímicas semelhantes às encontradas no presente estudo. Entretanto, as atividades enzimáticas detectadas por Leseney e cols. (30) foram muito menores (30) que as por nós determinadas, provavelmente por terem os pacientes recebido iodo no período pré-operatório. Assim, postulamos que a NADPH oxidase seja o alvo principal do mecanismo de auto-regulação, como anteriormente sugerido para o sistema gerador de H₂O₂ em tecidos tireóideos caninos e humanos (32).

Foi sugerido, por diversos autores, que em alguns bócios disormonogênicos a causa do defeito na biossíntese hormonal poderia ser alguma alteração na geração de H₂O₂ (33,34). Uma vez que a NADPH oxidase humana está caracterizada, será possível estudar bócios disormonogênicos nos quais possa haver defeito na biossíntese hormonal por diminuição na geração de H₂O₂ e relacioná-los a defeitos na atividade NADPH oxidase.

Endereço para correspondência:

Denise Pires de Carvalho

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

CCS - Bloco G, Cidade Universitária, Ilha do Fundão

21.949-900 Rio de Janeiro, RJ

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  05 Out 2005
• Data do Fascículo
  Ago 2000

Histórico

• Aceito
  10 Abr 2000
• Revisado
  18 Fev 2000
• Recebido
  05 Set 1999