Levedura Pichia kudriavzevii SD5 como biocatalizador na descoloração do corante Preto Reativo 5

Pichia kudriavzevii yeast as biocatalizer in Reactive Black 5

RESUMO

As leveduras vêm apresentando bons resultados na biodegradação de corantes, tornando-se uma alternativa ambientalmente segura e de custo mais baixo para o tratamento de efluentes contendo corantes industriais. Assim, o objetivo deste trabalho foi estudar a descoloração do azo corante Preto Reativo 5 (PR5) pela levedura Pichia kudriavzevii SD5. Para otimização dos parâmetros de descoloração do Preto Reativo 5 foram realizados dois planejamentos experimentais do tipo Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) 2³, sendo cada planejamento composto por 17 ensaios, a 150 rpm durante 24 h. As variáveis estudadas foram pH, temperatura e concentração do corante e tiveram como resposta a porcentagem de descoloração. Também foram realizados testes de toxicidade do sobrenadante após 16 h e 24 h de cultivo, utilizando-se sementes de alface (Lactuca sativa) e o microcrustáceo Artemia salina. Os resultados mostraram que a P. kudriavzevii SD5 é uma levedura tolerante a vários tipos de estresse, uma vez que apresentou capacidade de degradar elevadas concentrações do corante PR5 a 45° C. Entretanto, apenas a temperatura apresentou influência estatisticamente significativa (p < 0,05) na descoloração do PR5. Os bioensaios de toxicidade demonstraram que ocorreu diminuição da toxicidade após 24 h de cultivo, e o perfil de absorbância do sobrenadante apontou para um mecanismo degradativo de descoloração.

Palavras-chave:
fungos; azocorantes; biotoxicidade

ABSTRACT

Yeasts have been showing good results in the biodegradation of industrial dyes, becoming an environmentally safe and cost-effective alternative for the treatment of effluents containing industrial dyes. Thus, the objective of this work was to study the discoloration of the Reactive Black 5 (RB5) azo dye by the yeast Pichia kudriavzevii SD5. Two experimental designs were employed to optimize the discoloration parameters by means of Central Composite Design (CCD) 2³, totalizing 17 trials each, at 150 rpm for 24 h. The studied independent variables were pH, temperature, and concentration of the dye and the outcome parameter was the rate of decolorization (%). Furthermore, the toxicity bioassays of the supernatant after 16 and 24 h of the culture were carried out using lettuce seeds (Lactuca sativa) and the microcrustacean Artemia salina. Results showed that P. kudriavzevii SD5 is a multi-stress tolerant yeast, being capable to degrade high concentrations of RB5 at 45° C. However, only the temperature showed statistical significance (p < 0.05) for dye discoloration. Toxicity bioassays demonstrated that toxicity decreased after 24 h of culture and the absorbance profile of the supernatant pointed to a degradative mechanism of discoloration.

Keywords:
fungi; azo dyes; biotoxicity

INTRODUÇÃO

Os corantes são substâncias coloridas que, quando aplicadas a fibras, produzem coloração permanente capaz de resistir à exposição a agentes químicos e físicos e que têm diversas aplicações na indústria de cosméticos, alimentos, plásticos e têxtil. No entanto, o descarte desses efluentes pelas indústrias resulta na contaminação de mananciais, visto que a maioria dos corantes sintéticos apresenta baixa degradabilidade, são xenobiontes e recalcitrantes, além de mutagênicos e carcinogênicos (SARATALE et al., 2011; PEIXOTO; MARINHO; RODRIGUES, 2013; EL-RAHIM et al., 2017). Entre esses corantes, o Preto Reativo 5 é muito utilizado na indústria têxtil para o tingimento de lã, fibras sintéticas e algodão, em função de sua aplicação simples e de elevada fixação (KHAN; BHAWANA; FULEKAR, 2013; VENTURA-CAMARGO; MARIN-MORALES, 2013).

Os métodos químicos e físicos continuam sendo os principais procedimentos usados no tratamento de efluentes têxteis, mas, apesar de eficientes, são dispendiosos e muitas vezes resultam na produção de poluentes secundários (EL-RAHIM et al., 2017). O tratamento microbiano, por sua vez, é uma alternativa promissora e de baixo custo, além de apresentar versatilidade, adaptabilidade e ser ambientalmente mais seguro (TAN et al., 2014; MAHMOUD, 2016).

O uso de leveduras no tratamento de águas contaminadas com corantes tem despertado a atenção, sobretudo nas últimas duas décadas, em virtude do baixo custo de produção, de remoção de altas concentrações do corante e de fácil adaptação (JAFARI; KASRA-KERMANSHAHI; SOUDI, 2013; YANG; ZHENG, 2014; TAN et al., 2013; TAN et al., 2016). Além disso, as leveduras apresentam significante vantagem em relação às bactérias e aos fungos filamentosos, por apresentarem rápido crescimento, como as bactérias, e elevada tolerância a condições adversas, como os fungos filamentosos, de maneira específica tolerância a ampla faixa de pH, a temperaturas elevadas e a substâncias tóxicas (DAS; CHARUNMATHI, 2012).

Estudos de degradação de corantes com as leveduras Pichia sp., Candida sp. e Magnisiomyces sp. têm demonstrado que esses microrganismos apresentam habilidade não somente para degradação, mas, até mesmo, mineralização de corantes (JAFARI; SOUDI; KASRA-KERMANSHAH, 2014; PAJOT; MARTORELL; FIGUEROA, 2014; TAN et al., 2016). Assim, o objetivo deste trabalho foi otimizar o processo de descoloração do corante diazo Preto Reativo 5 (PR5), utilizando a levedura Pichia kudriavzevii SD5 por Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR), bem como verificar a toxicidade dos metabólitos formados após esse processo.

MATERIAL E MÉTODOS

Microrganismo

Pichia kudriavzevii SD5 é uma levedura que faz parte do acervo de culturas do Laboratório de Bioquímica da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia (UFRB) e que foi isolada do molusco bivalve sururu-do-mangue (Mytella guianensis) no Rio Subaé, na região do Recôncavo Baiano.

Ensaio de otimização da descoloração do corante PR5 utilizando Delineamento Composto Central Rotacional

Para os ensaios de descoloração foi utilizado o meio normal de descoloração (MND), contendo (g L^-1): extrato de levedura 2,5; KH₂PO₄ 5,0; MgSO₄ 0,5; CaCl₂ 0,13 e glicose 20 (RAMALHO et al., 2004; MARTORELL et al., 2012). Para a realização do processo de descoloração a levedura P. kudriavzevii SD5 foi primeiramente repicada em meio sólido GYMP e incubada a 40° C por 48 h, para obtenção de células jovens. Em frascos de Erlenmeyer de 125 mL, foi colocado 30 mL de meio MND e adicionado o corante de acordo com o planejamento fatorial. Os frascos foram inoculados com 1% de uma suspensão celular em solução salina 0,85% com D.O. de 0,8 (correspondente a 2,4 × 10⁸ UFC.mL^-1, na escala de MacFarland) na absorbância de 600 nm.

Ensaio de otimização

Para os ensaios de descoloração, foram realizados dois planejamentos fatoriais completos 2³, de acordo com a matriz do DCCR, com 14 ensaios mais 3 pontos centrais, totalizando 17 ensaios cada planejamento durante 24 h (RODRIGUES; IEMMA, 2009). Em ambos os planejamentos, as variáveis estudadas foram pH (X₁), temperatura (X₂) e concentração do corante (X₃). No primeiro DCCR, as faixas estudadas foram: pH de 2 a 6, temperatura de 37 a 53°C e concentração do corante de 80 a 420 mg.L^-1 . No segundo DCCR, as faixas estudas foram: pH de 4 a 8, temperatura de 40 a 50°C e concentração do corante de 350 a 1.000 mg.L^-1.

Para o cálculo da percentagem da descoloração, foi usada a seguinte fórmula (Equação 1):

$Descoloração=\frac{(A-B)}{A}*100$ (1)

Em que:

• A =  absorbância do meio contendo corante (não inoculado);
• B =  absorbância residual do meio.

A leitura da absorbância do PR5 foi realizada no comprimento de onda de 595 nm.

Parâmetros cinéticos da descoloração do PR5 por Pichia kudriavzevii SD5

Para análise do perfil cinético de P. kudriavzevii SD5, foram realizados ensaios com diferentes tempos de incubação (0, 8, 12, 16, 20 e 24 h), em triplicata, utilizando-se frascos de Erlenmeyer de 125 mL contendo 30 mL do meio de cultivo, na condição de 45°C, pH 6 e na concentração de 650 mg/mL do corante PR5. Cada amostra foi centrifugada a 5.000 rpm, por 30 min, a 4°C, para separação do sobrenadante da biomassa. O sobrenadante foi utilizado para determinação da porcentagem de descoloração de proteínas solúveis (BRADFORD, 1976), de açúcares redutores totais (MILLER, 1959), de pH e para os ensaios de toxicidade; a biomassa foi utilizada para a determinação do crescimento celular.

Crescimento celular

Após as fermentações, a biomassa foi separada do sobrenadante por centrifugação a 5.000 rpm, por 30 min, a 4°C. Depois de separar o sobrenadante, a biomassa foi ressuspensa em água destilada para lavagem das células e centrifugada novamente. A água da lavagem foi descartada, e a biomassa foi ressuspensa, mais uma vez, em água destilada, para realização da leitura da densidade óptica a 600 nm. O crescimento celular foi expresso em g L^-1 e calculado utilizando-se a curva padrão da massa seca × densidade óptica.

Análise do desaparecimento do corante PR5 por espectrofotometria UV/visível

O sobrenadante dos cultivos dos tempos de 0, 8, 12, 16, 20 e 24 h foram submetidos a uma varredura em espectrofotômetro UV/Visível na faixa de comprimentos de onda de 400 a 800 nm, para analisar o desaparecimento do corante ao longo do tempo.

Ensaios de toxicidade

Ensaios de fitotoxicidade com sementes de alface (Lactuca sativa)

Os ensaios da fitotoxicidade foram realizados com o sobrenadante obtido dos cultivos após 16 h e 24 h de descoloração, na condição de 650 mg.L^-1, pH 6 e a 45°C. Foi utilizado o método de Sobrero e Ronco (2008) com sementes de alface (L. sativa, variedade Lettuce Monica SF 31, safra 2014). Discos de papel de germinação foram colocados em placas de Petri e saturados com 2 mL do sobrenadante em diferentes diluições (6, 12, 25, 50 e 100%), em triplicata. Em cada placa foram depositadas 20 sementes de alface, as placas foram lacradas com filme plástico, acondicionadas em sacos plásticos para evitar a perda de umidade e incubadas durantes 5 dias a 22 ± 2°C, no escuro. O resultado foi comparado com a resposta observada nos controles contendo água destilada (controle positivo) e corante PR5 (controle negativo), nas mesmas diluições. Terminado o período de exposição, a germinação relativa (GR%), o crescimento relativo das radículas (CRR%) e o índice de germinação (IG%) foram calculados pelas equações 2, 3 e 4 (TAM; TIQUIA, 1994).

$GR\left(\%\right)=\frac{Númerodesementesgerminadasnoextrato}{Númerodesementesgerminadasnocontrole}\times 100$ (2)

$CRR\left(\%\right)=\frac{Médiadecrescimentodasradículasnoextrato}{Médiadecrescimentodasradículasnocontrole}\times 100$ (3)

$IG=\frac{CRR\times GR}{100}$ (4)

Ensaios de toxicidade com larvas de artemia (Artemia salina)

Os testes de toxicidade foram realizados usando-se náuplios do microcrustáceo Artemia salina com o sobrenadante obtido dos cultivos após 16 e 24 h, nas mesmas condições já descritas. As amostras do sobrenadante, bem como do corante PR5 (controle negativo), foram diluídas com solução aquosa de sal marinho (30 g.L^-1), em frasco incolor de 10 mL, obtendo-se diferentes diluições (17, 33, 67 e 83%), perfazendo um volume total de 5 mL, sendo o volume máximo da amostra 1,5 mL (MCLAUGHLIN; ROGERS; ANDERSON, 1998). Como controle positivo, foi utilizado somente solução de sal marinho. Em cada frasco foram usados 10 náuplios de A. salina, que foram incubados durante 24 h na presença de luz e em temperatura ambiente (25-30°C). Em seguida, foi realizada a contagem do número de náuplios sobreviventes, para determinar a concentração letal (CL₅₀), que é a concentração em que ocorre a mortalidade de 50% dos indivíduos. Todos os testes foram realizados em triplicata. Para análise dos resultados, a CL₅₀ foi calculada usando-se o método Trimmed Spearman-Karber.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O percentual de descoloração do PR5 no primeiro DCCR 2³ pela levedura P. kudriavzevii SD5 atingiu quase 100% nas concentrações do corante na faixa de 80 a 420 mg.L^-1, no intervalo de pH de 3 a 6 e em temperaturas de 37 a 45°C (Tabela 1).

Tabela 1 -
Matriz do Delineamento Composto Central Rotacional 2³ e percentual de descoloração do corante Preto Reativo 5 por Pichia kudriavzevii SD5.

Ensaios	X1	X2	X3	pH	Temperatura (°C)	Concentração do corante (mg.L-1)	Porcentagem de descoloração (%)
1	-1	-1	-1	3	40	150	99,37
2	1	-1	-1	5	40	150	99,40
3	-1	1	-1	3	50	150	00,00
4	1	1	-1	5	50	150	00,00
5	-1	-1	1	3	40	350	99,54
6	1	-1	1	5	40	350	98,96
7	-1	1	1	3	50	350	00,00
8	1	1	1	5	50	350	00,00
9	-1,68	0	0	2	45	250	00,00
10	1,68	0	0	6	45	250	99,46
11	0	-1,68	0	4	37	250	99,70
12	0	1,68	0	4	53	250	00,00
13	0	0	-1,68	4	45	80	99,55
14	0	0	1,68	4	45	420	99,74
15	0	0	0	4	45	250	99,17
16	0	0	0	4	45	250	99,82
17	0	0	0	4	45	250	99,60

As variáveis estatisticamente significativas foram o pH, em seu termo quadrático, e a temperatura, nos termos linear e quadrático (p < 0,05), com porcentagem de variação explicada (R²) de 0,81 e com F_cal (27,85) superior ao F_tab (3,41). O aumento do pH do meio de cultivo elevou a porcentagem de descoloração; por sua vez, o aumento da temperatura (acima de 45 °C) provocou a diminuição da porcentagem de descoloração. Na faixa de pH entre 4 e 7, temperatura entre 40 e 45°C e concentração do corante de 350 até 850 mg.L^-1 ocorreram as porcentagens mais elevadas de descoloração, acima de 90%. Na concentração de 1.000 mg.L^-1, a porcentagem de descoloração decresceu para 60% (Tabela 2).

Tabela 2 -
Matriz do segundo Delineamento Composto Central Rotacional 2³ e percentual de descoloração do corante Preto Reativo 5 por Pichia kudriavzevii SD5.

Ensaios	X1	X2	X3	pH	Temperatura (°C)	Concentração do corante (mg.L-1)	Porcentagem de descoloração (%)
1	-1	-1	-1	5	43	440	99,47
2	1	-1	-1	7	43	440	91,61
3	-1	1	-1	5	48	440	12,02
4	1	1	-1	7	48	440	00,00
5	-1	-1	1	5	43	850	99,63
6	1	-1	1	7	43	850	96,44
7	-1	1	1	5	48	850	03,64
8	1	1	1	7	48	850	00,00
9	-1,68	0	0	4	45	650	94,72
10	1,68	0	0	8	45	650	73,48
11	0	-1,68	0	6	40	650	99,50
12	0	1,68	0	6	50	650	00,00
13	0	0	-1,68	6	45	350	98,65
14	0	0	1,68	6	45	1.000	60,58
15	0	0	0	6	45	650	98,65
16	0	0	0	6	45	650	99,49
17	0	0	0	6	45	650	99,01

Em alguns ensaios foi observada cor marrom-acastanhada, sobretudo nas concentrações iguais ou maiores a 650 mg.L^-1. Isso acontece em razão da mineralização parcial do PR5, que faz com que a forma oxidada de alguns de seus metabólitos apresente cor, embora não haja traço presente do corante (LIBRA et al., 2004). Segundo Hao, Kim e Chiang (2000), o reaparecimento de cor em ensaios de descoloração muitas vezes ocorre pela modificação que a biomassa produz na molécula do corante que, a depender do arranjo formado, produz grupos cromóforos coloridos, além de aminas que, ao serem hidrolisadas de modo parcial, podem egopolimerizar, formando compostos biologicamente recalcitrantes e coloridos. Ainda assim, esses resultados mostram o grande potencial da levedura P. kudriavzevii SD5 em clivar e suportar elevadas concentrações do corante PR5.

Das três variáveis testadas no segundo DCCR, a única que apresentou efeito estatisticamente significativo, ao nível de 5% de probabilidade, foi a temperatura, tanto em seu termo linear quanto quadrático (Figura 1 e Tabelas 2 e 3). Além disso, o aumento da temperatura acima de 45°C provocou a queda da porcentagem de descoloração. A análise de variância indicou porcentagem de variação explicada (R²) de 0,83 e F_cal de 34,53, superior ao T_tab (3,74), mostrando que esse modelo é adequado para avaliar a descoloração do corante PR5 pela equação gerada pelo modelo reparametrizado, ou seja, modelo em que são utilizados apenas os valores significativos (Equação 5):

$Y=\mathrm{79,87}-\mathrm{39,45}{x}_2-\mathrm{16,94}{x}_2^2$ (5)

Figura 1 -
Curvas de contorno do segundo DCCR 2³ mostrando a descoloração do corante PR 5 por Pichia kudriavzevii SD5, indicando: (A) concentração do corante × pH; (B) pH × temperatura; (C) temperatura × concentração do corante.

Tabela 3 -
Análise de regressão para a descoloração (%) do corante Preto Reativo 5 por Pichia kudriavzevii SD5.

Fatores	Coeficiente de regressão	Erro padrão	t(11)	p
Média	79,8701	6,262659	12,75338	0,000000
(2) Temperatura (°C) (L)	-39,4519	5,148198	-7,66324	0,000002a
Temperatura (°C) (Q)	-16,9440	5,270813	-3,21468	0,006236a

• L: linear; Q: quadrático; R² = 0,8314; ^asignificativo ao nível de 5% de probabilidade.

Temperaturas elevadas são um dos fatores ambientais que podem causar estresse em leveduras, e a termotolerância é um atributo importante quando existe a intenção de utilizar esses fungos em aplicações industriais (MEJÍA-BARAJAS et al., 2017). Nesse contexto, a capacidade de suportar e de degradar concentrações elevadas do corante, bem como de apresentar descoloração a 45°C, são algumas das vantagens apresentadas por P. kudriavzevii SD5, uma vez que os efluentes industriais contêm concentrações altas de corantes, além de apresentarem temperaturas que variam de 30 a 60°C (DEIVE et al., 2010).

A P. kudriavzevii é descrita como uma levedura que apresenta tolerância a múltiplos tipos de estresse, além de estresse térmico, também a altas concentrações de etanol, de sais e de ácidos (LI et al., 2016 CHAMNIPA et al., 2018). Segundo Mejía-Barajas et al. (2017), esse comportamento pode ser explicado pela pressão ambiental e de modo particular pelas altas temperaturas, que podem fazer com que as linhagens se tornem termotolerantes.

Perfil cinético de degradação do corante PR5 pela levedura Pichia kudriavzevii SD5

Embora a concentração de corante e o pH, nas faixas estudadas, não tenham apresentado efeito estatisticamente significativo, a concentração de 650 mg.L^-1, o pH 6 e a temperatura de 45°C foram os parâmetros que apresentaram maior estabilidade e maior reprodutibilidade (Figura 1). Assim, o estudo dos parâmetros cinéticos na descoloração do corante PR5 por P. kudriavzevii SD5 foi realizado usando essas condições de cultivo. Uma porcentagem de 100% de descoloração foi observada após 16 h, sendo acompanhada pelo crescimento celular, que entrou na fase estacionária após 20 h, mantendo-se constante até 24 h. Assim como descrito para a degradação de azo corante por outras leveduras, a P. kudriavzevii SD5 apresentou acelerada porcentagem de descoloração do corante na fase exponencial de crescimento (RAMALHO et al., 2004; LUCAS et al., 2006; YANG et al., 2008). A glicose foi consumida ao longo do tempo e se esgotou após 20 h de cultivo. A concentração de proteínas solúveis aumentou até 8 h de cultivo e depois diminuiu de forma constante até se esgotar, após 20 h (Figura 2). Os valores de pH caíram de 6 para cerca de 4, após 16 h, mantendo-se até o fim do processo, provavelmente em virtude da produção de ácidos orgânicos durante o metabolismo da glicose (CHEN et al., 2003; EL-RAHIM et al., 2017). Yang et al. (2005) atribuíram a diminuição do pH à produção de ácidos e à liberação dos grupos SO₃ do corante, durante a descoloração PR5 pela levedura Debaryomyces polymorphus.

Figura 2 -
Descoloração (%), proteínas solúveis (mg.L^-1), glicose (g.L^-1) e biomassa (g.L^-1) após 24 h de cultivo do Preto Reativo 5 por Pichia kudriavzevii SD5.

Vários estudos demonstram que na ausência, ou em baixas concentrações, de uma fonte facilmente metabolizável de carbono, como a glicose, não ocorre descoloração dos corantes (YANG et al., 2005; YANG et al., 2008; SIVARAJ; DORTHY; VENECKATESH, 2011).

A degradação de azo corantes por leveduras é atribuída à atividade de várias enzimas ligninolíticas, como lacase (Lac), lignina peroxidase (LiP), manganês peroxidase (MnP) e tirosinase, que atuam na clivagem das ligações azo (YANG et al., 2005; SARATALE et al., 2011; MARTORELL et al., 2012; MARTORELL; PAJOT; FIGUEROA, 2012; JAFARI; SOUDI; KASRA-KERMANSHAH, 2014; MARTORELL et al., 2017). De acordo com Song et al. (2017), a ação de LiP, de MnP e de Lac, bem como de NADH-DCIP redutase, ocorreu somente nos extratos celulares e não no sobrenadante de P. occidentalis, após a descoloração de vários azo corantes, sugerindo que essas enzimas são intracelulares. Levando isso em consideração, a diminuição da concentração das proteínas solúveis no meio de cultura de P. ­kudriavzevii SD5 sugere que enzimas intracelulares tenham sido responsáveis pela degradação do corante, não sendo detectadas como proteínas solúveis no sobrenadante.

Além disso, Gottlieb et al. (2003) e Ramalho et al. (2004) afirmaram que a degradação de azo corantes está associada à produção de NAD(P)H e FADH₂ resultantes do metabolismo celular, os quais atuam como agentes redutores para a redução e clivagem das ligações azo. A produção desses equivalentes redutores é dependente do crescimento celular, o qual não ocorre sem uma fonte de carbono e de energia. Isso também pode explicar a degradação do corante PR5 por P. kudriavzevii SD5, uma vez que, a degradação do corante esteve associada ao crescimento celular (Figura 2).

Análise do comprimento de onda visível dos produtos da descoloração

A Figura 3 mostra o perfil de absorbâncias do corante PR5 e do sobrenadante após descoloração por P. kudriavzevii SD5 durante 24 h, em diferentes comprimentos de onda. A partir de 16 h, os picos de absorbância desapareceram. A diminuição da absorbância na faixa do espectro visível (400­-760 nm) sugere a clivagem da ligação azo, responsável pelo desaparecimento da cor (ADNAN et al., 2015; TAN et al., 2016). O processo de descoloração pode ocorrer por adsorção ou por biodegradação. Baseando-se na observação da biomassa celular da P. kudriavzevii SD5, que se manteve inalterada após a descoloração do corante, pode-se afirmar que ocorreu um processo de biodegradação do corante. Comportamento similar foi descrito por Lucas et al. (2006) e Martorell et al. (2017) na degradação do PR5 por Candida oleophila e C. boidinii MM4035, respectivamente, cujo desaparecimento do pico de absorção em torno de 600 nm, de modo conjunto à baixa adsorção do corante pela biomassa apontaram para um mecanismo degradativo de descoloração.

Figura 3 -
Perfil de absorbância do corante PR5 e do sobrenadante, em diferentes tempos de cultivo com a levedura Pichia kudriavzevii SD5.

Ensaios de toxicidade aguda

Os testes de toxicidade são de grande importância, devendo ser realizados após os ensaios de descoloração microbiana, pois permitem avaliar o efeito dos subprodutos formados sobre os organismos vivos, uma vez que o tratamento de corantes industriais pode resultar na formação de produtos secundários mais tóxicos que os originais, sendo impossível testar todos os compostos ativos presentes na água (PUVANESWARI; MUTHUKRISHNAN; GUNASEKARAN, 2006).

De acordo com os testes de fitotoxicidade usando o corante não tratado (a 650 mg.L^-1) e o sobrenadante obtido após 16 e 24 h de cultivo, menor toxicidade foi observada após 24 h de cultivo (Tabela 4). Isso indica que o tempo de cultivo influenciou de modo positivo a diminuição da toxicidade, provavelmente em virtude da metabolização dos compostos aromáticos formados durante a clivagem do grupo azo, como observado nos valores mais altos dos índices de germinação (IG), pois, de acordo com Tam e Tiquia (1994), valores de IG acima de 80% indicam a diminuição ou a eliminação de efeitos tóxicos. Além disso, tanto para o corante não tratado como para o sobrenadante, a concentração de 100% ainda foi tóxica em todos os ensaios, demonstrando que a levedura necessita de mais tempo para a completa mineralização do PR5.

Tabela 4 -
Efeito do corante Preto Reativo 5 (PR5) e do sobrenadante em diferentes diluições, após descoloração nos tempos de 16 horas e 24 horas, sobre sementes de alface (Lactuca sativa).

Diluição	Sobrenadante obtido após 16 horas de descoloração
	6%	12%	25%	50%	100%
GR (%)	86,21	91,38	94,83	67,24	0
CRR (%)	189,25	187,1	125,81	40,86	0
IG (%)	163,14	170,97	119,3	27,47	0
Diluição	Sobrenadante obtido após 24 horas de descoloração
	6%	12%	25%	50%	100%
GR (%)	100	101,72	103,45	93,1	7,76
CRR (%)	192,47	221,51	176,34	135,48	48,39
IG (%)	192,47	225,32	182,42	126,14	3,75
Diluição	Corante não tratado
	6%	12%	25%	50%	100%
GR (%)	93,27	96,72	91,53	20,51	0
CRR (%)	137,5	150,0	114,58	41,67	0
IG (%)	130,18	146,48	102,11	20,03	0
Água destilada
Média de sementes germinadas 19.3 (96,5%)
Média de germinação de sementes 1.55

• GR: germinação relativa; CRR: crescimento relativo das radículas; IG: índice de germinação.

O ensaio de toxicidade com o microcrustáceo Artemia salina também demonstrou que após o tratamento do corante com P. ­kudriavzevii SD5 houve redução da toxicidade dos produtos da descoloração, uma vez que a mortalidade foi maior em meio com o corante quando comparada com o sobrenadante.

A CL₅₀ das amostras após 16 h de cultivo foi de 74,57%, com faixa de variação de 65,13 a 85,39%. Para as amostras obtidas após 24 h de cultivo, o valor da CL₅₀ aumentou para 79,14%, com faixa de variação de 71,35 a 87,79%. A CL₅₀ das amostras do corante não tratado (controle negativo) foi de 54,89%, com faixa de variação de 44,68 a 67,44%, para um intervalo de confiança de 5%. No controle positivo (água), não houve morte das larvas. Esses resultados sugerem que a P. kudriavzevii SD5 apresentou capacidade de degradação, ao menos parcial, da molécula do corante, o qual foi transformado em compostos com menor toxicidade após 24 h de cultivo.

CONCLUSÃO

Os resultados de descoloração do corante PR5 mostram que a levedura P. kudriavzevii SD5 apresenta potencial biotecnológico para aplicações na degradação de corantes industriais. Embora tenha ocorrido diminuição da toxicidade após 24 h de cultivo, a toxicidade apresentada pelo sobrenadante nas diluições mais altas sugere que ocorreu degradação parcial do corante.

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  Reg. Abes: 182911

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  17 Abr 2020
• Data do Fascículo
  Mar-Apr 2020

Histórico

• Recebido
  20 Jul 2017
• Aceito
  14 Fev 2019