Otimização de metodologia para o estudo de genes KIR

Methodology optimization for KIR genotyping

ARTIGO ORIGINAL ORIGINAL PAPER

Otimização de metodologia para o estudo de genes KIR

Methodology optimization for KIR genotyping

Cristiane Conceição Chagas Rudnick^I; Gláucia Andréia Soares Guelsin^II; Amanda Vansan Marangon^III; Danilo Santana Alessio Franceschi^IV; Ana Maria Sell^V; Jeane Eliete Laguila Visentainer^VI

^IAcadêmica de pós-graduação em Análises Clínicas da Universidade Estadual de Maringá (UEM)

^IIAcadêmica de graduação do curso de Farmácia, Departamento de Análises Clínicas, da UEM

^IIIAcadêmica de graduação do curso de Farmácia, Departamento de Análises Clínicas, da UEM

^IVAcadêmico de pós-graduação em Análises Clínicas da UEM

^VDoutora do Departamento de Ciências Básicas da Saúde, Laboratório de Imunogenética, da UEM

^VIDoutora do Departamento de Ciências Básicas da Saúde, Laboratório de Imunogenética, da UEM

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Receptores killer cell immunoglobulin-like (KIRs) são moléculas localizadas na superfície de células natural killer (NK) e em subpopulações de linfócitos T codificadas por genes do cromossomo 19q13.4. A interação entre receptores KIR e moléculas antígeno leucocitário humano (HLA) de classe I determina se células NK exercerão ou não sua função citotóxica e/ou secretora de citocinas ou se esta será inibida. Este trabalho teve por finalidade otimizar a metodologia para a genotipagem KIR, baseando-se nas condições descritas por Martin (2004). A técnica utilizada foi a reação em cadeia da polimerase com primers de sequência específica (PCR-SSP) com iniciadores sintetizados pela Invitrogen^® e visualização do produto amplificado em gel de agarose a 2% com brometo de etídio. Adaptações foram realizadas e a concentração de alguns reagentes foi alterada, como a do controle interno de 100 nM para 150 nM, iniciadores específicos senso e antissenso de KIR12.5/12.3, KIR13.5/13.3, KIR14.5/14.3, KIR22.5/22.3 e KIR36.5/36.3 de 500 nM para 750 nM e da solução de MgCl₂ de 1,5 mM para 2 mM. As concentrações dos demais reagentes e temperaturas de amplificação foram mantidas. Nessas condições, o uso da Taq DNA polimerase recombinante (Invitrogen^®) foi satisfatório. Os resultados das genotipagens de 70 indivíduos foram confirmados por rSSO-Luminex^® (One Lambda, Canoga Park, CA, EUA). A tipagem de genes KIR por essa técnica apresentou sensibilidade, especificidade, reprodutibilidade e baixo custo.

Unitermos: Células natural killer. Genotipagem. KIR. PCR-SSP. PCR-SSO.

ABSTRACT

The killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are molecules expressed on natural killer (NK) cells surface and in T-cell subsets encoded by genes located in chromosome 19q13.4. The interaction between KIR receptors and HLA class I molecules determines if the NK cells will fulfill their cytotoxic function and/or cytokine secretion or if this function will be inhibited. The objective of this work was to optimize KIR genotyping method described by Martin (2004). It was used PCR-SSP (polymerase chain reaction-sequence-specific primers) with primers synthesized by Invitrogen^® and visualization of the amplified products on 2% agarose gel electrophoresis, containing ethidium bromide. Some adaptations were made and the reagents had their concentrations increased: the internal control from 100 nM to 150 nM, forward and reverse specific primers KIR12.5/12.3, KIR13.5/13.3, KIR14.5/14.3, KIR22.5/22.3 and KIR36.5/36.3 from 500 nM to 750 nM, and MgCl₂ solution from 1.5 mM to 2 mM. Other reagent concentrations and amplification temperatures were maintained. Satisfactory results were obtained with Taq DNA Polymerase Recombinant (Invitrogen^®). The results of seventy samples were confirmed by rSSO-Luminex^® (One Lambda, Canoga Park, CA, USA). This KIR typing method proved to be accurate, specific, reproducible and cost effective.

Key words: Natural killer cells. Genotyping. KIR. PCR-SSP. PCR-SSO.

Introdução

As células natural killer (NK) desempenham importante papel na resposta imune inata, pois são responsáveis pela lise de células infectadas por vírus⁽⁴⁾, células tumorais^{(2, 22, 23, 58)} e células alogênicas⁽⁶⁾, como também secretam citocinas como interferon-gama (IFN-γ), fator de necrose tumoral (TNF) e fator estimulador de colônia granulócito-macrófago (GM-CSF)⁽⁴⁾. Possuem vários tipos de receptores em sua superfície, entre os quais receptores killer cell immunoglobulin-like (KIR), glicoproteínas pertencentes à superfamília das imunoglobulinas que têm como ligantes moléculas de antígeno leucocitário humano (HLA) de classe I⁽³¹⁾. Na ausência ou na expressão reduzida de moléculas HLA de classe I em células-alvo, estas são destruídas pelas células NK⁽²⁹⁾. Os receptores KIR podem ser de ativação e de inibição e, para que as células NK consigam distinguir alvos desprovidos ou não de moléculas HLA de classe I, é necessária a ligação simultânea nestes receptores⁽³¹⁾. Os sinais de inibição predominam sobre os de ativação, prevenindo, assim, a lise de células autólogas normais⁽³⁹⁾. A diversidade KIR está relacionada com a variabilidade no número de genes, no tipo de genes, de seus alelos e haplótipos^{(24, 50, 53)},e o polimorfismo KIR em humanos pode estar relacionado com a seleção natural exercida por patógenos⁽⁵⁰⁾.

Os receptores KIR são codificados por genes do complexo de receptores leucocitários (LRC), situados no cromossomo 19q13.4⁽⁵⁶⁾. Atualmente, 15 genes e dois pseudogenes KIR foram identificados^{(17, 19, 35)}: KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIR3DS1, KIR2DP1 e KIR3DP1. Até janeiro de 2009, foram descritos 335 alelos distribuídos nos diferentes locus⁽²⁵⁾. A importância da tipagem de genes KIR está relacionada com o conhecimento da diversidade desses genes em diferentes indivíduos e, consequentemente, em diferentes populações^{(1, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 16, 18, 21, 27, 33, 34, 38, 42, 43, 45-47, 49, 52, 57, 54, 55, 59)}, ao papel exercido por esses receptores na resposta imune inata, sua relação com a predisposição ou com a resistência ao desenvolvimento de doenças virais, autoimunes e tumorais^{(3, 15, 26, 28, 30, 32, 36)} e, ainda, à influência desse polimorfismo nos transplantes de medula óssea alogênicos⁽⁴⁸⁾.

Os métodos utilizados para detectar a presença ou ausência de genes KIR se baseiam em técnicas de biologia molecular: reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR)⁽⁵³⁾, reação em cadeia da polimerase com primers de sequência específica (PCR-SSP)^{(53, 19, 37, 51)}, reação em cadeia da polimerase com oligonucleotídeos de sequência específica (PCR-SSOP)⁽⁹⁾ e, mais recentemente, a técnica oligonucleotídeos de seqüência específica reversa rSSO com tecnologia Luminex^® para tipagem dos genes e alelos KIR⁽⁴¹⁾. A técnica PCR-SSP descrita por Martin⁽³⁷⁾ permite a análise de 14 genes e um pseudogene KIR a um custo não elevado, pois utiliza pouca quantidade de reagentes, muitos dos quais podem ser preparados no laboratório, e os iniciadores podem ser confeccionados a partir de sequências de bases predefinidas. Nesta técnica, a concentração de DNA deve ser de 10 ng e o volume final de reação, de 10 µl, recomendando-se o uso de Platinum Taq DNA Polimerase (Invitrogen^®).

O objetivo do presente estudo foi a otimização da técnica de PCR-SSP, descrita por Martin, tendo em vista a necessidade de métodos que apresentem sensibilidade, especificidade, fácil execução e interpretação, baixo custo e que não exijam equipamentos sofisticados.

Materiais e métodos

O estudo foi conduzido de acordo com as normas preconizadas pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Universidade Estadual de Maringá (COPEP-UEM), conforme Parecer 272/2004.

Cinco mililitros de sangue total de 70 indivíduos não relacionados e selecionados aleatoriamente foram coletados em tubos contendo (EDTA). As amostras foram obtidas de forma a abranger os genótipos KIR representativos da população brasileira⁽⁴⁷⁾. O sangue foi centrifugado para obtenção de uma camada rica em células nucleadas (creme leucocitário), a qual foi congelada em tubos de criopreservação até o momento da extração do DNA.

Extração de DNA

A extração de DNA foi realizada pelo kit EZ-DNA (Biological Industries^TM, Beit Haemek, Israel), de acordo com o protocolo do fabricante, a partir de 150 µl do creme leucocitário. O DNA foi reidratado com água de injeção e a concentração de DNA foi determinada no fluorômetro Qubit^TM (Invitrogen^®, Carlsbad, CA, EUA).

Genotipagem KIR

Para a genotipagem KIR foi utilizada a técnica PCR-SSP, descrita por Martin⁽³⁷⁾, com modificações para a tipagem de 14 genes e um pseudogene: KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIR3DS1 e KIR2DP1. Para o desenvolvimento desta técnica foram utilizados iniciadores confeccionados pela Invitrogen (Invitrogen^®, Carlsbad, CA, EUA).

De acordo com o procedimento padrão elaborado por Martin⁽³⁷⁾, a mistura da PCR foi preparada para o volume final de reação igual a 10 µl; tampão PCR 10X – 200 mM Tris-HCl (pH 8,4), 500 mM KCl; 1,5 mM de MgCl_2; 200 µM de cada dNTP; 100nM de iniciadores 5' e 3' do controle interno; 500 nM de iniciadores específicos; 0,25 unidade de Platinum Taq DNA Polimerase (Invitrogen^®, Carlsbad, CA, EA), 10 ng de DNA e água destilada estéril suficiente para completar o volume.

De início, a reação foi preparada com todos os reagentes e o DNA, exceto os iniciadores específicos. Essa mistura foi a seguir distribuída em microtubos de volume de 0,2 ml que continham os iniciadores na concentração final de 500 Nm (Tabela 1). A enzima utilizada foi a Platinum Taq DNA Polimerase (Invitrogen^®, Carlsbad, CA, EUA), recomendada por fornecer melhores resultados, ou a Taq DNA Polimerase Recombinante (Invitrogen^®, Carlsbad, CA, EUA). As temperaturas e condições de amplificação foram: desnaturação inicial a 94ºC por 3 minutos, quatro ciclos de 94ºC por 15 segundos, anelamento a 65ºC por 15 segundos e extensão a 72ºC por 30 segundos, 21 ciclos de 94ºC por 15 segundos, 60ºC por 15 segundos e 72ºC por 30 segundos, 5 ciclos de 94ºC por 15 segundos, 55ºC por 1 minuto e 72ºC por 2 minutos e, finalizando, a 72ºC por 7 minutos. Para as amplificações foram utilizados os termocicladores Perkin Elmer GeneAmp 9600 e Applied Biosystem GeneAmp 9700 (Foster City, CA, EUA). Modificações dessas condições foram realizadas quando necessário.

A visualização do produto amplificado foi realizada em gel de agarose a 2% com brometo de etídio (5 g/ml), contra luz ultravioleta. A visualização e a fotodocumentação foram realizadas no transiluminador BioDoc-It^TM Imaging System (UVP Upland, CA, EUA). O controle interno amplificou um fragmento de 796 pb do terceiro íntron de HLA-DRB1.

Validação do método

Para validação do método foram utilizados dois kits comerciais: rSSO Luminex^® (One Lambda, Canoga Park, CA, EUA) do lote 002 e o kit de genotipagem KIR SSP (DYNAL^® Invitrogen Corporation) do lote 003.

O princípio da técnica rSSO Luminex^® se baseia primeiramente na amplificação do DNA-alvo por PCR, utilizando três grupos de iniciadores específicos para os éxons 3, 5 e 7-9, em reações separadas. Cada produto de PCR é biotinilado, o que permite a sua detecção pelo conjugado ficoeritrina-estreptavidina (SAPE). Em seguida, cada produto de PCR é desnaturado para ser hibridizado com sondas conjugadas a microesferas fluorescentes codificadas. O DNA hibridizado e ligado às microesferas é marcado com SAPE e a reação é lida no citômetro de fluxo LABScan^TM 100, que identifica a intensidade de fluorescência da ficoeritrina em cada microesfera.

O kit de genotipagem KIR SSP da Invitrogen^TM é um método baseado na PCR que utiliza sequência específica de iniciadores para a detecção da presença e ausência de genes KIR. O produto da PCR é dispensado em gel de agarose a 2% com brometo de etídio, seguido de eletroforese e visualização contra luz ultravioleta. Para a interpretação dos resultados utiliza-se uma ficha de interpretação padrão proveniente do fabricante.

Resultados

Alteração da concentração do controle interno de 100 nM para 150 nM

As primeiras tipagens foram realizadas de acordo com as condições descritas por Martin⁽³⁷⁾. Como o padrão de bandas do controle interno foi muito fraco, diferentes concentrações do par de iniciadores que amplificava o controle interno foram testadas: 150 nM, 180 nM e 200 nM (dados não mostrados). A menor concentração com melhor resultado foi de 150 nM. Dessa forma, a concentração dos iniciadores do controle interno foi alterada de 100 nM para 150 nM (Figura 1).

Alteração da concentração de iniciadores específicos de 500 nM para 750 nM

Os segundos pares dos iniciadores que amplificam os genes KIR2DL4, KIR2DS2, KIR3DS1 e KIR3DL3 apresentaram padrão de banda com menor intensidade (Figura 2). Por isso foi alterada a concentração do segundo par de iniciadores específicos KIR8.5/8.3 (2DL4), KIR12.5/12.3 (2DS2), KIR22.5/22.3 (3DS1), KIR36.5/36.6 (3DL3). O melhor resultado foi obtido quando a concentração final dos iniciadores específicos KIR12.5/12.3, KIR22.5/22.3 e KIR36.5/36.6 foi aumentada de 500 nM para 750 nM (Figura 3). A concentração final do segundo par de iniciadores (KIR8.5/8.3) que amplifica KIR2DL4 foi mantida em 500 nM.

Para o gene KIR2DS3 foram realizados testes com as concentrações finais de 500 nM e 750 nM para os dois pares de iniciadores: KIR13.5/13.3 e KIR14.5/14.3. Para ambos, os melhores resultados foram obtidos na concentração final de 750 nM.

Alteração na concentração de cloreto de magnésio (MgCl₂) de 1,5 mM para 2 mM

Como o padrão de banda dos genes KIR2DS2, KIR3DS1 e KIR3DL3 continuava fraco, mesmo após aumento na concentração do segundo par dos iniciadores KIR12.5/12.3 (2DS2), KIR22.5/22.3 (3DS1) e KIR36.5/36.6 (3DL3) para 750 nM, uma modificação na concentração de MgCl₂ foi realizada. A alteração da concentração de 1,5 mM para 2 mM contribuiu para a obtenção de melhores resultados (Figura 4).

Verificação da ocorrência de reações inespecíficas

Na PCR, o cloreto de magnésio atua como cofator para a enzima Taq DNA polimerase e sua presença é indispensável; no entanto, em excesso, pode provocar reações inespecíficas⁽⁴⁴⁾. Em nosso experimento, o desenvolvimento da PCR usando solução de MgCl₂ a 2 mM (acima da recomendada pelo protocolo original, ou seja, 1,5 mM) não provocou a formação de reações inespecíficas, conforme apresentado na Figura 6.

Uso da enzima Taq DNA polimerase recombinante

De acordo com o protocolo padrão, melhores resultados são obtidos com o uso da enzima Platinum^®Taq DNA polimerase. No entanto, a enzima Taq DNA polimerase recombinante (Invitrogen^®, Carlsbad, CA, EUA) mostrou eficiência na PCR para tipagem de genes KIR. Os resultados são apresentados na Figura 5.

Condições finais da reação

As condições finais da PCR para a tipagem de genes KIR adequadas às nossas condições laboratoriais são descritas a seguir: para 10 µl de reação foram utilizados de tampão PCR 10X – 200 mM Tris-HCl (pH 8,4) e 500 mM KCl; 2 mM de MgCl_2; 200 µM de cada desorribonuleotídeo trifosfatado (dNTP); 150 nM de iniciadores 5' e 3' do controle interno; 750 nM dos iniciadores específicos KIR12.5/12.3 (2DS2), KIR13.5/13.3 e KIR14.5/14.3 (2DS3), KIR22.5/22.3 (3DS1), KIR36.5/36.6 (3DL3) e 500 nM para os demais; 0,25 unidade de Platinum Taq DNA polimerase (Invitrogen^®, Carlsbad, CA, EUA) ou Taq DNA polimerase recombinante (Invitrogen^®, Carlsbad, CA, EUA); aproximadamente 10 ng de DNA e água destilada estéril suficiente para completar 10 µl. As temperaturas e condições de amplificação foram mantidas.

Validação do método

As 70 amostras genotipadas por PCR-SSP foram analisadas pelo kit de genotipagem rSSO (One Lambda, Canoga Park, EUA), tecnologia Luminex^®. Três amostras apresentaram resultados divergentes em apenas um gene KIR, sendo duas amostras para KIR2DS5 e uma para KIR2DL1, e essas diferenças se mantiveram após a repetição por ambas as técnicas.

Uma amostra genotipada como positiva para o gene KIR2DS5 e outra como positiva para o gene KIR2DL1, pelo método PCR-SSP otimizado, foram genotipadas como negativas pelo método rSSO Luminex^®, enquanto, uma amostra genotipada como negativa para o gene KIR2DS5 pelo método PCR-SSP otimizado foi positiva pelo rSSO Luminex.

No entanto, quando essas amostras foram avaliadas pelo kit comercial de genotipagem KIR SSP (DYNAL^® Invitrogen Corporation, lote 003), para confirmação dos resultados, houve concordância com todos os resultados referentes às reações da PCR-SSP otimizada.

Discussão

A partir da genotipagem KIR descrita por Uhrberg et al.⁽⁵³⁾, vários grupos desenvolveram metodologias para a tipagem destes genes^{(9, 19, 34, 41, 51)}, de forma a obter um aprimoramento na identificação dos genes e permitir a definição dos alelos.

Os métodos utilizados para detectar a presença ou ausência de genes KIR se baseiam em técnicas de biologia molecular. Pela técnica RT-PCR, Uhrberg et al.⁽⁵³⁾ verificaram que a combinação de genes KIR em humanos é altamente polimórfica, levando à expressão de diferentes fenótipos. No mesmo estudo, eles desenvolveram a metodologia PCR-SSP para identificar 12 genes KIR a partir do DNA genômico, obtido de células mononucleares do sangue periférico.

Crum et al.⁽⁹⁾ utilizaram a técnica molecular PCR-SSOP para tipagem de 12 genes KIR, com base na amplificação de três diferentes regiões: os domínios extracelulares do tipo imunoglobulina proximal e distal à membrana e os domínios transmembranal-citoplasmático, seguida da hibridização com sondas de sequência específica marcadas com digoxigenina. Por esta técnica também conseguiram distinguir dois alelos de KIR3DL1.

Em 2002, Gómez-Lozano e Vilches⁽¹⁹⁾ identificaram genes e pseudogenes recém-descritos KIR2DL5, KIR3DL3, KIR3DP1 e KIR2DP1 e as variantes de KIR2DL5, utilizando a técnica PCR-SSP.

A genotipagem KIR pela técnica PCR-SSP, utilizando iniciadores que fornecem pequenos amplicons (108-565 pb), foi descrita por Sun et al.⁽⁵¹⁾ e aprimorada por Martin⁽³⁷⁾. Essa técnica apresentou como vantagens a economia no custo de reagentes e de mão de obra qualificada e a obtenção de bons resultados com DNA parcialmente degradado.

A técnica rSSO com tecnologia Luminex^® para tipagem dos genes e alelos KIR foi descrita por Nong et al.⁽⁴¹⁾. Essa técnica apresenta como vantagens a determinação de alelos nulos não identificados por métodos convencionais e permite a análise de várias amostras em um sistema múltiplo. No entanto, o custo é elevado quando comparado com as outras técnicas.

Neste estudo, a proposta foi a otimização de uma metodologia de genotipagem KIR por PCR-SSP, de baixo custo, fácil execução, reprodutível e confiável, utilizando iniciadores sintetizados. A metodologia foi baseada na PCR-SSP descrita por Martin⁽³⁷⁾, que permitiu a detecção de 14 genes KIR e um pseudogene, o KIR2DP1. O produto de amplificação foi um pequeno fragmento em sua maioria, de 90 a 200 pb; dois produtos apresentaram aproximadamente 300 pb, um 550 pb e outro com 800 pb. Todos os produtos foram facilmente identificados e definidos em gel de agarose.

Para a confiabilidade das reações foi utilizado um controle interno para cada reação que amplifica o terceiro íntron do gene HLA-DRB1, cujo produto é um fragmento de 796 pb. O uso do controle interno na PCR determina se a ausência de amplificação específica é realmente devida à ausência do gene na amostra de DNA, e não à falha de amplificação de PCR⁽¹²⁾. Devido a diferentes concentrações e temperaturas de hibridização dos iniciadores específicos comparados com os iniciadores do controle interno, a intensidade da banda do controle geralmente foi menos intensa quando ocorreu amplificação específica^{(12, 19)}.

Para confirmar a presença ou ausência de um determinado gene foram realizadas duas reações com diferentes pares de iniciadores, os quais amplificavam diferentes éxons de um mesmo gene, exceto para KIR2DS1 e KIR2DS5, com reação única.

A análise envolveu 15 genes em 70 indivíduos não relacionados pela técnica PCR-SSP otimizada e por rSSO sistema Luminex^®, totalizando 1.050 tipagens. Do total das amostras avaliadas, foram observados resultados divergentes para três genes, sendo um para o gene KIR2DL1 e outros dois para o gene KIR2DS5 (0,29%; p = 0,2478). Esses resultados se mantiveram conflitantes após repetição das genotipagens por ambas as metodologias.

Em função desses resultados conflitantes, foi utilizada uma terceira metodologia, que usa o kit comercial de genotipagem KIR SSP (DYNAL^® Invitrogen Corporation, lote 003) para genotipar essas amostras. Os resultados foram concordantes com aqueles obtidos na PCR-SSP otimizada e, consequentemente, discordantes do método rSSO comercial Luminex^®. Dessa forma podemos observar que todos os resultados obtidos na PCR-SSP otimizada foram confirmados por uma ou outra técnica comercial.

Podem existir algumas explicações para essas divergências, como a especificidade dos primers e sondas utilizados nas técnicas de SSO e SSP, os quais podem se ligar a regiões diferentes dos genes KIR2DS5 e KIR2DL1; a utilização de um único primer e sonda para identificar o gene KIR2DS5, pela ausência de outra sequência capaz de identificá-lo; problemas técnicos, como a reduzida ou aumentada sensibilidade dos primers usados, resultando em falsos positivos ou falsos negativos ou a caracterização de variantes alélicas. O sequenciamento genômico é a única maneira de averiguar esses achados.

Interessantemente, resultados divergentes também foram observados em uma caracterização multilaboratorial (três laboratórios) de genotipagem KIR para o Décimo Workshop Internacional de Histocompatibilidade⁽⁷⁾. Do total de 25 linhagens celulares, três apresentaram divergências para esses mesmos genes, KIR2DL1 e KIR2DS5, quando genotipadas pelas técnicas de PCR-SSP e PCR-SSOP.

Esses resultados poderiam sugerir que a tipagem para esses particulares genes KIR devem ser observadas com cautela e que futuros estudos são necessários para resolver esse fato, o que pode incluir a construção de primers e sondas mais específicos.

Uma das vantagens dessa técnica foi relacionada com a concentração de DNA, ou seja, 10 ng em cada reação. No entanto, a qualidade e a concentração de DNA são pontos críticos da reação. Outras vantagens foram o baixo custo, pois utiliza pouca quantidade de reagentes (volume final da reação foi de 10 µl), e a possibilidade de ser desenvolvida em laboratório de biologia molecular sem a exigência de equipamentos sofisticados. Além disso, a enzima Platinum Taq DNA polimerase (Invitrogen^®, Carlsbad, CA, EUA) pôde ser substituída pela Taq DNA polimerase recombinante (Invitrogen^®, Carlsbad, CA, EUA), de menor custo.

Finalmente, essa técnica mostrou sensibilidade, especificidade, reprodutibilidade e que pode ser de fácil execução para a maioria dos laboratórios de biologia molecular.

Conclusão

A metodologia PCR-SSP otimizada neste estudo pode ser utilizada por laboratórios de biologia molecular em diversos estudos de genotipagem KIR, a qual se mostrou sensível, específica, reprodutível, de fácil execução e baixo custo.

Agradecimentos

Os autores agradecem aos voluntários que participaram deste estudo e ao Dr. Eduardo José Melo dos Santos e à Dra. Luiza Tamie Tsuneto pelas sugestões e críticas na leitura do manuscrito.

Primeira submissão em 20/05/08

Última submissão em 16/03/10

Aceito para publicação em 12/04/10

Publicado em 20/06/10

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Ago 2010
• Data do Fascículo
  Jun 2010

Histórico

• Recebido
  16 Mar 2010
• Aceito
  12 Abr 2010