Comportamento de fungos e de sementes de feijoeiro durante o teste de envelhecimento artificial

Behavior of fungi and of bean seeds during the artificial aging test

COMPORTAMENTO DE FUNGOS E DE SEMENTES DE FEIJOEIRO DURANTE O TESTE DE ENVELHECIMENTO ARTIFICIAL¹

MONALISA ALVES DINIZ DA SILVA² e WALTER RODRIGUES DA SILVA³

RESUMO - O teste de envelhecimento artificial, recomendado para avaliar o vigor de lotes de sementes, apresenta variabilidade em seus resultados; a ação dos fungos é considerada uma das causas dessa variabilidade. Este trabalho objetivou verificar os efeitos de diferentes períodos de envelhecimento artificial, no comportamento fisiológico de sementes do feijoeiro e dos fungos Aspergillus spp., Penicillium spp., Fusarium oxysporum e Colletotrichum lindemuthianum, inoculados artificialmente. Foram conduzidos testes de sanidade, germinação, tetrazólio, emergência, condutividade elétrica e lixiviação de potássio. As respostas obtidas, dependentes da duração do período de envelhecimento, indicaram efeitos da espécie fúngica presente. Concluiu-se que o teste de envelhecimento artificial associa a expressão de causas fisiológicas e sanitárias, o que prejudica a interpretação dos dados obtidos; a presença de fungos, principalmente de Aspergillus spp., pode ser considerada como capaz de interferir de modo negativo no desempenho das sementes envelhecidas artificialmente.

Termos para indexação: Phaseolus vulgaris, sanidade, qualidade fisiológica, germinação.

BEHAVIOR OF FUNGI AND OF BEAN SEEDS DURING THE ARTIFICIAL AGING TEST

ABSTRACT - Although recommended for evaluation of seed lot vigor, artificial aging test shows results variability for reasons yet to be elucidated. Seed-fungi association is considered one of the causes responsible for such variation. The goal of this work was to verify the effects of periods of artificial aging on bean seed behavior and on Aspergillus spp., Penicillium spp., Fusarium oxysporum and Colletotrichum lindemuthianum fungi artificially inoculated by contact method. Health, germination, tetrazolium, emergence, electrical conductivity and potassium leaching tests were performed for seed behavior evaluation. The answers achieved, besides dependable on the aging time period, indicated the effect of fungi species associated to the seed. The artificial aging test was found to be associated with the expression of physiological and sanitary causes that interfere with data interpretation; the presence of fungi, mainly Aspergillus spp., may be considered capable of interfering in the behavior of artificially aged seeds in a negative way.

Index terms: Phaseolus vulgaris, health test, physiological quality, germination.

INTRODUÇÃO

O teste de envelhecimento artificial tem sido considerado eficiente para avaliar o vigor de lotes de sementes; ao mesmo tempo em que identifica pequenas diferenças de vigor, pode estimar o potencial de conservação da semente. A sua condução, sob condições de elevadas temperaturas e umidade relativa do ar, ocasiona a deterioração das sementes e favorece o aparecimento, na germinação subseqüente, de anormalidades ou morte (McDonald et al., 1993).

As perdas na germinação e no vigor, medidas através do teste de tetrazólio em sementes de feijão, soja e amendoim envelhecidas artificialmente, correlacionaram-se com o aumento da lixiviação eletrolítica (Parrish & Leopold, 1978; Pearce & Abdel Samad, 1980). Este aumento, da lixiviação de solutos nas sementes envelhecidas, tem sido relatado como decorrente da deterioração das membranas celulares (Ching & Schoolcraft, 1968; Ching, 1972). Mullet & Considine (1980), trabalhando com ervilha e feijão, observaram que a concentração de K⁺ foi alterada com a duração dos períodos de embebição e de envelhecimento das sementes. Quando o período de envelhecimento aumentou, a habilidade das membranas de restabelecerem a semipermeabilidade ficou reduzida, havendo maiores perdas de K⁺ durante os estágios iniciais de embebição.

Com o objetivo de determinar, indiretamente, as condições sanitárias das sementes, Menten (1978) procurou correlacionar testes de vigor e de germinação com a incidência de microrganismos em sementes de feijão; observou relação inversa entre a incidência de microrganismos e os resultados dos testes fisiológicos. Marcos Filho (1994) ressaltou que temperatura e umidade elevadas podem inibir a manifestação de alguns microrganismos; assim, os dados obtidos no teste de envelhecimento podem ser superiores aos observados no teste de germinação com as mesmas amostras. Portanto, as condições impostas pelo teste de envelhecimento artificial não agiriam apenas no comportamento das sementes, mas também influenciariam na ação de microrganismos participantes da deterioração. A peroxidação de lipídios em sementes envelhecidas de soja e ervilha, ao provocar maior liberação de aldeídos voláteis, estimulou a germinação de esporos de fungos presentes durante a germinação das sementes (Harman et al., 1982).

Ao observar aumento na taxa de germinação em sementes tratadas com fungicidas e submetidas ao teste de envelhecimento artificial, Sinclair, citado por Menten (1978), considerou que o vigor da semente estaria associado, primordialmente, à ação de microrganismos. Foi constatado que o tratamento fungicida elevou a germinação em sementes de soja infectadas com Aspergillus glaucus e Aspergillus niger e submetidas ao envelhecimento artificial (McDonald et al., 1993), o que confirma as observações de Sinclair, citado por Menten (1978). Da mesma forma, Furlan (1986) observou que a presença de Fusarium spp. contribuiu na redução da qualidade fisiológica de sementes de feijão postas a envelhecer artificialmente.

Assim, apesar das evidências da ação dos fungos na avaliação do vigor das sementes, especialmente no teste de envelhecimento artificial, os métodos recomendados não estimam a participação relativa dos microrganismos nos resultados obtidos para o desempenho fisiológico (McDonald et al., 1993).

Este trabalho teve como objetivo estudar o comportamento de fungos e de sementes de feijoeiro durante o teste de envelhecimento artificial.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram conduzidos quatro experimentos com sementes de feijoeiro, previamente avaliadas por meio de determinação de sanidade. Os três primeiros experimentos consistiram, cada um, dos seguintes pré-tratamentos:

a) Assepsia: as sementes foram desinfectadas superficialmente com hipoclorito de sódio 0,02% por três minutos, lavadas com água destilada e, posteriormente, postas para secar em papel toalha por duas horas.

b) Assepsia + BDA: após desinfecção superficial, as sementes foram colocadas em placas de Petri contendo meio de cultura BDA (200 g de batata, 15 g de ágar, 20 g de dextrose, 1.000 mL de água destilada) isento de fungos, onde permaneceram por 48 horas em câmara de incubação sob 20 ± 2ºC e luz alternada em ciclos de 12 horas de luz branca fluorescente/12 horas de escuro (Menten, 1988).

c) Assepsia + BDA + fungo: inoculação artificial com os fungos Aspergillus spp., Penicillium spp. e Fusarium oxysporum, respectivamente, nos experimentos 1, 2 e 3. Primeiramente, foi obtida a cultura pura do fungo, em tubos de ensaio, com posterior desenvolvimento em placas de Petri contendo meio de cultura BDA. Quando o material repicado do fungo se desenvolveu na superfície do meio de cultura BDA, nova repicagem foi feita para as placas onde se deu a inoculação artificial pelo método de contato. Este consistiu em colocar 60 sementes previamente desinfectadas superficialmente em cada placa de Petri, num procedimento semelhante ao realizado por Tanaka et al. (1989) com algodão; para que houvesse adesão do inóculo à superfície das sementes, as placas foram agitadas manualmente. O período de incubação foi de 48 horas sob 20 ± 2ºC e luz alternada em ciclos de 12 horas de luz branca fluorescente/12 horas de escuro (Menten, 1988).

O quarto experimento consistiu de assepsia + meio de cultura de vagem de feijão + fungo. O meio de cultura de vagem (200 g de vagem, 16 g de ágar, 20 g de dextrose, 1.000 mL de água destilada) foi utilizado para a inoculação artificial, pelo método de contato, do fungo Colletotrichum lindemuthianum. Primeiramente, para a preparação deste meio, vagens de feijão-vagem (Phaseolus vulgaris L.), próprias para o consumo in natura, foram batidas com água destilada em liquidificador, cozidas em banho-maria por 30 minutos e, depois, filtradas; o extrato foi misturado com ágar e dextrose, para se proceder à autoclavagem por 40 minutos. O período de incubação, de 48 horas, foi conduzido à temperatura de 20 ± 2ºC e sob luz alternada em ciclos de 12 horas de luz ultravioleta/12 horas de escuro (Menten, 1988).

Em todos os pré-tratamentos, com exceção do de assepsia exclusiva, o período de incubação foi seguido por secagem (30ºC em estufa com circulação de ar) até que as sementes, inicialmente com teores de água entre 38,2% e 43,4%, atingissem valores de 11% a 13%.

Os tratamentos foram obtidos pela submissão das sementes, dos quatro experimentos, ao envelhecimento artificial em câmara a 42ºC e 100% de U.R., por períodos de 0, 24, 48, 72 e 96 horas. As sementes foram dispostas em minicâmaras (gerbox adaptado) com 40 mL de água destilada em seu interior.

Ao término dos períodos de envelhecimento e antes da realização das determinações, procedeu-se à secagem das sementes em estufa com circulação de ar, à temperatura de 30ºC, objetivando padronizar o teor de água e, dessa forma, atenuar o efeito dessa variável física na interpretação dos dados. O teste de germinação foi conduzido também com sementes não submetidas à secagem.

A avaliação do estado sanitário das sementes foi feita pelo método do papel de filtro (Neergaard, 1979) sem congelamento blotter test, a 20ºC, sob 12 horas de luz fluorescente/12 horas de escuro; a semeadura foi efetuada sobre quatro folhas de papel de filtro umedecidas em água destilada. Foram avaliadas 50 sementes por repetição; após sete dias de incubação, foram verificadas a identidade e a freqüência, de cada microrganismo encontrado, com o auxílio de microscópio estereoscópico ou composto.

A germinação foi realizada com 50 sementes por repetição, sob temperatura de 25ºC, utilizando substrato de papel toalha-Germitest, em forma de rolo, umedecido na proporção de duas vezes e meia o peso do papel em volume de água. As contagens, feitas aos quatro e sete dias após a semeadura, computaram a porcentagem final de plântulas normais, conforme os procedimentos descritos em Brasil (1992).

A viabilidade das sementes foi determinada por meio do teste de tetrazólio, com o emprego de 25 sementes/repetição pré-condicionadas, em papel toalha, umedecido por 16 horas, em germinador sob temperatura de 25ºC. Após o pré-condicionamento, as sementes foram imersas em solução de tetrazólio (0,075%), sob temperatura de 41ºC, por três horas, em estufa sem iluminação interna. Vencido o prazo, as sementes foram retiradas do ambiente aquecido, e em seguida, lavadas com água e mantidas submersas em água refrigerada (10ºC) até o momento da avaliação, que, por sua vez, considerou os critérios de viabilidade estabelecidos por França Neto et al. (1988).

O teste de emergência das plântulas constou da semeadura de 50 sementes por repetição, em campo mantido sob irrigação, em linhas de 2,0 m espaçadas de 0,3 m entre si. A avaliação, realizada aos 21 dias após a semeadura, computou a porcentagem de plântulas emersas, em método semelhante ao adotado por Nakagawa (1994).

A condutividade elétrica foi conduzida com a utilização de 25 sementes por repetição. Após a pesagem, as sementes foram imersas em 75 mL de água destilada para permanência em germinador, durante 24 horas, à temperatura de 20ºC. Ao término do período, a condutividade elétrica da solução foi determinada em condutivímetro; os valores obtidos foram expressos em µmhos/cm/g de sementes (Marcos Filho et al., 1987).

Para a avaliação da lixiviação de potássio, foi utilizada a metodologia desenvolvida por Amorim (1978) e adaptada por Marcos Filho et al. (1982, 1984). Foram utilizadas 25 sementes por repetição, que, após pesagem em balança de precisão 0,01 g, foram colocadas em copos de plástico com 75 mL de água destilada, durante 90 minutos, em germinador a 30ºC. A agitação da água foi feita no início e no final deste período; em seguida, foi realizada a determinação em fotômetro de chama. Os dados foram expressos em ppm de K por grama de sementes.

Foi adotado delineamento experimental inteiramente ao acaso, com quatro repetições. A análise de variância foi conduzida isoladamente em cada experimento. A comparação de médias foi efetuada, quando necessário, empregando o teste de Tukey a 5% de probabilidade.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Análise sanitária

A análise sanitária das sementes, antes da aplicação dos pré-tratamentos e dos tratamentos, revelou uma incidência de 11% e 2%, respectivamente de Aspergillus spp. e Penicillium spp. Os dados referentes à análise sanitária das sementes (Tabela 1) revelaram que a assepsia não foi eficiente na eliminação de Aspergillus spp., e sua incidência aumentou com o período de envelhecimento, em todos os experimentos, principalmente quando o BDA e o meio de vagem foram empregados. No caso do Penicillium spp., também não eliminado pela assepsia, a população tendeu à redução com as ampliações do período de envelhecimento e da população de Aspergillus spp.

O crescimento da incidência de Aspergillus spp. com o aumento do período de envelhecimento manteve-se evidente mesmo quando os demais fungos foram inoculados. Apenas a presença de Fusarium oxysporum conseguiu impedir que a população de Aspergillus spp. atingisse 100% de incidência em 96 horas de envelhecimento.

Tais fatos, além de confirmar que as condições de envelhecimento artificial favorecem o desenvolvimento de microrganismos, destacam a tendência de domínio do Aspergillus spp. sobre os demais fungos presentes. Por outro lado, além de ficar demonstrada a falibilidade do método de assepsia (Lima et al., 1982), o estudo dos efeitos fisiológicos do envelhecimento das sementes ficou prejudicado pelo comportamento do Aspergillus spp.

O método de inoculação, quando considerados os experimentos 1, 2 e 3, mostrou-se eficiente ao proporcionar a contaminação prevista em todas as sementes. Por outro lado, a inoculação de Colletotrichum lindemuthianum (experimento 4), além de contaminar um reduzido número de sementes, não foi adequada a partir de 48 horas, de envelhecimento, uma vez que a presença do microrganismo não foi mais detectada; dessa forma, os dados obtidos deixaram de ser apresentados.

No experimento 1, a ampliação do período de envelhecimento proporcionou, em assepsia e em assepsia + BDA, elevação da ocorrência de Aspergillus spp. nas sementes. Em assepsia + BDA + Aspergillus spp., a ocorrência de 100% do fungo foi mantida em todos os períodos, similarmente ao verificado no experimento 3 no que tange ao Fusarium oxysporum. No caso da inoculação com Penicillium spp. (experimento 2), a população do microrganismo decresceu à medida que o período de envelhecimento foi sendo prolongado.

A técnica de assepsia não pôde ser avaliada em relação aos fungos de campo Fusarium oxysporum e Colletotrichum lindemuthianum, porque estavam ausentes originalmente, mas ficou evidente sua inadequação para eliminação dos fungos de armazenamento, Aspergillus spp. e Penicillium spp. A ampliação do período de envelhecimento, ao mesmo tempo que favoreceu a estabilidade dos fungos Aspergillus spp. e Fusarium oxysporum ou elevação da população de Aspergillus spp., mostrou-se como fator adverso ao desenvolvimento de Penicillium spp. e de Colletotrichum lindemuthianum.

Germinação

O teste de germinação, conduzido sem secagem (Tabela 2) e com secagem (Tabela 3), após o teste de envelhecimento artificial, permitiu identificar efeitos interativos entre os pré-tratamentos e os tratamentos utilizados. De modo geral, em todos os experimentos, o aumento na incidência de Aspergillus spp. e o período de envelhecimento atuaram na redução progressiva da germinação.

Nos experimentos 1 (Aspergillusspp.) e 2 (Penicillium spp.), a germinação, independentemente da secagem, foi negativamente afetada pela elevação da ocorrência dos fungos (Tabela 1). Apesar de a inclusão do BDA haver promovido o crescimento populacional dos microrganismos, pareceu atenuar, no experimento 1, a partir de 24 horas e no experimento 2, a partir de 48 horas, o efeito causado pela associação dos fungos com os períodos de envelhecimento sobre a germinação nos demais experimentos.

No experimento 3, a ausência de Fusarium oxysporum (Tabela 1), nos pré-tratamentos de assepsia e assepsia + BDA, permitiu identificar a ação negativa de Aspergillus spp. e do período de envelhecimento, nas germinações conduzidas sem (Tabela 2) e com secagem prévia (Tabela 3). O uso do BDA confirmou a ação positiva desse meio de cultura sobre a germinação, a partir de 48 horas, em relação à assepsia exclusiva. A aparente ação negativa do Fusarium oxysporum na germinação foi, na maior parte dos períodos de envelhecimento, expressa pela inferioridade da assepsia + BDA + Fusarium oxysporum em relação à assepsia + BDA, que, conforme a Tabela 1, não apresentou incidência do fungo.

A técnica de aplicação de meios de cultura, para a inoculação de fungos nas sementes, demanda a existência de hidratação seguida por secagem sob baixa temperatura. Esta similaridade, com métodos de pré-condicionamento fisiológico (Heydecker et al., 1975; Tilden & West, 1985; Pandey, 1988), pode explicar os resultados do presente trabalho, que sugeriram efeitos dos meios de cultura na atenuação dos prejuízos fisiológicos provenientes da ampliação do período de envelhecimento artificial; segundo Pandey (1989), os efeitos deletérios do envelhecimento artificial podem ser anulados, pelo pré-condicionamento, em decorrência da recuperação qualitativa das sementes.

Além do teor de água e do período de envelhecimento, o grau de contaminação inicial (anterior ao envelhecimento), é fator que pode determinar a perda de viabilidade das sementes. Nas sementes infectadas com Aspergillus spp., o fungo se desenvolveu extensivamente, pelo tegumento, com o surgimento de estruturas de resistência nos períodos de 72 e 96 horas de envelhecimento. É possível que o avançado estágio de deterioração, determinado pela elevada intensidade da inoculação do fungo, tenha promovido a morte das sementes. McDonald et al. (1993) verificaram diferenças significativas na germinação de sementes de soja contaminadas, em diferentes níveis, com Aspergillus niger; após envelhecimento artificial por 64 horas, a elevação da contaminação correspondeu à redução na germinação.

No experimento 2 (Penicillium spp.), apareceu uma coloração vermelha nos tegumentos e na região de contato dos tegumentos com o papel de germinação, o que sugere uma associação entre a presença do fungo e a substância promotora da coloração.

Viabilidade

Os dados do teste de tetrazólio (Tabela 4) mostram que os prejuízos fisiológicos relacionados à elevação do período de envelhecimento apresentaram a mesma tendência que no teste de germinação (Tabelas 2 e 3).

Nos experimentos 2 (Penicillium spp.) e 3 (Fusarium oxysporum), a comparação entre os pré-tratamentos de assepsia + BDA e de assepsia + BDA + fungo não sugeriu, como o esperado (Tanaka & Corrêa, 1981; Furlan, 1986), ação negativa da presença dos fungos na viabilidade (Tabela 4). Por outro lado, no experimento 1 (Aspergillus spp.), apesar da constatação do crescimento populacional do microrganismo com a ampliação do período de envelhecimento em todos os pré-tratamentos, as diferenças de incidência do fungo, entre assepsia e assepsia + BDA + Aspergillus spp., indicaram associação entre a elevação populacional do fungo e a redução da viabilidade (Tabelas 1 e 4).

Considerando todos os experimentos, a comparação entre assepsia e assepsia + meio de cultura indica, na maior parte dos casos, efeitos favoráveis do meio de cultura na viabilidade, o que confirma o observado nos testes de germinação. Levando em conta que o teste de tetrazólio é conduzido a partir da avaliação de tecidos do embrião, o fato pode indicar, apesar da inexistência de relatos específicos na literatura, ação histológica reparadora do método de aplicação do meio de cultura.

Emergência das plântulas

De modo geral, em todos os experimentos, o aumento da população de Aspergillus spp. e do período de envelhecimento reduziu o desempenho das sementes (Tabelas 1 e ⁵). A interferência positiva do BDA no sentido de atenuar esse efeito, verificada nos testes de germinação e de tetrazólio, foi observada exclusivamente no experimento 2 (Penicillium spp.).

A atuação negativa dos fungos na qualidade das sementes, detectada pela maioria dos testes fisiológicos realizados, ficou expressa, com clareza, na emergência das plântulas do experimento 1 (Aspergillus spp.) e, moderadamente, na do experimento 2 (Penicillium spp.). No caso do experimento 3, contrariamente ao esperado, a presença do Fusarium oxysporum elevou o desempenho em algumas das situações de envelhecimento.

Condutividade elétrica e lixiviação de potássio

Os testes de condutividade elétrica e de lixiviação de potássio (Tabelas 6 e 7), empregados com a finalidade de estimar a integridade das membranas celulares, indicaram, com algumas exceções, as tendências observadas nos demais testes fisiológicos. Em todos os experimentos, o progresso da deterioração, indicado pela elevação no valor dos dados, aconteceu à medida que o período de envelhecimento era prolongado, e, conseqüentemente, a incidência de Aspergillus spp. era ampliada (Tabelas 1). A presença de Penicillium spp. e de Fusarium oxysporum não ficou associada à deterioração histológica.

Lin (1990), trabalhando com sementes de feijão envelhecidas artificialmente, observou relações diretas entre o aumento do período de envelhecimento e a quantidade de exsudatos da semente na água de embebição; atribuiu ao envelhecimento algumas mudanças nas membranas que, possivelmente, favorecem o aparecimento de danos aos tecidos embrionários durante a embebição.

O emprego de BDA manteve, em todos os experimentos, a capacidade de minimizar os efeitos fisiológicos negativos oriundos do processo de envelhecimento.

Considerações gerais

Os resultados de desempenho, parcialmente influenciados pela deterioração fisiológica advinda do envelhecimento, sofreram interferências da presença de fungos que, pela constância do surgimento de Aspergillus spp. em todos os experimentos, não puderam ser medidas, no tocante a cada fungo, com a precisão prevista pelo método empregado.

Dentre as incidências dos fungos estudados, a de Aspergillus spp. mostrou-se favorecida pela ampliação do período de envelhecimento artificial ao ponto de, em todos os experimentos, dificultar a diferenciação entre as causas fisiológicas e as sanitárias envolvidas na deterioração das sementes. Especialmente nos testes de tetrazólio, de condutividade elétrica e de lixiviação de potássio, que fazem uma estimativa da situação histológica existente no embrião, a presença de Aspergillus spp. pareceu diretamente envolvida com os danos celulares detectados.

CONCLUSÕES

1. O teste de envelhecimento artificial, associando causas fisiológicas e sanitárias em seus resultados, apresenta limitações para as estimativas de vigor.

2. A presença de fungos, principalmente de Aspergillus spp., interfere negativamente no desempenho fisiológico das sementes envelhecidas artificialmente.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  02 Out 2001
• Data do Fascículo
  Mar 2000

Histórico

• Aceito
  21 Jun 1999