Ácido linoleico conjugado como potencial bioativo para modulação e criotolerância de gametas e embriões

Resumo

O ácido linoleico conjugado (CLA) é uma mistura de isômeros posicionais do ácido linoleico encontrado em carne e laticínios de ruminantes. É um tipo de gordura trans muito utilizada por atletas para como suplemento alimentar devido a um suposto efeito de maximizar a utilização das reservas de gordura corporal. O interesse na suplementação de dietas e meios de cultura com o CLA é uma área emergente, exigindo estudos para elucidar seus benefícios nos parâmetros reprodutivos e na criopreservação. Dessa forma, o objetivo dessa revisão foi discutir os efeitos do CLA na criotolerância de oócitos, espermatozóides e embriões. Alguns estudos já demonstraram seu uso na criopreservação da linhagem germinativa. Entre esses, foi observado que a suplementação de CLA durante a maturação in vitro de oócitos pode aumentar sua viabilidade pós-congelamento e capacidade de desenvolvimento. Em relação ao uso de CLA no esperma, existem poucos estudos e seus resultados ainda são inconclusivos. Por último, estudos sobre a suplementação de CLA em meios de cultura de embriões mostraram resultados promissores, indicando que essa molécula bioativa é capaz de modular a captação de lipídios em blastômeros. No total, essas descobertas demonstram o potencial uso do CLA como uma molécula bioativa para melhorar a linha germinativa e a criotolerância ao embrião e abrir novas perspectivas no campo da reprodução humana e animal.

Palavras-chave:
acúmulo lipídico; criopreservação; embrião; oócito; sêmen

Abstract

Conjugated linoleic acid (CLA) is a mixture of positional isomers of linoleic acid found in meat and dairy products from ruminants. It is a trans fat widely used by athletes as a food supplement, due to a supposed effect of maximizing the use of body fat reserves. The interest in diet and culture media supplementation with CLA is an emerging area, demanding studies in order to elucidate its benefits in the reproductive parameters, as well as in cryopreservation. Therefore, the aim of this review was to discuss the effects of CLA on the oocytes, sperm and embryos cryotolerance. Some studies have already demonstrated its use in cryopreservation of germline. Among those, it was observed that CLA supplementation during oocyte in vitro maturation can increase their viability post-freezing and developmental capacity. Regarding the use of CLA on sperm, there are few studies and their results are still inconclusive. Finally, studies about CLA supplementation on embryo culture media have shown promising results, indicating that this bioactive molecule is able to modulate lipid uptake on blastomeres. Altogether, these findings demonstrate the potential use of CLA as a bioactive molecule to improve germline and embryo cryotolerance and open new perspectives on human and animal reproduction field.

Key-words:
lipid accumulation; cryopreservation; embryo; oocyte; sperm

Introdução

A criopreservação é um processo de preservação de organelas, células, tecidos ou quaisquer outras formações biológicas por resfriamento das amostras a temperaturas muito baixas⁽¹⁾. Isso ocorre porque o metabolismo biológico nas células vivas diminui drasticamente em baixas temperaturas, o que permite a preservação a longo prazo de células e tecidos vivos para pesquisa científica ou para muitas aplicações médicas. No entanto, o congelamento desprotegido é normalmente letal⁽²⁾. Um grande desafio para as células durante esse processo não são as baixas temperaturas (abaixo de -180 °C) durante o armazenamento, ao contrário, é a letalidade de uma zona de temperatura intermediária (-15 a -60 °C) pela qual a célula deve passar duas vezes - durante o resfriamento e o aquecimento⁽³⁾. As velocidades de resfriamento e descongelamento podem afetar amplamente as reações físico-químicas e biofísicas, afetando também a taxa de sobrevivência.

Além disso, as lesões criogênicas envolvem ruptura osmótica causada por altas concentrações de solutos e pela formação de cristais de gelo intra e extracelulares⁽²⁾. Para mitigar esses efeitos nocivos, os crioprotetores são normalmente usados​para aumentar a concentração total de todos os solutos no sistema e reduzir a quantidade de gelo formado em qualquer temperatura. Para serem biologicamente aceitáveis, os crioprotetores devem ser capazes de penetrar nas células e ter baixa toxicidade^(1,2). Muitos compostos têm essas propriedades, incluindo glicerol, dimetilsulfóxido, etanodiol e propanodiol. Independentemente da técnica de criopreservação, seja permitindo o congelamento (criopreservação convencional) ou evitando o congelamento (vitrificação), o crioprotetor deve acessar todos os componentes celulares⁽²⁾. Entretanto, barreiras como membranas celulares e gotículas lipídicas intracitoplasmáticas comprometem a difusão e osmose, interferindo na introdução e remoção de crioprotetores durante o congelamento e descongelamento. Assim, a modulação das propriedades da membrana e a quantidade de lipídios intracelulares podem melhorar a eficiência da sobrevivência celular durante o processo de criopreservação.

Nesse sentido, estudos sobre dieta e suplementação com ácidos graxos em meios de cultura in vitro, como o ácido linoléico conjugado (CLA), têm sido utilizados como estratégia para modular a composição da membrana e a quantidade de lipídios intracitoplasmáticos, visando a melhorar a eficiência da criopreservação de gametas^{(4, 5)} e embriões^(6,7). Diante desse cenário, o objetivo desta revisão é fornecer um estudo sobre o uso do CLA na criopreservação na linha germinativa e de embriões, descrevendo os principais achados publicados na área.

1. Síntese biológica do ácido linoléico conjugado (CLA)

O ácido linoléico conjugado (CLA) refere-se a uma mistura de isômeros posicionais e geométricos do ácido linoléico, caracterizado por ligações duplas conjugadas, não separadas por um grupo metileno, como no ácido linoléico. Essas ligações duplas geralmente estão localizadas nas posições 8 e 10, 9 e 11, 10 e 12, 11 e 13, e podem ocorrer nas configurações cis-cis, trans-cis, cis-trans e trans-trans⁽⁸⁾. Dentre todas as combinações possíveis, apenas duas têm bioatividade comprovada (CLA cis-9, trans-11 e CLA trans-10, cis-12), com efeitos na redução da carcinogênese⁽⁹⁾, antiobesidade ^(10,11,12), alteração na composição lipídica do leite bovino⁽¹³⁾, afeta positivamente o diabetes mellitus, além de melhorar a resposta imunológica⁽¹⁴⁾. Esses isômeros podem ser sintetizados no rúmen, tecido adiposo e glândula mamária, em um processo conhecido como síntese endógena.

1.1. Síntese ruminal

A síntese do CLA no rúmen ocorre por meio da biohidrogenação incompleta dos ácidos graxos poliinsaturados da dieta por microrganismos ruminais⁽¹⁵⁾. Este evento requer a lipólise prévia de ácidos graxos esterificados na forma de triglicerídeos, fosfolipídios e galactolipídios, por lipases microbianas presentes no rúmen. Os ácidos graxos livres insaturados da lipólise são, então, submetidos à biohidrogenação. Durante o processo de biohidrogenação do ácido linoléico, o isômero cis-9, trans-11 é o primeiro intermediário formado pelas bactérias ruminais. A enzima isomerase Δ12 cis, Δ11 trans catalisa a isomerização de ácidos linoléicos em cis-9, trans-11, que é saturado na posição da ligação dupla cis-9 pela enzima redutase, formando ácido vacênico (C18:1). Essa enzima redutase precisa de radicais carboxila livres (COOH) para completar a reação, o que requer lipólise prévia dos lipídios da dieta. A próxima etapa envolve uma redução subsequente do ácido vacênico (C18:1) para o ácido esteárico (18:0)^(16,17). Porém, durante esse evento, os intermediários desse processo podem passar pelo rúmen, movimentar-se pela corrente sanguínea e serem absorvidos e incorporados à gordura dos tecidos.

Griinari e Bauman⁽¹⁸⁾ propuseram que o isômero do cis-9, trans-11, pode eventualmente ser convertido em C18:1 trans-10 no conteúdo ruminal. Essa especulação sobre a produção de CLA trans-10, cis-12 foi confirmada posteriormente. Coakley et al. e Ando et al. demonstraram que Bifidobacterium sp, Propionibacterium sp, Lactococcus sp, Streptococcus sp e Lactobacillus sp, isolados de outros habitats, também podem produzir CLA trans-10, cis-12^(19,20). Essas bactérias podem ser encontradas no rúmen, embora em número muito pequeno, contribuindo para a bio-hidrogenação e formação do CLA trans-10, cis-12. A população desses microrganismos aumentou significativamente no rúmen de animais alimentados com dietas concentradas, o que é consistente com a maior produção de CLA trans-10, cis-12⁽²¹⁾. De acordo com Griinari et al.⁽²²⁾ e Chouinard et al.⁽²³⁾, existem algumas condições que podem intensificar a síntese ruminal de CLA, como alterações no ambiente ruminal, incrementos na quantidade de ácidos graxos na dieta e modificações no pH ruminal.

1.2. Síntese não ruminal

A síntese de CLA endógeno nos tecidos começa quando o ácido graxo C18:1 é dessaturado pela enzima Δ9 dessaturase (SCD), presente na glândula mamária e no tecido adiposo⁽²⁴⁾. Em animais, a dessaturação ocorre apenas até o carbono 9 por causa da ausência das enzimas Δ12 e Δ15 dessaturases, presentes apenas em vegetais. Consequentemente, o ácido linoléico é considerado um ácido graxo essencial e deve ser fornecido por meio de dieta, pois é um precursor essencial na síntese das prostaglandinas. SCD introduz uma ligação dupla entre os carbonos 9 e 10 de ácidos graxos. As reações catalisadas por dessaturases são essenciais para manter a fluidez das membranas celulares⁽²⁵⁾.

Para verificar a hipótese de síntese endógena de CLA pela enzima SCD, Griinari et al.⁽²⁴⁾ infundiram no abomaso de vacas em lactação uma mistura de C18:1 trans-11 e C18:1 trans-12 (50% -50%) e observaram um incremento de 31% no CLA cis-9, trans-11 secretado no leite. Com base nisso, concluíram que os animais são realmente capazes de produzir CLA cis-9, trans-11 endogenamente. No outro experimento, avaliando a contribuição da síntese endógena de CLA via SCD, os autores infundiram óleo de sterculia (um inibidor de SCD) e estimaram que 64% do CLA no leite de ruminantes é produzido endogenamente. Corroborando esses dados, Corl et al.⁽²⁶⁾ também relataram uma redução de 60-65% no isômero cis-9, trans-11 quando os animais receberam uma dieta suplementada com óleo de sterculia. Kay et al.⁽²⁷⁾ estimaram que 87 a 100% do isômero cis-9, trans-11, presente na gordura do leite, foi produzido por via endógena em vacas a pasto e suplementadas com óleo de sterculia, e também demonstraram que é possível aumentar os níveis do isômero cis-9, trans-11 no leite, por meio da suplementação de ácidos graxos trans C18:1.

Para avaliar o efeito biológico do CLA na atividade da SCD, Lee et al.⁽²⁸⁾ utilizaram camundongos como modelos experimentais, suplementando a dieta com 42% do isômero cis-9, trans-11 e 44% do trans-10, cis-12. Nesse estudo, foi observada uma redução relativa na expressão do RNA mensageiro hepático (mRNA) da SCD. Em outro experimento em que apenas o isômero cis-9, trans-11 foi usado, a expressão de SCD não foi alterada. Com base nesses dados, os autores inferiram que o isômero trans-10, cis-12 é responsável pelos efeitos inibitórios da expressão da SCD, resultado confirmado posteriormente por Park et al.⁽²⁹⁾. De acordo com esses dados, assume-se que o isômero trans-10, cis-12 atua inibindo diretamente o SCD e que provavelmente a ligação dupla na posição cis-12 é a mais importante nesse efeito inibitório do CLA.

2. CLA na modulação da acumulação de lipídios intracelular

A homeostase lipídica em células de mamíferos é regulada por uma família de fatores de transcrição denominada proteína de ligação ao elemento de resposta a esterol (SREBP). Esses fatores de transcrição controlam a atividade e a expressão de mais de 30 genes relacionados à síntese de colesterol, ácidos graxos, triglicerídeos e fosfolipídios⁽³⁰⁾. Estudos in vivo e in vitro relataram que o CLA trans-10, cis-12 influencia a quantidade de lipídios intracelulares por meio da modulação na expressão gênica e na atividade de enzimas sob o comando de SREBP.

Durante a lipogênese, a primeira molécula de ácido graxo (ácido palmítico) é obtida de uma molécula de acetil-CoA e sete de malonil-CoA. Requer duas enzimas fundamentais, (1) acetil-CoA carboxilase (ACC) e (2) sintases de ácidos graxos (FAS), responsáveis​pela síntese de malonil-CoA e ácido palmítico, respectivamente. Estudos independentes^(31,32) demonstraram que a infusão do isômero trans-10, cis-12 no abomaso bovino reduziu significativamente a expressão dessas enzimas lipogênicas, diminuindo, consequentemente, o teor de gordura do leite (48%), a capacidade lipogênica do tecido (82%) e a expressão das enzimas glicerol fosfato aciltransferase e acil glicerol fosfato aciltransferase. Da mesma forma, estudos in vitro realizados por Pereira et al.⁽⁶⁾ demonstraram que a suplementação de CLA em meios de cultura reduziu o acúmulo de lipídios em embriões bovinos. Posteriormente, Batista et al.⁽⁷⁾ demonstraram que essa redução ocorre por meio da modulação na expressão da enzima 1-acilglicerol 3-fosfato 0-aciltransferase (AGPAT) envolvida na síntese de triglicerídeos. Portanto, a suplementação de CLA tem sido proposta como uma alternativa para diminuir a regulação negativa de genes relacionados à lipogênese⁽³³⁾, inibir a síntese e a captação de triacilgliceróis e, consequentemente, reduzir o acúmulo de lipídios intracitoplasmáticos ^{(34, 35)}. Apesar de todas essas descobertas empolgantes, os mecanismos que controlam a redução de lipídios induzida pelo CLA ainda não foram totalmente elucidados.

3. CLA na regulação da função da membrana celular

A membrana celular envolve a célula, delimitando e mantendo as diferenças entre o citosol e a matriz extracelular. Dentro das células eucarióticas, as membranas do núcleo, retículo endoplasmático, aparelho de Golgi, mitocôndrias e outras organelas delimitadas por membrana mantêm suas propriedades físico-químicas, bem como a fisiologia⁽³⁶⁾. Essa estrutura é formada por uma bicamada lipídica (fosfolipídios, glicolipídios e esteróis) e proteínas, desempenhando papel central em seu funcionamento⁽³⁷⁾. Durante a criopreservação, os cristais de gelo intracelular podem romper a membrana plasmática e liberar componentes celulares⁽³⁸⁾. A incorporação de ácidos graxos na dupla camada fosfolipídica da membrana plasmática altera sua fluidez e, consequentemente, pode interferir no metabolismo celular⁽³⁹⁾. Os componentes presentes nos meios de cultura in vitro podem levar ao acúmulo de lipídios e seu conteúdo excessivo causaria alterações na membrana plasmática, como alterações na fluidez e funções⁽³⁴⁾, indicando uma correlação positiva entre a fluidez da membrana e a tolerância ao congelamento. Essas modificações ocorrem principalmente em razão das mudanças na expressão de genes relacionados à adipogênese⁽⁴⁰⁾. Um dos principais efeitos da suplementação de CLA na criopreservação embrionária é a redução da expressão de enzimas, causada por agentes químicos responsáveis pela catálise de triglicerídeos, reduzindo a exposição lipídica nas células embrionárias⁽⁶⁾. Além disso, Leite et al.⁽⁴¹⁾ propuseram que a adição de CLA no meio de cultura pode afetar a digestão enzimática da zona pelúcida, alterando a taxa de eclosão dos embriões.

A suplementação dos isômeros cis-9, trans-11 e trans-10, cis-12 altera o perfil lipídico de embriões bovinos, reduzindo o acúmulo de gotículas lipídicas⁽⁴²⁾. O isômero trans-10, cis-12 atua na absorção de ácidos graxos livres sem aumentar a lipólise, na incorporação do CLA na bicamada lipídica da membrana da célula embrionária, aumentando a fluidez da membrana ^(6,42,43) e, consequentemente aumentando a resistência à criopreservação.

4. Efeito da suplementação com CLA na criopreservação do sêmen

A espermatogênese é um processo biológico complexo em que uma célula germinativa diplóide (espermatogônias), após divisões mitóticas em série, dá origem a células germinativas haplóides. Essas espermátides se diferenciam gradativamente em espermatozóides que, após a espermiação, são liberados no lúmen dos túbulos seminíferos. Esses espermatozóides são transportados passivamente para o epidídimo, onde adquirem motilidade, em um processo denominado maturação espermática⁽⁴⁴⁾. Morfologicamente, os espermatozóides são divididos em cabeça (acrossomal e pós-acrossomal) e cauda⁽⁴⁵⁾. A cauda do gameta masculino é composta pelo pescoço, peça intermediária principal e terminal⁽⁴⁶⁾. A membrana plasmática é responsável por envolver todos os componentes dos espermatozóides e é composta por camadas de lipídios e proteínas, como as que contêm fosfolipídios, colesterol, glicolipídios e diferentes tipos de proteínas⁽⁴⁷⁾. A composição lipídica da membrana plasmática do espermatozóide desempenha um papel importante nas alterações fisiológicas que levam à fertilização, além de afetar a resposta dos espermatozóides ao resfriamento e congelamento⁽⁴⁸⁾. Essa composição lipídica na membrana pode ser manipulada tanto in vivo como in vitro.

As diferenças na congelabilidade de espécies dos espermatozóides em touros são em parte atribuíveis ao conteúdo de ácidos graxos poliinsaturados (PUFA) de sua membrana plasmática⁽⁴⁹⁾. Nesse sentido, foi demonstrado que a suplementação alimentar com uma ampla variedade de suplementos de PUFA pode alterar o perfil de ácidos graxos do esperma. Estudos com carneiros ^(50,51,52), touros ^(53,54), aves e javalis ^(55,56) sugeriram benefícios após a suplementação dietética de PUFA em alguns parâmetros. Como outros ácidos graxos poliinsaturados, o CLA pode ser incorporado aos fosfolipídios da membrana e também realizar efeitos biológicos, como demonstrado no caso dos ácidos graxos ômega-3⁽⁵⁷⁾. No entanto, usando o coelho como modelo experimental, Abdelatty et al. ⁽⁵⁸⁾ relataram que a suplementação de CLA (uma mistura da mesma proporção dos isômeros cis-9, trans-11 e trans-10, cis-12) a longo prazo pode alterar o potencial reprodutivo dos machos, especialmente se alimentados com uma dose superior a 0,5 %. Nesse estudo, os autores observaram que a suplementação com 1% de CLA diminui a motilidade espermática e a motilidade progressiva, além de diminuir a concentração testicular de L-carnitina e α-tocoferol. Essa diminuição na quantidade de antioxidantes no testículo foi associada ao aumento da apoptose nas células da espermatogônia, nos túbulos seminíferos nos grupos tratados com CLA.

Resultado semelhante também foi observado por Karimi et al.⁽⁵⁹⁾ em touros holandeses. Avaliando o efeito da suplementação de CLA na dieta sobre a qualidade e congelabilidade dos espermatozóides, os autores não observaram o efeito do CLA no volume do sêmen, concentração e produção total de esperma (p> 0,05). No entanto, a proporção de espermatozóides com morfologia anormal no sêmen fresco aumentou significativamente (p <0,05) no grupo alimentado com CLA em comparação com o grupo controle. Além disso, no grupo alimentado com CLA, a proporção de espermatozóides pós-descongelamento com morfologia anormal na semana 10 do ensaio foi significativamente maior no CLA do que no grupo controle (p <0,05). A motilidade progressiva tendeu a aumentar no grupo alimentado com CLA, embora a suplementação dietética não tenha afetado outros parâmetros CASA ou a viabilidade em espermatozóides frescos e descongelados⁽⁵⁹⁾.

A adição de ácidos graxos em meios de criopreservação do sêmen pode influenciar a motilidade espermática após o descongelamento, possivelmente por manter a fluidez da membrana por causa da sua incorporação em bicamadas lipídicas. Maldjiana et al.⁽⁶⁰⁾ relataram que a presença de lipídios como diluentes para resfriamento e congelamento são essenciais para a troca de componentes em um ambiente extracelular⁽⁶¹⁾. No sêmen ovino, a adição de ácido oléico-linoléico ao meio de criopreservação resultou em um efeito benéfico na preservação da viabilidade das células espermáticas⁽⁶²⁾. Espermatozóides suínos incubados por 4 horas a 37 ºC em meio de diluição contendo ácidos oléico e linoléico demonstraram melhora significativa na motilidade e viabilidade⁽⁶³⁾. O uso do ácido linoléico no meio de criopreservação do sêmen bovino causou melhora na motilidade espermática após o descongelamento, relacionando esse resultado a uma possível manutenção da fluidez da membrana com a incorporação do ácido linoléico pela bicamada lipídica⁽⁶⁴⁾. Segundo Kaeoket⁽⁶⁵⁾, a suplementação de extensores de sêmen com alguns ácidos graxos seria uma estratégia promissora para minimizar as espécies oxidativas de oxigênio e também para proteger a membrana plasmática.

Poucos estudos avaliaram o impacto do CLA na criopreservação de espermatozóides: Soares et al.⁽⁶⁶⁾ demonstraram que o uso dos isômeros do CLA (cis-9, trans-11 e trans-10, cis-12) no meio de diluição de espermatozóides bovinos não causou alterações evidentes na viabilidade e motilidade. Porém, no tratamento com 50 µM de CLA, os espermatozóides apresentaram os maiores valores de velocidade média, além de apresentarem taxa de fertilização satisfatória⁽⁶⁷⁾. Já no tratamento com 100 µM de CLA, foram observados espermatozóides com maior percentagem de membrana íntegra e alto potencial mitocondrial, porém nenhuma dessas diferenças foi significativa⁽⁶⁶⁾.

Mais recentemente, Teixeira et al.⁽⁵⁾ analisaram o uso de CLA 50 µM na criopreservação de sêmen de javalis e não observaram vantagens na viabilidade e integridade espermática pós-descongelamento. Em caso contrário, Karimi et al.⁽⁵⁹⁾ demonstraram que touros da raça holandesa que receberam dieta suplementada com CLA apresentaram aumento da motilidade progressiva dos espermatozóides, mas essa mudança não trouxe benefícios significativos; entretanto, esses autores não observaram nenhuma outra vantagem dessa suplementação em amostras frescas e congeladas/descongeladas. De maneira geral, os dados disponíveis na literatura sobre os parâmetros do sêmen do CLA são inconclusivos, exigindo mais estudos.

5. Efeito da suplementação com CLA na criopreservação de oócitos

Em mamíferos, as células germinativas se desenvolvem rodeadas por células somáticas, formando folículos ovarianos. A foliculogênese ovariana inicia-se durante o desenvolvimento embrionário, uma vez que os folículos primordiais dormentes são ativados e crescem até os folículos ovulatórios, que na ovulação liberam oócitos metafásicos II⁽⁶⁸⁾. Os lipídios presentes nos oócitos são principalmente triacilgliceróis armazenados como gotas lipídicas no citoplasma⁽⁶⁹⁾. Possivelmente, ocorre o acúmulo de lipídios no oócito: (i) aumento da lipogênese, (ii) diminuição da oxidação de gordura beta e (iii) aumento da captação de colesterol da matriz extracelular ou meio de cultura. De acordo com Baumgard et al.⁽³¹⁾, o CLA diminui os lipídios por regulação negativa das enzimas lipogênicas e também reduz os níveis das enzimas utilizadas no consumo das gorduras circulantes⁽⁷⁾.

A demanda pela preservação da fertilidade das mulheres tem aumentado ao longo dos anos, principalmente por causa das mudanças socioeconômicas que levaram ao adiamento usual da gravidez. Além disso, o número crescente de diagnósticos de câncer infantil em idade não reprodutiva e as melhorias nos tratamentos do câncer afirmam a necessidade de preservar os gametas infantis para serem usados após a remissão do câncer. Para preservação da fertilidade feminina, a criopreservação de oócitos seria a melhor opção⁽⁷⁰⁾, porém, devido às suas características morfológicas, principalmente em razão do tamanho do oócito, sua criopreservação é altamente dificultada e menos eficiente quando comparada à criopreservação de embriões e espermatozóides⁽⁷¹⁾.

Além disso, a criopreservação de oócitos é muito interessante para todas as espécies animais, especialmente para fins zootécnicos. Nos últimos anos, alguns avanços foram alcançados nesse campo, aumentando a sobrevida oocitária após a criopreservação, entretanto os protocolos atuais ainda são ineficientes. Os gametas femininos são células grandes, com uma taxa de área/superfície da membrana reduzida. Assim, a formação de cristais de gelo durante a criopreservação ocorre com maior frequência, resultando em morte celular após o descongelamento. Além disso, o estresse de criopreservação modifica a zona pelúcida ou o ooplasma, ocasionando danos estruturais e funcionais⁽⁷²⁾. Ademais, as propriedades da membrana afetam o fluxo da água e dos crioprotetores, tornando o processo ainda mais difícil e às vezes inviável⁽⁷³⁾. A conformação lipídica de embriões e oócitos ainda é considerada um parâmetro de qualidade e criotolerância, principalmente porque os principais danos relacionados à criopreservação ocorrem por causa das modificações da membrana ou lipídios intracelulares⁽⁷⁴⁾. Já se sabe que os oócitos bovinos são mais resistentes à criopreservação em comparação com outras espécies de mamíferos investigadas, e alguns autores sugeriram que isso se deve às suas diferenças na composição lipídica⁽⁷⁵⁾. Mesmo em bovinos, a diferença entre as raças é notável, como o número de gotículas citoplasmáticas e a competência oocitária⁽⁷⁶⁾. Aardema et al.⁽⁷⁷⁾ observaram que a suplementação de gordura em meio de cultura in vitro, como o ácido linoléico, tem efeitos positivos na maturação oocitária, desenvolvimento de blastocistos e aumento da tolerância à criopreservação de oócitos bovinos. Ferreira et al.⁽⁷⁸⁾ sugeriram que o controle de qualidade dos meios de cultura in vitro é relevante para a compreensão dos processos de criopreservação.

Em 2011, Lapa et al.⁽⁴⁾ estudaram o efeito do CLA na maturação do oócito e na composição lipídica dos complexos cumulus-oócito (COCs). Eles não observaram diferenças significativas na maturação ou nas taxas de produção de embriões. Por outro lado, a maturação do oócito em meio suplementado com CLA (100 mM) levou a um maior número de embriões com melhor qualidade no dia 8, em comparação com o grupo controle (7,7 ± 3,3 a 0,0 ± 0,0 com muito boa qualidade e 32,2 ± 5,7 a 23,1 ± 7,4 com boa qualidade, respectivamente). Consequentemente, esse achado indica que o ambiente de maturação tem uma influência importante na capacidade do oócito de gerar embriões saudáveis com a capacidade de atingir níveis mais avançados de desenvolvimento e, em última instância, que a suplementação de CLA nesse estágio modula o metabolismo energético do oócito e melhora a criotolerância do embrião.

Estudos realizados por Matos et al.⁽⁷⁹⁾ investigaram o efeito do CLA na competência do desenvolvimento do oócito após exposição a crioprotetores seguida ou não de vitrificação e aquecimento. Eles observaram que a suplementação de CLA melhorou as taxas de sobrevivência dos oócitos após a vitrificação, bem como as taxas de clivagem, provavelmente devido à redução dos danos. Eles também propuseram que a permeabilidade da membrana de ambos, água e crioprotetores, seria influenciada pela presença de CLA e, dessa forma, foi demonstrado que oócitos bovinos maturados em meio com CLA são mais resistentes ao estresse osmótico, reduzindo o dano celular. Além disso, esses oócitos apresentaram uma taxa reduzida de influxo de crioprotetores (E.G. e DMSO 10%), o que também pode ser responsável pela melhoria da qualidade dos embriões. Juntos, esses achados indicam que além da modulação do fluxo de água e crioprotetores através da membrana celular, a suplementação de CLA melhora a viabilidade do oócito pós-congelamento, o que fornece uma ferramenta promissora para a preservação da fertilidade feminina.

6. Efeito da suplementação com CLA na criopreservação de embrião

O acúmulo lipídico está associado à perda da viabilidade embrionária e ao aumento das lesões causadas pela criopreservação, principalmente nos estágios iniciais do desenvolvimento embrionário⁽⁸⁰⁾. Leite et al.⁽⁴¹⁾ avaliaram que a suplementação dos meios de cultura com o isômero do ácido linoléico conjugado trans-10, o cis-12 reduziu a deposição de lipídios intracitoplasmáticos em células embrionárias. De acordo com estudos de Pereira et al.⁽⁶⁾, a adição de CLA no meio de cultura leva à redução da expressão de enzimas que participam da síntese de ácidos graxos, como a acilglicerol 3-fosfato aciltransferase responsável por catalisar a síntese de triglicerídeos, resultando, consequentemente, na redução da deposição de lipídios em células embrionárias.

Os embriões produzidos in vitro (PIV) são mais sensíveis ao congelamento convencional ou vitrificação do que os in vivo, tornando este um dos principais obstáculos para a expansão da tecnologia de criopreservação ^(81,82,83). A criotolerância reduzida de embriões PIV, especialmente aqueles cultivados em meio suplementado com soro fetal bovino (SFB), foi correlacionada a um acúmulo excessivo de gotículas de lipídios ao longo do desenvolvimento embrionário in vitro ^(84,74,4). Os triacilgliceróis correspondem à maioria dos lipídios intracelulares encontrados em oócitos e embriões ^(69,85,86) e, enquanto em embriões bovinos in vivo os triacilgliceróis representam 40-50% da massa lipídica total, em embriões in vitro podem chegar a 88% ⁽⁸⁶⁾. A fim de evitar o acúmulo indesejável de lipídios, vários estudos têm tentado substituir o SFB no meio de cultura⁽⁸⁷⁾. Apesar de seus efeitos prejudiciais sobre a qualidade embrionária⁽⁸⁸⁾, SFB contém substâncias necessárias para o desenvolvimento embrionário, como ácidos graxos, aminoácidos, vitaminas, quelantes de metais pesados​e fatores de crescimento⁽⁸⁹⁾ e, portanto, a dificuldade de evitar ou encontrar um adequado substituto para SFB na preparação de meio de cultura PIV⁽⁴²⁾.

Nesse contexto, para o sucesso da criopreservação de embriões, melhores técnicas de criopreservação devem ser desenvolvidas, ou mudanças na composição molecular dos meios de cultura de embriões devem ser feitas. A otimização da criotécnica tem apresentado sucesso limitado, enquanto as mudanças nos sistemas de produção in vitro se mostram mais promissoras, com a produção de embriões mais criotolerantes e de melhor qualidade⁽⁸⁴⁾. Estudos emergentes encontraram moléculas capazes de modular mecanismos moleculares que inibem a captação de lipídios pelas células. Uma das moléculas mais promissoras é o CLA, que atua especificamente nos adipócitos, reduzindo a captação de ácidos graxos sem aumentar a lipólise ^(90,91). A suplementação de meio contendo soro para cultura embrionária com CLA trans-10, cis-12 aumentou a taxa de criossistência de blastocisto em 24 horas após a cultura pós-aquecimento⁽⁶⁾. Embriões bovinos produzidos in vitro em meio contendo CLA também demonstraram maior resistência à micromanipulação e criopreservação. Além disso, a adição de CLA trans-10, cis-12 ao meio de cultura não afetou a taxa de clivagem, a proporção sexual dos embriões, a qualidade ou o desenvolvimento do estágio de blastocisto e reduziu significativamente o acúmulo de lipídios⁽⁶⁾. Em contraste, Dias et al.⁽⁹²⁾ avaliaram a inclusão do CLA na cultura in vitro de embriões bovinos e observaram que não foi capaz de melhorar a resposta embrionária ao utilizar o método de congelamento lento.

Recentemente, Batista et al.⁽⁷⁾ avaliaram os efeitos do CLA trans-10, cis-12 no desenvolvimento e criotolerância de embriões mestiços produzidos in vitro. Naqueles embriões cultivados em meio contendo CLA, houve redução da expressão gênica da enzima 1-acilglicerol 3-fosfato o-aciltransferase (AGPAT), resultado que foi associado a outros achados, como a redução do teor de lipídios. No entanto, uma possível melhora na criotolerância embrionária em resposta ao CLA não foi confirmada pelas taxas de eclosão. Esses achados sugerem que a redução do acúmulo de lípidos intracitoplasmáticos causado pelo CLA, independentemente de ter efeito benéfico na reexpansão após a criopreservação, ainda não foi suficiente para proteger o embrião dos efeitos deletérios da criopreservação⁽⁷⁾.

7. Efeitos da suplementação dietética com CLA na fertilidade

O ácido linoléico é um nutriente necessário para o crescimento e reprodução de não ruminantes, e é um suplemento importante que tem uma ligação direta entre o balanço energético pós-parto e a fertilidade subsequente ^(93,94). Estudos de Castañeda-Guitiérrez et al.⁽⁹⁵⁾ descreveram que, em vacas leiteiras, a suplementação com CLA trans-10 cis-12 aumentou os níveis de estradiol, androstenediona e IGF-I, fatores importantes que suportam a foliculogênese. Da mesma forma, Taylor et al.⁽⁹⁶⁾ mostraram melhor desempenho de fertilidade 12 semanas antes da lactação e Darwash et al.⁽⁹⁷⁾ observaram uma forte correlação entre o tempo da primeira ovulação e o tempo de concepção de vacas leiteiras suplementadas com CLA. Uma das ações benéficas mais conhecidas do CLA é mitigar o balanço energético negativo pós-parto ^(98,99). Além disso, o CLA também seria importante para evitar o nascimento prematuro, uma vez que ativa as metaloproteinases, inibindo suas funções, o que previne a ruptura prematura das membranas fetais e o nascimento prematuro⁽⁹⁹⁾. Rodney et al.⁽¹⁰⁰⁾ e Rodney et al.⁽¹⁰¹⁾, em uma meta-análise, observaram que as gorduras individuais não têm a capacidade de aumentar a fertilidade, mas a investigação do uso do CLA mostrou resultados positivos, porém o número de estudos ainda é insuficiente. Veth et al.⁽⁹⁹⁾ avaliaram estudos que indicaram redução no tempo de prenhez, de 151 para 117 dias, quando vacas foram suplementadas com CLA protegido no rúmen. Abolghasemi et al.⁽¹⁰²⁾ sugerem que a dieta enriquecida com CLA tem efeitos benéficos, como redução da expressão do receptor endocanabinóide (CNR2) e enzimas que sintetizam amidas de ácidos graxos (NAPEPLD), além de aumento de PTGS2, resultando em aumento da progesterona plasmática e medições durante o início da lactação. Oliveira et al.⁽¹⁰³⁾ suplementaram vacas com CLA 18 dias antes do parto e observaram que a gordura sérica e o β-hidroxibutirato foram reduzidos nos dias 1 e 7 pós-parto, resultando em menor prevalência de hipercetonemia no 14º dia pós-parto. Chandler et al.⁽¹⁰⁴⁾ observaram que vacas primíparas, quando suplementadas com CLA, apresentaram tendência a aumentar a taxa de concepção no primeiro serviço, levando também a um menor intervalo de partos, corroborando estudos realizados por Gutiérrez et al.⁽¹⁰⁵⁾ Csillik et al.⁽¹⁰⁶⁾ investigaram o uso de CLA em vacas leiteiras multíparas de alta produção e observaram um aumento na P4 pós-ovulatória, um aumento na fertilidade com uma redução no período do parto até a concepção, um aumento nos níveis plasmáticos de IGF-1 e leptina. Os lipídios presentes na dieta são cruciais para a formação da membrana plasmática dos espermatozoides⁽¹⁰⁷⁾, entretanto os estudos em machos são muito limitados. Abdelatty et al.⁽⁵⁸⁾ sugerem que a suplementação com CLA em doses superiores a 0,5% por longo prazo em coelhos machos não é benéfica. Apesar de surtir efeitos benéficos no crescimento, não equilibra os efeitos negativos da fertilidade. Zamora-Zamora et al.⁽¹⁰⁸⁾ avaliaram a inclusão de CLA na dieta a 1% de javalis e não observaram diferenças quanto às características do sêmen e perfil de ácidos graxos dos espermatozóides. No geral, a suplementação da dieta com CLA seria uma estratégia importante para melhorar o desempenho reprodutivo de mamíferos domésticos e é um campo que requer mais investigações.

Conclusão

A função do CLA na criopreservação é exercida por dois mecanismos: i) modulação do perfil lipídico da membrana e ii) quantidade de lipídios intracelulares. Adicionalmente, os efeitos da suplementação de CLA na criotolerância de espermatozóides, oócitos e embriões são resumidamente compilados na tabela 1. Na criopreservação de espermatozóides, a evidência sugere que o CLA modula a função espermática principalmente pela modulação do perfil lipídico na membrana. No entanto, os efeitos sobre a criopreservação de espermatozóides são mínimos ou mesmo negativos, especialmente quando suplementados na dieta. Em oócitos e embriões, as evidências sugerem que o CLA atua tanto no nível do perfil lipídico da membrana quanto na quantidade de lipídios intracelulares. Nessas células, as informações da literatura demonstram um efeito benéfico desses ácidos graxos na criopreservação. A suplementação de CLA em oócitos, durante a maturação in vitro ou criopreservação, melhorou tanto a viabilidade após o congelamento quanto sua competência de desenvolvimento, representando uma estratégia muito promissora para a produção de embriões mais criotolerantes. Por outro lado, a diminuição do conteúdo lipídico intracitoplasmático observada em embriões cultivados em meio contendo CLA e seu efeito positivo na sobrevivência do embrião após a criopreservação abrem novos caminhos na produção de embriões e criobiologia. Finalmente, mais estudos são necessários para avaliar os efeitos do CLA na criopreservação de gônadas, oócitos, espermatozóides e embriões.

Tabela 1
Compilação dos principais resultados publicados sobre a criopreservação na linha germinativa e embriões utilizando a suplementação com CLA

Referência	Espécime	Espécie	Procedimento de criopreservação	Taxa de viabilidade pós criopreservação	Principais achados
Leão et al., 2003	Embrião	Bovino	Vitrificação-100 µM 9c,11t e 10t,12c CLA	A suplementaçào com produção in vitro de CLA aumentou a sobrevivência dos embriões vitrificados e descongelados após 3 horas (80,0%) em comparação com o controle (63,8%).	A suplementaçào da mídia com CLA cis-9 e trans-,11- e trans-10. cis-12 durante IVM e IVC aumentou a taxa de sobrevivência embrionária após o aquecimento.
Pereira et al., 2003	Embrião	Bovino	Vitrificaçào -100 µM 10t, 12c CLA	A adição do isómero trans-10, cis-12 na cultura de embnào aumentou a taxa de viabilidade pós congelamento (68,6% / 27,4%).	Os meios contendo CLA diminuíram a deposição de lipídios citoplasmáticos do embrião e melhoraram a resistência do embrião à micromanipulação e cnopreservação.
Soares et al, 2013	Espermat ozóide	Bovino	Convencional 50µM, 100µM, 150µM9c, 11t and 10t, 12c CLA	Não foi observada diferença entre os tratamentos.	O uso do CLA no meio de diluição de espermatozóides bovinos apresentou os maiores valores de velocidade média em 50 pM e maior porcentagem de ingestão de membrana em 100 µM.
Batista et al., 2014	Embrião	Bovino	Convencional - 100 µM 10t, 12c CLA	Aumento na taxa de reexpansão de embnões cultivados com CLA trans-10, cis-12 quando comparados ao controle (56.3 vs. 34.4%). Entretanto, a diferença não foi observada na taxa de incubação (16.5 vs. 14.0%).	O mecanismo pelo qual o trans- 10, cis-12 CLA reduz o teor de lipídios neutros de embriões produzidos in vitro envolve uma regulação negativa na expressão da enzima 1-acilglicerol-3-fosfato 0-aciltransferase.
Absalón- Medina et al. 2014	Embrião	Bovino	Vitrificação - 9c,11t e 10t, 12c foram testadas a altas(50, 100, and 200 µM) e baixas (15 and 25 µM) concentrações	Maior taxa de sobrevivência após aquecimento e maior contagem de blastômeros.	Embriões cultivados em meio contendo CLA apresentaram maiores taxas de sobrevivência após a criopreservação.
Matos et al., 2015	Oócito	Bovino	Maturação - 100 µM 10t, 12c CLA- Vitrificação EGIDMSO 10%,	Aumento no desenvolvimento da vitnficaçào/aquecimento. Redução da permeabilidade da membrana (37% - 42%).	A suplementaçào de CLA melhora a viabilidade do oócito pós-congelamento.
Teixeira et al., 2017	Espermat ozóide	Suíno	Convencional - 50µM 10t, 12c	Redução significativa da viabilidade após congelamento e descongelamento.	Não foram observadas vantagens sobre a viabilidade e integridade dos espermatozóides pós-descongelamento.
Karimi et al., 2017	Espermat ozóide	Bovino	Convencional - 5g por gavagem com 9c, 11t and 10t, 12c CLA	Baixas taxas em ambos os tratamentos nas semanas 6 e 8, com recuperação na semana 10.	A suplementaçào de CLA nào altera a motilidade progressiva dos espermatozóides em amostras frescas e congeladas / descongeladas.
Carvalho et al., 2019	Embrião	Bovino	Vitrificação-100 µM 10t, 12c CLA	Aumento nas taxas de incubação quando adicionado ao período de crescimento.	A suplementaçào de CLA promove a redução dos níveis de lipídios e melhora a chorresistência.
Dias et al., 2020	Embrião	Bovino	Congelamento lento -100 µM 10t, 12c CLA	Redução na taxa de blastocistos com taxa de reexpansâo de 43%.	O CLA durante o cultivo in vitro não foi capaz de melhorar a produção de embnões e a resposta à criopreservação.

Agradecimentos

Este trabalho teve o apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasil) e da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG, Brasil). DSF, GAGL, BRN e LAACP receberam bolsa do CNPq, CAPES e FAPEMIG. Os autores também agradecem ao Prof. Dr. Paulo César Pinheiro (DCNAT-UFSJ) pela revisão da versão em língua Inglesa do artigo.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  29 Jan 2021
• Data do Fascículo
  2020

Histórico

• Recebido
  22 Maio 2020
• Aceito
  06 Ago 2020
• Publicado
  20 Out 2020