Caracterização de um isolado do Pepper mild mottle virus que não quebra a resistência do gene L3 em Capsicum sp.

Characterization of a non-L3 gene-resistance breaking Pepper mild mottle virus isolate in Capsicum

COMUNICAÇÕES COMMUNICATIONS

Caracterização de um isolado do Pepper mild mottle virus que não quebra a resistência do gene L3 em Capsicum sp.

Characterization of a non-L3 gene-resistance breaking Pepper mild mottle virus isolate in Capsicum

Marcelo Eiras; Alexandre L. R. Chaves; Silvia R. Moreira; Jansen de Araujo; Addolorata Colariccio

Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Vegetal, Instituto Biológico, Av. Conselheiro Rodrigues Alves, 1252, CEP 04014-002, São Paulo, SP, e-mail: [e-mail]

RESUMO

Sementes de pimenta (Capsicum baccatum) 'Dedo de Moça' destinadas ao plantio comercial e adquiridas no município de São Paulo, SP, analisadas quanto à presença de vírus, por meio de testes biológicos e sorológicos revelaram-se infetadas por uma estirpe do Pepper mild mottle virus (PMMoV). Para confirmar a identidade do isolado, promoveu-se a RT-PCR com oligonucleotídeos que flanqueiam a ORF da capa protéica de espécies do gênero Tobamovirus do subgrupo 1. Os fragmentos de DNA amplificados, quando seqüenciados e comparados com outros isolados de tobamovírus depositados no GenBank, apresentaram valores de identidade de nucleotídeos entre 94 e 100% com outras seqüências de PMMoV, inferiores a 75% para as demais espécies de tobamovírus do subgrupo I (Tobacco mosaic virus, Tomato mosaic virus e Odontoglossum ringspot virus) e 65% para os tobamovírus dos subgrupos II e III. O PMMoV-BR revelou 100% de identidade com isolados japoneses, sugerindo que este patógeno pode ter sido introduzido daquele país. A seqüência de aminoácidos deduzidos da capa protéica indicou também, que este isolado não é capaz de quebrar a resistência do gene L3 de Capsicum spp. Fato confirmado pelos sintomas causados nas hospedeiras diferenciais de Capsicum spp., verificando-se que este isolado não foi capaz de infetar plantas de C. chinense (L3) e C. chacoense (L4). Estes resultados confirmaram a importância da caracterização dos isolados de tobamovírus, fundamental para adequação de medidas de controle, principalmente, prevenindo a entrada e posterior disseminação do patógeno em novas áreas de cultivo.

Palavras-chave adicionais:Tobamovirus, pimenta, pimentão, seqüenciamento.

ABSTRACT

A strain of Pepper mild mottle virus (PMMoV) was identified by biological and serological analysis of pepper (Capsicum baccatum) 'Dedo de Moça' seeds from São Paulo, SP, Brazil. To confirm these results, RT-PCR was performed with specific primers flanking the coat protein (CP) ORF of tobamoviruses in subgroup 1. The DNA-amplified fragments, when sequenced and compared with other tobamovirus CP sequences stored in the GenBank, showed nucleotide similarity between 94 to 100% with other PMMoV CP sequences, and below 75% with the subgroup I tobamovirus species (Tobacco mosaic virus, Tomato mosaic virus and Odontoglossum ringspot virus) and 65% with species in the subgroups II and III. The Brazilian isolate showed 100% identity with a Japanese isolate, strongly suggesting that this pathogen could have been introduced from that country. This fact confirms the importance of the isolate's characterization, in order to establish adequate control measures to guarantee healthy seed interchange and to avoid the introduction and spread of tobamoviruses into new growing areas. The deduced CP aminoacids sequence showed that the PMMoV-BR was not capable to overcome L3 gene resistance. This fact was confirmed by the inoculation and reaction of differential Capsicum species. The Brazilian isolate was not able to infect C. chinense (L3) and C. chacoense (L4).

Do gênero Tobamovirus fazem parte 17 espécies de vírus distribuídas em três subgrupos, sendo o Pepper mild mottle virus (PMMoV) pertencente ao subgrupo 1, juntamente com o Tobacco mosaic virus (TMV), o Tomato mosaic virus (ToMV), o Tobacco mild green mosaic virus (TMGMV) e o Odontoglossum ringspot virus (ORSV). Esta subdivisão é determinada em função da origem da montagem da partícula, número de nucleotídeos presentes entre duas diferentes ORFs, análise filogenética e hospedeiras, sendo o subgrupo 1 denominado subgrupo das solanáceas, o 2 das crucíferas e o 3 das cucurbitáceas (Lartey et al., 1996).

A maioria das espécies deste gênero apresenta distribuição mundial em regiões de clima temperado e tropical e é transmitida por contato mecânico, decorrente das práticas culturais, permanecendo em resíduos vegetais, no solo ou na água por longos períodos, não havendo, até o momento, vetores biológicos conhecidos. Podem ser disseminados pelas sementes, infestando a superfície do tegumento, mucilagem externa, testa e endosperma, mas não são transmitidos por pólen. No Brasil, há somente relatos da ocorrência de espécies do gênero Tobamovirus pertencentes ao subgrupo 1: o TMV, o ToMV, o ORSV (Alexandre et al., 2000; Moreira et al., 2003), e mais recentemente, o PMMoV em pimenta (Capsicum baccatum L.) e pimentão (Capsicum annuum L.) no Estado de São Paulo (Kobori et al., 2001; Cezar et al., 2003; Eiras et al., 2003).

Em função do comportamento frente aos genes de resistência L (L1, L2, L3 e L4), presentes em espécies e cultivares de Capsicum spp., os tobamovírus são classificados em diferentes patótipos (Velasco et al., 2002). O gene L1, presente em pimentão 'Magda' confere resistência ao patótipo 0 (P0), correspondente ao ToMV; o gene L2, presente em pimentão 'Tisana' confere resistência ao patótipo P1 correspondente ao ToMV e ao Paprika mild mottle virus (PaMMV). As estirpes do PMMoV espanhola (PMMoV-S) (Garcia-Luque et al., 1990) e japonesa (PMMoV-J) (Kirita et al., 1997), denominadas de patótipos P12 são capazes de infetar cultivares que apresentam os genes L1 e L2 (C. frutescens L.). Já os patótipos P123, correspondentes ao PMMoV-Italian (estirpe italiana) (Garcia-Luque et al., 1993) e PMMoV-Ia (estirpe espanhola) (Velasco et al., 2002), são capazes de infetar cultivares que apresentam os genes L1, L2 e L3 (C. chinense Jac.). As duas últimas estirpes têm sido responsáveis por importantes perdas em cultivos de Capsicum spp. na Europa (Letschert et al., 2002).

Recentemente, Velasco et al. (2002) e Letschert et al. (2002) descreveram métodos rápidos para diferenciar os isolados de tobamovírus capazes ou não de quebrar a resistência do gene L3 por meio de RT-PCR seguida de RFLP. Estas metodologias foram baseadas na seqüência de nucleotídeos da capa protéica, sendo que os isolados que quebram a resistência deste gene (patótipos P123) apresentam um sítio de restrição para a endonuclease EcoRI. Esta pequena diferença no genoma também tem reflexo na proteína, pela troca de metionina (Met) por asparagina (Asn), na posição 139.

Portanto, o presente trabalho teve como finalidade, além de identificar e caracterizar o isolado de tobamovírus (nomeado como PMMoV-BR) presente em sementes de pimenta, por meio de ensaios biológicos aliados a técnicas sorológicas e moleculares para a correta identificação do patógeno, também compará-lo com outros isolados responsáveis por quebra ou não de resistência conferida pelo gene L3 em espécies de Capsicum.

Para tal, sementes comerciais de pimenta 'Dedo de Moça', adquiridas no município de São Paulo (SP), foram semeadas e as plântulas mantidas em condições controladas e analisadas quanto à presença de vírus. Visando à manutenção da fonte de vírus, utilizaram-se como inóculo as plântulas de pimenta com sintomas de mosaico que foram maceradas em solução sulfito de sódio 0,5%, pH 6,0, na proporção de 1:5 (g:ml) com carborundum (400 mesh) como abrasivo e friccionadas nas folhas de plantas indicadoras pertencentes às espécies Nicotiana tabacum L. 'White Burley', pimentão 'Magnata', Chenopodium amaranticolor Coste & Reyn. e tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill.) 'Santa Clara', as quais foram mantidas em casa de vegetação e posteriormente armazenadas sobre cloreto de cálcio a –20 ºC.

Extrato vegetal de folhas sintomáticas de pimentão 'Magnata' experimentalmente infetadas, foi utilizado para inoculação mecânica (conforme descrito acima) das seguintes espécies: pimentão 'Magnata', 'Natalie'; pimenta 'Dedo de Moça'; tomateiro 'Santa Clara' e 'Microtom'; Nicotiana glutinosa L., N. rustica L., N. sylvestris Speg. & Comes., N. clevelandii Gray, N. tabacum 'White Burley'; Petunia hybrida Vilm.; C. amaranticolor e C. quinoa Willd. Após a inoculação, as plantas foram mantidas em casa de vegetação para a observação dos sintomas. Na ausência de sintomas, foram feitos testes de recuperação do vírus, por meio de inoculação mecânica em plantas de pimentão 'Magnata', a fim de se verificar a ocorrência de latência.

Plantas de Capsicum spp. apresentando reações diferenciais frente aos genes de resistência L (L1, L2, L3 e L4) encontrados em pimentão 'Early California Wonder' (L⁺L⁺), pimentão 'Bruinsma Wonder' (L¹L¹), C. frutescens 'Tabasco' (L² L²), C. chinense 'PI 159236' (L³L³), C. chacoense Hunz. 'PI 260429' (L⁴L⁴) e plantas de N. tabacum 'White Burley' foram mecanicamente inoculadas e mantidas em casa de vegetação para observação dos sintomas. Após a manifestação dos sintomas, as plantas foram submetidas a testes de recuperação biológica e ELISA-PTA com o anti-soro contra PMMoV para a confirmação da presença do vírus.

Utilizou-se o ELISA indireto para a identificação do vírus empregando-se anti-soros contra a capa protéica de três espécies do gênero Tobamovirus: ToMV, TMV e o PMMoV. Foram submetidas ao PTA-ELISA amostras de sementes e plântulas provenientes do material original, bem como amostras foliares sintomáticas de pimenta e pimentão, experimentalmente, infetadas e sadias (controle negativo). Todas as amostras foram previamente maceradas em nitrogênio líquido e posteriormente homogeneizadas em tampão de cobertura. Após as reações imuno-enzimáticas, foram realizadas leituras de absorbância (A_405nm). Consideraram-se positivas as leituras obtidas de material infetado que apresentavam valores três vezes superiores aos controles negativos.

Para a extração de RNAs totais, 1g de amostras foliares de pimentão infetado com o isolado PMMoV-BR apresentando mosaico brando e nanismo, foram submetidas ao procedimento descrito por Moreira et al. (2003). Amostras de RNAs totais de folhas de pimentão sadias constituíram o controle negativo.

A RT-PCR foi efetuada partindo-se de 1 mg de RNAs totais extraídos e utilizando-se oligonucleotídeos iniciadores (PAS1 – 'antisense'; e PS1 – 'sense') que flanqueiam a ORF da capa protéica (CP), desenhados por meio do alinhamento das seqüências de nucleotídeos de diferentes espécies do gênero Tobamovirus já seqüenciadas (Alexandre et al., 2000). Para a PCR, foram utilizados os reagentes do kit Taq DNA Polymerase recombinant (Gibco BRL), seguindo as recomendações do fabricante. Os fragmentos de DNA amplificados foram visualizados em gel de agarose a 1,0 % (p/v) corado com brometo de etídeo sob luz ultravioleta. Os produtos amplificados via RT-PCR foram diretamente seqüenciados pela técnica de reação de terminação em cadeia, utilizando-se um Kit comercial de seqüenciamento (Applied Biosystem) seguindo-se as recomendações do fabricante. O alinhamento das seqüências obtidas nos dois sentidos foi feito com o auxílio do programa Sequencer 3.1 (Gene Codes Corporation) e as comparações, com as seqüências existentes no GenBank, foram feitas com o programa BLASTn, disponível no endereço http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos foram alinhadas com o programa Clustal X 1.8 com outras seqüências de isolados de PMMoV e ToMV, TMV, ORSV e Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV) depositadas no GenBank, sendo obtido um dendrograma utilizando-se o programa Mega 2.1 das seqüências de nucleotídeos. Utilizou-se também o programa GeneDoc para o cálculo dos valores de identidade das seqüências de nucleotídeos da CP e para a ilustração do alinhamento das seqüências de aminoácidos deduzidos. As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos do PMMoV-BR, obtidas neste trabalho, foram depositadas no GenBank com o código de acesso AF525080.

Os sintomas observados nas plantas indicadoras foram típicos aos induzidos pelos tobamovírus com pontos cloróticos locais em N. glutinosa, N. rustica, N. sylvestris e P. hybrida. Com a exceção da ausência de sintomas sistêmicos em N. tabacum 'WB' e imunidade de tomate, características do PMMoV, foi possível concluir que as sementes de pimenta 'Dedo de Moça' estavam contaminadas por uma única espécie de tobamovírus. Além disso, em PTA-ELISA, houve reação positiva somente com o anti-soro contra o PMMoV.

Pelos sintomas induzidos nas diferentes espécies de Capsicum, concluiu-se que o isolado denominado de PMMoV-BR pertence ao patótipo P12 em função da ausência de sintomas em C. chinense 'PI 159236' e 'PI 22225' (L³L³) e em C. chacoense 'PI 260429' (L⁴L⁴). O PMMoV-BR induziu sintomas sistêmicos de mosaico brando em pimentão 'Bruinsma Wonder' (L⁺L⁺), 'Early California Wonder' (L¹L¹), 'Yolo Wonder' (L¹L¹), 'Magnata' (Figura 1), 'Magda' (L¹L¹), e em C. frutescens 'Tabasco' (L²L²), além de sintomas de mosaico em pimenta 'Dedo de Moça' (Tabela 1).

Fragmentos com 850 pb foram obtidos, via RT-PCR, conforme esperado para espécies de tobamovírus do subgrupo 1. Obtiveram-se valores de identidade de nucleotídeos entre 94 e 100% com outras seqüências de PMMoV, sendo inferiores a 75% para as demais espécies de tobamovírus do subgrupo I (TMV, ToMV, TMGMV e ORSV) e 65% para os tobamovírus dos subgrupos II e III. Ressalta-se que a seqüência da capa protéica do PMMoV-BR revelou 100% de identidade com o isolado japonês (PMMoV-J) (Kirita et al., 1997), sugerindo que este isolado pode ter sido introduzido daquele país. Este fato confirma a importância da caracterização e comportamento dos isolados de vírus que são transmitidos por sementes, fator fundamental para adequação de medidas de controle, principalmente visando à garantia do intercâmbio de plantas e sementes sadias. Dessa forma, a detecção sorológica (ELISA) deste vírus nas sementes também merece destaque, sendo uma técnica rápida e de baixo custo, podendo prevenir a entrada e posterior disseminação desse patógeno para novas áreas.

Aspectos relacionados à resistência de linhagens avançadas de Capsicum spp. estão sendo investigados. Porém, a seqüência de nucleotídeos da CP indicou que o PMMoV-BR pertence ao grupo dos vírus que não quebram a resistência do gene L3 ("L3-resistance"). Como pode ser observado (Figura 2) por meio do alinhamento de aminoácidos deduzidos, nota-se que na posição 139, o isolado brasileiro apresenta uma metionina. A troca de uma metionina (M) por asparagina (N) determina o fenótipo de quebra de resistência do gene L3, representando o aminoácido-chave para tal evento (Velasco et al., 2002). Estes aspectos, relativos à seqüência da CP têm sido, recentemente, investigados por outros autores como diretamente ligados à resistência, sendo a proteína da capa considerada como elicitor de resposta do hospedeiro à infecção (Berzal-Herranz et al., 1995; Tsuda et al., 1998; Hamada et al., 2002).

A análise filogenética das seqüências da CP de isolados do PMMoV permitiu a sua separação em dois grupos distintos denominados de: grupo "L3-resistance" – patótipos P12, que engloba o isolado brasileiro (PMMoV-BR) e os demais isolados que não são capazes de quebrar a resistência do gene L3; e o grupo "L3 resistance overcoming" – patótipos P123, que engloba o isolado italiano (PMMoV-Italian), espanhol (PMMoV-Ia) e um isolado japonês (PMMoV-Tosa), os quais promovem a quebra da resistência do gene L3 (Figura 3). A quebra de resistência do gene L3 de Capsicum spp. pelos patótipos P123 tem sido objeto de estudo e preocupação porque tem levado a perdas importantes em cultivos de pimenta e pimentão na Europa (Alonso et al., 1991; Letschert et al., 2002; Velasco et al., 2002). Na árvore filogenética nota-se também o isolado PMMoV-Tosa, proveniente do Japão, apresentando 100% de identidade com o isolado PMMoV-Italian, podendo ter sido introduzido da Itália por intercâmbio de material vegetal contaminado (Hamada et al., 2002).

A correta identificação do vírus como pertencente à espécie PMMoV e, por ser este um patótipo que não quebra a resistência do gene L3, fornece subsídios para estratégias de controle e adequação dos programas de melhoramento genético. Aparentemente, este vírus não representa um risco potencial para o cultivo de pimenta e pimentão, no Brasil. Porém, medidas importantes devem ser tomadas para evitar a disseminação deste patógeno para novas áreas de cultivo. Além disso, dever-se-á incrementar os cuidados para evitar a entrada do patótipo (P123) do PMMoV que quebra a resistência do gene L3, principalmente evitando a importação de plantas e sementes de Capsicum spp. contaminadas da Espanha, Itália e Japão. Por ser um vírus transmitido por contato mecânico ou sementes contaminadas, o controle baseia-se exclusivamente na utilização de sementes sadias e no manejo adequado da cultura, tanto em campo como em cultivos protegidos.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Pesquisador Dr. P. Roggero (Istituto de Virologia Vegetale, Torino, Itália) pelo anti-soro e pelas sementes das hospedeiras diferenciais e à Dra. E.B. Rivas (Instituto Biológico, São Paulo) pelos oligonucleotídeos cedidos.

Aceito para publicação em 08/09/2004

Autor para correspondência: Marcelo Eiras

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  06 Jan 2005
• Data do Fascículo
  Dez 2004

Histórico

• Aceito
  08 Set 2004
• Recebido
  08 Set 2004