Padronização de um teste imunoenzimático para detecção de Salmonella em alimentos

Standardization of an enzyme immunoassay for detection of Salmonella in foods

Padronização de um teste imunoenzimático para detecção de Salmonella em alimentos

Standardization of an enzyme immunoassay for detection of Salmonella in foods

Regina Baptista dos Reis^I,*; Elsa M. Mamizuka^II; Bernadette Dora Gombossy de Melo Franco^III

^IUniversidade Federal do Mato Grosso – Faculdade de Enfermagem e Nutrição –Departamento de Ciência, Tecnologia de Alimentos e Nutrição Básica – Av. Fernando Correia da Costa s/n – CEP 78068-900 – Cuiabá – MT – Brasil

^IIUniversidade de São Paulo – Faculdade de Ciências Farmacêuticas –Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas

^IIIUniversidade de São Paulo – Faculdade de Ciências Farmacêuticas – Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental

RESUMO

A metodologia convencional utilizada para detecção de Salmonella em alimentos é trabalhosa, apresenta custo elevado e os resultados definitivos somente estão disponíveis após 96 horas. Vários métodos rápidos têm sido propostos, sendo os testes imunoenzimáticos os mais empregados. Este estudo relata o desenvolvimento de um teste imunoenzimático para detecção de Salmonella em alimentos, empregando-se um anti-soro policlonal monovalente contendo aglutininas f,g,s, não absorvido, e um anti-soro polivalente absorvido contendo as aglutininas e,h; 1,6; i; 1,2; f,g,s e m,t. A eficiência foi comparada com a da metodologia de cultivo tradicional. O teste imunoenzimático foi empregado para a detecção de Salmonella em amostras de alimentos infantis experimentalmente inoculadas com este patógeno e com outras enterobactérias, em diferentes proporções. O teste imunoenzimático revelou-se significativamente mais sensível que o método de cultivo. Esse mesmo teste, utilizando-se o anti-soro f,g,s não absorvido com antígenos heterólogos revelou concordância de 89,6% com o método de cultivo e sensibilidade de 100,0%. Por outro lado, empregando-se o anti-soro polivalente absorvido, a concordância com o método de cultivo foi de 81,3% embora a sensibilidade tenha se mantido no mesmo nível. O desempenho do teste imunoenzimático empregando-se um desses dois anti-soros indica um grande potencial de aplicação como método de triagem na detecção de Salmonella em alimentos.

Palavras-chave: detecção; Salmonella; teste imunoenzimático; alimentos.

SUMMARY

The conventional method for detection of Salmonella in foods is cumbersome, it is not cost-effective and results are available only after 96h. Many alternative rapid methods have been already proposed and enzyme immunoassays are the most common. This study reports the standardization of a new enzyme immunoassay for detection of Salmonella in foods, based on a policlonal non-absorbed antiserum containing f,g,s aglutinins and a pool of policlonal absorbed antisera, containing e,h; 1,6; i, 1,2, f,g,s and m,t aglutinins. The efficiency of the new assay was compared to that of the conventional method. The immunoassay was used for detection of Salmonella in baby-foods experimentally contaminated with different proportions of Salmonella and other enterobacteria. The sensitivity of the new assay was significantly higher than that of the conventional method. The agreement between the assay using the non-absorbed f,g,s antiserum and the conventional method was 89.6% and the sensitivity was 100.0%. When the pool of absorbed antisera was used, the agreement between results was 81.3% and the sensitivity 100.0%. Results indicate that this immunoassay has a good potential to be used as an alternative method for screening Salmonella in foods.

Keywords: detection; Salmonella ; enzyme immunoassay; foods.

1 – INTRODUÇÃO

A Salmonella é uma enterobactéria que pode causar graves infecções gastrointestinais de origem alimentar, o que torna sua presença em alimentos um relevante problema de saúde pública. No Brasil, sua ocorrência tem sido observada em todos os tipos de alimentos, principalmente os de origem animal [5, 14, 23].

Em função dos riscos que a Salmonella representa para os consumidores, sua pesquisa em alimentos é de fundamental importância. Os produtores de alimentos, bem como os órgãos competentes de fiscalização, têm estado alertas para a necessidade de garantir a ausência de Salmonella nos alimentos. Entretanto, essa garantia pode se tornar extremamente onerosa, uma vez que as técnicas laboratoriais rotineiramente empregadas são extremamente trabalhosas e demoradas no fornecimento de resultados. Segundo o BACTERIOLOGICAL ANALYTICAL MANUAL [2], as técnicas convencionais para detecção de Salmonella em alimentos geralmente envolvem as seguintes etapas: pré-enriquecimento, enriquecimento seletivo, isolamento em meios seletivos sólidos e identificação completa das colônias por meio de testes bioquímicos e sorológicos.

O grande número de etapas necessárias nas técnicas convencionais de análise e o longo tempo para obtenção de resultados são os principais motivos para o desenvolvimento de um número grande de novas técnicas para pesquisa de Salmonella em alimentos, tendo por objetivos principais a redução do tempo de análise, a simplificação do trabalho laboratorial e a redução do custo da análise. Muitas delas visam ainda uma vantagem adicional que é o aumento na precisão dos resultados [4].

Nos últimos anos, várias técnicas para detecção rápida de Salmonella foram propostas e dentre elas destacam-se as técnicas imunológicas, baseadas em reações antígeno-anticorpo. Entre essas técnicas, destacam-se as imunoenzimáticas que empregam anticorpos marcados com uma enzima cromogênica [27]. As técnicas imunoenzimáticas podem empregar anticorpos policlonais e também monoclonais [20, 21, 22].

A técnica imunoenzimática é totalmente dependente da especificidade da reação antígeno-anticorpo e tentativas anteriores de planejar métodos imunoenzimáticos específicos para Salmonella usando misturas de anticorpos policlonais produziram muitos resultados falso-positivos devido à presença de componentes comuns em enterobactérias que reagem de forma cruzada [19].

O desempenho de anticorpos policlonais para detecção de Salmonella em alimentos pela técnica imunoenzimática foi avaliado por FELDSINE, FALBO-NELSON, HUSTEAD [12, 13]. Esses autores demonstraram que o anti-soro policlonal foi capaz de detectar todos os sorotipos de Salmonella nas amostras de alimentos inoculadas experimentalmente, demonstrando a sua alta sensibilidade e especificidade para antígenos somáticos e flagelares de Salmonella.

Quanto aos anticorpos monoclonais, embora altamente específicos, apresentam o inconveniente de não reagirem com alguns dos sorotipos de Salmonella, levando a resultados falso negativos [8, 16, 18, 27, 28, 29].

Recentemente, REIS, MAMIZUKA, FRANCO [24] propuseram um esquema de produção de anticorpos policlonais de obtenção simples e barata, que foram empregados na padronização de uma técnica imunoenzimática, utilizando-se culturas puras de vários sorotipos de Salmonella e de outras enterobactérias. A técnica imunoenzimática proposta apresentou um alto potencial de utilização para pesquisa de Salmonella em alimentos. O presente trabalho foi conduzido com o objetivo de avaliar essa técnica imunoenzimática quanto à sensibilidade em relação ao método convencional de pesquisa de Salmonella em alimentos e também estudar a viabilidade de sua utilização para detecção de Salmonella em alimentos artificialmente contaminados.

Para reduzir ao mínimo a interferência da microbiota naturalmente presente nos alimentos no desempenho do teste imunoenzimático, o trabalho foi conduzido com alimentos infantis industrializados ("baby foods").

2 – MATERIAL E MÉTODOS

2.1 – Contaminação experimental das amostras de alimento

As cepas de Salmonella e de enterobactérias utilizadas na contaminação experimental das amostras de alimentos, adquiridas na Seção de Coleção de Culturas do Instituto Adolfo Lutz (IAL), São Paulo, no Laboratório Fleury (LF), São Paulo e na Faculdade de Medicina Veterinária – USP (FMVZ-USP) foram: S. anatum (IAL, sem código), S. typhimurium (IAL, sem código), S. agona (IAL 642), S. montevideo (IAL 359/94), S. dublin (LF), S. derby (LF), S. madelia (LF), S. havana (IAL 416/94), S. newport (IAL 459/94) e S. gallinarum (FMVZ-USP), Citrobacter freundii (IAL ATCC 8090), Enterobacter aerogenes (IAL ATCC 4280), Escherichia coli (IAL 1872), Providencia alcalifaciens (IAL 9886 7/86), Proteus mirabilis (IAL 1022) e Serratia liquefaciens (IAL 1488 CDC 2126 9/86). Para a obtenção das culturas de S. typhimurium e S. anatum nas duas fases separadamente, utilizou-se o meio de fase reversa, conforme recomendado por EWING [11].

Cada microrganismo foi inoculado em 5mL de caldo soja tripticase (TSB–Difco) e incubado a 37ºC por um período que variou de 18 a 24 horas. Após esse período, as culturas foram submetidas à diluições decimais sucessivas em solução salina 0,85% estéril, semeando-se 0,1mL na superfície de placas contendo ágar tripticase soja, com auxílio da alça de Drigalsky. As placas foram incubadas a 37ºC por 18 a 24 horas para determinação do número de Unidades Formadoras de Colônias/mL (UFC/mL). De acordo com as contagens obtidas, as culturas de Salmonella em caldo tripticase soja que haviam sido mantidas a 4ºC foram diluídas em solução salina 0,85% estéril de forma a se obter soluções contendo 1UFC/mL, 10UFC/mL, 10²UFC/mL e 10³UFC/mL. Após as contagens emUFC/mL das enterobactérias individuais não pertencentes ao gênero Salmonella, preparou-se um "pool" contendo 10⁴UFC/mL.

Nos testes de contaminação experimental, foram empregadas 156 amostras de alimento infantil industrializado ("baby-food"), composto por: carne, cenoura, batata e mandioquinha, coletadas em supermercados da cidade de São Paulo. Esse número de amostras foi calculado em função do número de sorotipos de Salmonella (12) a serem testados, além do "pool" das enterobactérias, em quatro concentrações diferentes, utilizando-se as metodologias tradicional de cultivo e imunoenzimática, em triplicata.

O procedimento de contaminação experimental foi o seguinte: 25g de cada amostra foram transferidas para um saco plástico esterilizado, adicionando-se 1mL de uma das 12 culturas de Salmonella sp. e 1mL do pool de enterobactérias, para obtenção das combinações descritas na Tabela 1. Cada experimento foi repetido três vezes.

2.2 – Pesquisa de Salmonella nas amostras inoculadas artificialmente pelo método convencional de cultura

A uma porção de 25g do alimento artificialmente contaminado adicionou-se 225mL de água peptonada tamponada (APT), segundo ICMSF [17] e incubou-se a 37ºC por 18 a 24 horas. Alíquotas de 1,0mL e de 0,1mL do caldo de pré-enriquecimento foram transferidas para caldos tetrationato (TT – Difco) e Rappaport-Vassiliadis (RV formulado), respectivamente. A formulação do caldo RV foi feita de acordo com o BACTERIOLOGICAL ANALYTICAL MANUAL [2]. Esses caldos foram incubados a 42ºC em banho-maria por 6 horas, correspondendo à etapa de enriquecimento seletivo [9].

Com uma alça de níquel-cromo, cada meio de enriquecimento seletivo foi semeado em um tubo contendo caldo M (Difco) adicionado de 10mg/mL de novobiocina (Sigma). Estes caldos foram incubados a 42ºC em banho-maria por 6 horas, correspondendo à etapa de pós-enriquecimento [9].

A partir de cada caldo de enriquecimento seletivo (TT e RV) e de pós-enriquecimento (M/TT e M/RV), semeou-se placas contendo água Hektoen Enteric (HE – Oxoid) e ágar Rambach (RAM – Merck) e incubou-se a 37ºC durante 18 a 24 horas.

Duas a três colônias típicas de Salmonella nos meios HE e RAM foram transferidas para tubos contendo ágar TSI (tríplice açúcar e ferro – Oxoid) e ágar LI (lisina e ferro – Oxoid) e incubados a 37ºC durante 18 a 24 horas. Colônias que apresentaram comportamento bioquímico característico de Salmonella foram submetidas a testes sorológicos de confirmação, utilizando-se soro polivalente somático (Probac do Brasil – Produtos Bacteriológicos Ltda.), pelo teste de aglutinação em lâmina [2].

Cabe ressaltar que, embora na pesquisa de Salmonella pelo método de cultura convencional não sejam adotadas as etapas de pós-enriquecimento em caldo M acrescido de novobiocina com posterior semeadura em meios seletivos diferenciais, essas etapas foram também realizadas para que fosse possível uma comparação adequada entre o teste imunoenzimático e o método de cultivo.

2.3 – Detecção de Salmonella pelo teste imunoenzimático

No teste imunoenzimático foi empregado o anti-soro f,g,s não absorvido e o anti-soro polivalente absorvido ("pool") com antígenos heterólogos, constituído de mistura de soros monovalentes contendo as aglutininas e,h; 1,6; i; 1,2; fgs e m,t.

Para detecção de Salmonella pelo teste imunoenzimático seguiu-se a metodologia de CLARK e ENGVALL [6], ou seja: trabalhando-se com microplacas de titulação de poliestireno (Costar, EUA) transferiu-se para cada uma das cavidades 100ml da cultura nos caldos de enriquecimento TT, RV, M/TT e M/RV de cada uma das diferentes combinações entre Salmonella sp. e "pool" de enterobactérias, como também o "pool" de enterobactérias somente, conforme descrito na Tabela 1. Os testes foram realizados em duplicata (duas cavidades por cultura). As microplacas foram incubadas a 4ºC em recipiente fechado, contendo algodão umedecido para evitar a desidratação dos reagentes (câmara úmida), durante 18 a 24 horas. Em seguida, as cavidades foram lavadas três vezes com PBS-T 0,01M, pH 7,2 (PBS adicionado de Tween 20 a 0,05%) e três vezes com água destilada, utilizando uma lavadora automática de microplacas (Pasteur) e posteriormente bloqueadas com solução de leite desnatado (Molico) a 5% diluído em PBS-T. As placas foram mantidas à temperatura ambiente por 30 minutos. Após nova série de lavagens, adicionou-se a cada uma das cavidades de cada duplicata 100ml do anti-soro f,g,s não absorvido diluído a 1:2.500 em PBS-T. À outra cavidade de cada duplicata, adicionou-se 100ml do "pool" de anti-soros absorvidos que foram preparados conforme descritos por REIS, MAMIZUKA, FRANCO [24]. Seguiu-se então nova incubação de 30 minutos a 37ºC em câmara úmida.

Após lavagens das cavidades como descrito anteriormente, adicionou-se 100ml do conjugado enzimático (anti-IgG-peroxidase, Sigma Chemical Co, EUA) diluído a 1:3000 e a 1:1000 em PBS-T, para reação com o anti-soro f,g,s não absorvido e o "pool" de anti-soros, respectivamente. Procedeu-se em seguida à incubação por 30 minutos a 37ºC em câmara úmida.

Após novas lavagens, adicionou-se a cada cavidade 100ml da mistura cromógena de OPD (Sigma) na concentração de 0,4mg/mL em tampão fosfato-citrato, pH 5,0 e 40ml de peróxido de hidrogênio 30%, deixando-se à temperatura ambiente por 30 minutos para desenvolvimento de cor. A reação foi bloqueada pela adição de 50ml de ácido clorídrico 3N, a cada uma das cavidades. A determinação da densidade óptica (DO) em cada cavidade foi realizada em espectrofotômetro leitor de microplacas (Spectra, EUA) em comprimento de onda de 492nm.

2.4 – Análise estatística

Os resultados de positividade para Salmonella obtidos pelo teste imunoenzimático foram comparados aos obtidos pelo método de cultivo tradicional empregando-se o teste de Qui-quadrado de Mc Nemar, com 5% de significância [3]. Os índices avaliadores do teste (sensibilidade e concordância) foram calculados segundo GALEN e GAMBINO [15].

3 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na avaliação do teste imunoenzimático em alimentos artificialmente contaminados com Salmonella, observou-se que todos os sorotipos de Salmonella inoculados nas amostras de alimentos foram detectados tanto no teste empregando anti-soro f,g,s não absorvido quanto naquele em que foi utilizado o "pool" de anti-soros absorvidos. Verificou-se que a eficiência do teste imunoenzimático depende da etapa do enriquecimento em que é realizado. Assim, quando o teste foi realizado com os caldos de enriquecimento seletivo TT ou RV, houve muitos resultados falso-positivos em amostras contendo apenas o "pool" de enterobactérias empregando o anti-soro f,g,s como o "pool" de anti-soros absorvidos.

A etapa de pós-enriquecimento, feito no caldo M, teve um papel fundamental para a detecção de Salmonella pelo teste imunoenzimático. Todos os testes realizados no caldo M referente aos alimentos inoculados somente com a mistura de enterobactérias foram negativos para Salmonella, enquanto que nos alimentos inoculados com Salmonella e outras enterobactérias com exceção do sorotipo S. typhimurium (nas duas fases), os testes foram sempre positivos, mesmo nas amostras contendo apenas 10UFC/mL de Salmonella.

Deve-se ressaltar que a inclusão da etapa do pós-enriquecimento em caldo M é recomendada em técnicas imunoenzimáticas devido a sua reconhecida capacidade de estimular a formação de flagelos pelas cepas de Salmonella [9]. Além desse efeito, a novobiocina no caldo M, bem como a incubação desse caldo em temperatura elevada, tem inibido o crescimento de interferentes como Proteus sp. [9]. Nesse estudo nas 12 amostras inoculadas somente com a mistura de enterobactérias, os resultados do teste imunoenzimático realizado com o caldo M sempre foram negativos. Esses resultados são concordantes com os encontrados por ECKNER et al. [9], que utilizaram o mesmo procedimento com o caldo M e não encontraram nenhum resultado falso-positivo ao testar 1200 amostras de alimentos artificialmente contaminadas com Salmonella.

A eficiência de anticorpos policlonais para detecção de diferentes sorotipos de Salmonella nos alimentos foi também demonstrada por FELDSINE, FALBO-NELSON, HUSTEAD [12, 13], onde foi verificado que todos os sorotipos de Salmonella que haviam sido inoculados nas amostras de alimentos foram detectados pelos anticorpos preparados por esses pesquisadores.

Quanto aos resultados obtidos pelo método de cultivo, verificou-se que vários resultados foram falso-negativos e ocorreram predominantemente quando a quantidade de Salmonella inoculadas era baixa (1 ou 10UFC/mL). Esses resultados indicam que o método de cultivo tradicional não é eficiente para detectar baixos níveis de Salmonella em alimentos contendo uma significativa microbiota acompanhante. Utilizando o método de cultivo tradicional, na grande maioria dos casos os resultados foram negativos quando a quantidade de Salmonella inoculada era 1UFC/mL mesmo nos caldo M/TT e M/RV

Quando a proporção entre Salmonella e o "pool" de enterobactérias era 1:10⁴, a concordância entre os resultados obtidos pelo método de cultivo tradicional e o método imunoenzimático empregando os dois tipos de anti-soros, um monovalente não absorvido, específico para o antígeno flagelar f,g,s e o outro polivalente, absorvido com antígenos heterólogos, foi apenas 33,3% e 25,9%, respectivamente. Quando a concentração de Salmonella em relação às demais enterobactérias foi mais alta (10:10⁴, 10²:10⁴ e 10³:10⁴) ocorreu uma total concordância entre os resultados obtidos.

Quanto à sensibilidade, tanto o anti-soro f,g,s não absorvido quanto o anti-soro polivalente absorvido apresentaram 100% de sensibilidade, detectando a presença de Salmonella em todas as proporções testadas (Tabelas 2 e 3).

Empregando-se o anti-soro f,g,s não absorvido (Tabela 4) obteve-se 100% de positividade no teste imunoenzimático realizado com os caldos TT e RV. Essa positividade caiu para 94,4% e 96,9% quando o teste foi realizado com os caldo M/TT e M/RV, respectivamente. Já nos testes empregando o "pool" de anti-soros absorvidos (Tabela 5), observou-se que os testes realizados com os caldos TT e RV deram 100% de positividade, enquanto aqueles realizados com os caldo M/TT e M/RV resultaram em 97,1% e 96,9% de positividade.

Os resultados obtidos pelos métodos imunoenzimático e cultivo diferiram significativamente (a< 5%), quando o teste imunoenzimático foi realizado com o anti-soro polivalente. O resultado do teste imunoenzimático realizado no caldo TT foi positivo para todas as amostras contaminadas artificialmente. Já no teste realizado no caldo de enriquecimento RV, nem todas as amostras contaminadas artificialmente deram resultado positivo.

ROBISON, PRETZMAN, MATTINGLY [25], quando empregaram anticorpos monoclonais (MOPC 467) em um teste imunoenzimático indireto para a detecção de Salmonella em alimentos artificialmente contaminados, verificaram que todos foram positivos pelo teste imunoenzimático a partir do caldo M inoculado do caldo TT. ANDERSON e HARTMAN [1], trabalhando com um anti-soro comercial em um teste imunoenzimático indireto para a detecção de Salmonella em alimentos e ração naturalmente contaminados, revelaram que 18% deles foram positivos pelo teste imunoenzimático em caldo M também inoculado de caldo TT.

EMSWILER-ROSE et al. [10] encontraram uma concordância de 100% entre o teste imunoenzimático de duplo anticorpo comercial "Salmonella Bio-Enzabead" e o método de cultivo, quando alíquotas do caldo de pré-enriquecimento (caldo lactosado) e do caldo de enriquecimento seletivo (tetrationato) foram analisadas.

FELDSINE, FALBO-NELSON, HUSTEAD [12] verificaram uma concordância de 97,2% entre o teste imunoenzimático tipo sanduíche, contendo anticorpos policlonais somáticos e flagelares, e o método de cultivo, enquanto em outro estudo empregando os mesmos anticorpos e tipo de teste imunoenzimático, esses mesmos autores [13] encontraram entre os dois métodos uma concordância de 95,6%.

ECKNER et al. [9] encontraram concordância de 96,7% entre o método de cultivo e o teste imunoenzimático comercial "Salmonella-Tek", enquanto CURIALE et al. [7] encontraram concordância de 99,1% entre os dois métodos quando testaram amostras de alimentos naturalmente e artificialmente contaminadas.

SANTOS e ALEIXO [26] verificaram que na análise de alimentos artificialmente contaminados, o teste imunoenzimático indireto empregando soro policlonal somático anti-Salmonella foi capaz de detectar Salmonella em níveis de contaminação entre 1 e 100UFC/25g de carne e na comparação entre as metodologias imunoenzimática e convencional revelou sensibilidade de 91% e concordância de 69%.

4 – CONCLUSÕES

Com base nos resultados obtidos, pode-se concluir que o bom desempenho do teste imunoenzimático, ao empregar o anti-soro policlonal monovalente f,g,s não absorvido ou o anti-soro polivalente absorvido, indica um grande potencial de aplicação na triagem de Salmonella em alimentos, devido à alta sensibilidade do teste e o curto período de tempo requerido para a sua realização, além da possibilidade de automação para análise de grande número de amostras.

5 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

6 – AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à Probac do Brasil Produtos Bacteriológicos pela doação dos animais usados nesse estudo, bem como pelo empréstimo do seu biotério para a imunização dos animais.

Recebido para publicação em 09/03/01. Aceito para publicação em 28/11/01

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A quem a correspondência deve ser enviada.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Dez 2003
• Data do Fascículo
  Ago 2002

Histórico

• Recebido
  09 Mar 2001
• Aceito
  28 Nov 2001