Embriogênese somática in vitro em couve-comum

In vitro somatic embryogenesis of common cabbage

EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA IN VITRO EM COUVE-COMUM¹

VIRGÍNIA MARIA TENÓRIO SABINO DONATO², ARNÓBIO GONÇALVES DE ANDRADE³, JOSÉ BARBOSA CABRAL⁴ e GILBERTO DIAS ALVES⁵

RESUMO - O objetivo deste estudo foi obter calos e embriões somáticos de couve-comum (Brassica oleracea L., var. leucocephala) e caracterizá-los por meio de observações histológicas. Foram cultivadas, in vitro, explantes foliares, sob condições assépticas, em meio nutritivo MS, suplementado com várias combinações entre 2,4-D/BAP e 2,4-D/KIN. Na fase de indução de calos (fase I), houve o desenvolvimento de calos com características embriogênicas nos meios suplementados com 5,0 mg/L de 2,4-D; 1,0 mg/L de 2,4-D e 0,1 mg/L de BAP; 1,0 mg/L de 2,4-D e 1,0 mg/L de BAP e 2,0 mg/L de 2,4-D e 0,05 mg/L de BAP, que foram selecionados para o subcultivo em meio de regeneração (fase II). Nesta fase, foram utilizados meios de cultura suplementados com reduzidas concentrações de 2,4-D, BAP e AG₃, ou totalmente desprovidos destes, em que os calos permaneceram por mais 30 dias em cultivo. Os calos subcultivados nos meios de regeneração com 0,1 mg/L de BAP (R3) e 0,01 e 0,001 mg/L de BAP e 2,4-D respectivamente (R8), provenientes dos meios para indução, acrescidos de 5,0 mg/L de 2,4-D (M16) e 1,0 e 1,0 mg/L de BAP e 2,4-D (M30), desenvolveram estruturas semelhantes a embriões. No entanto, a caracterização histológica revelou a superioridade da interação entre os meios M30 e R8, para a regeneração de calos e embriões somáticos.

Termos para indexação: cultura de tecidos, calos, embriões somáticos.

IN VITRO SOMATIC EMBRYOGENESIS OF COMMON CABBAGE

ABSTRACT - The aim of this study was to obtain calluses and somatic embryos of common cabbage (Brassica oleracea L., var. leucocephala) and to characterize them by means of histological observations in vitro; foliar explants were cultivated under asseptic conditions in a nutritive MS medium supplemented with various combinations of 2,4-D/BAP and 2,4-D/KIN. During the induction phase of calluses (phase I), there was a development of calluses with embryogenic characteristics derived from the media (5.0 mg/L of 2,4-D), (1.0 mg/L of 2,4-D plus 0.1 mg/L of BAP), (1.0 mg/L of 2,4-D plus 1.0 mg/L of BAP) and (2.0 mg/L of 2,4-D plus 0.05 mg/L of BAP), that were chosen for subcultivation in regeneration media (phase II). In this phase, culture media were supplemented with reduced concentrations of 2,4-D, BAP and GA₃, or they were totally deprived of these supplements. In this case, the calluses remained in cultivation for other 30 days. The calluses that were subcultivated in the regeneration media R3 (0.1 mg/L of BAP) and R8 (0.001 mg/L of 2,4-D plus 0.01 mg/L of BAP), derived from the induction media M16 (5.0 mg/L of 2,4-D) and M30 (1.0 and 1.0 mg/L of 2,4-D and BAP), respectively, developed structures similar to embryos. However, this histological characterization revealed the superiority of the interaction between the M30 and R8 media for regeneration of the calluses and somatic embryos.

Index terms: tissue culture, calluses, somatic embryos.

INTRODUÇÃO

A embriogênese somática é definida como o processo de desenvolvimento de embriões a partir de células somáticas, ou seja, células que não são produto da fusão gamética (Dodds & Roberts, 1985). Embriões somáticos podem ser obtidos segundo dois padrões de desenvolvimento: a embriogênese somática indireta, na qual o calo é mantido formado e proliferado antes do desenvolvimento dos embriões, e a direta, em que os embriões se originam diretamente sobre a superfície do explante sem passar pela fase de proliferação de calo (Sharp et al., 1980; Mordhorst et al., 1997).

No caso da embriogênese indireta, o tecido cultivado desenvolve aglomerados de células que se dividem sucessivamente (calo), formando meristemóides ou nódulos vasculares que podem originar brotos, primórdios de raiz ou embrióides (Dodds & Roberts, 1985). Para determinar se o processo de desenvolvimento é organogênico ou embriogênico, são utilizados, com freqüência, em trabalhos desta natureza, estudos histológicos dos calos e estruturas regeneradas (Falco et al., 1996a, 1996b; Matsumoto et al., 1996).

O primeiro caso de embriogênese somática in vitro foi relatado por Steward et al. (1958), em tecidos de cenoura (Daucus carota L.). Desde então, vem sendo estudado o potencial embriogênico das mais variadas culturas. No que se refere às brássicas, a regeneração via cultivo in vitro se dá, na maioria das vezes, pela diferenciação ou organogênese direta ou indireta, como foi obtido por Dunwell (1981) em tecidos foliares de couve-comum (Brassica oleracea L. var. acephala), de B. napus e B. campestris, ou a partir de segmentos de pedúnculo (Chrystey & Earle, 1991).

Lustinec & Horák (1970), por outro lado, relataram a obtenção de embriões somáticos de B. campestris. Huang et al. (1990) e Phippen & Ockendon (1990) conseguiram regenerar embriões a partir de micrósporos de B. napus e B. campestris, respectivamente, viabilizando assim o estabelecimento de metodologias para a obtenção de plantas haplóides.

Este trabalho teve como objetivo estabelecer um protocolo adequado para a regeneração de embriões somáticos a partir de tecido foliar de couve-comum e subseqüente caracterização por meio de estudos histológicos.

MATERIAL E MÉTODOS

O material vegetal utilizado neste trabalho, couve-comum (B. oleracea L. var. acephala), foi fornecido pelo programa de hortaliças do IPA (Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária). Como fonte de explante, foram utilizadas folhas imaturas coletadas em gemas caulinares apicais e laterais de plantas transplantadas, com aproximadamente 20 dias, mantidas em telado.

Antes da secção dos explantes, as folhas foram submetidas a um processo de assepsia em álcool a 70% (v/v) por 1-3 minutos, e, em seguida, em hipoclorito de cálcio a 2% (p/v), por 15 minutos, e, finalmente, três lavagens em água destilada estéril.

Para indução de calos (fase I), foi utilizado o meio nutritivo MS (Murashige & Skoog, 1962), suplementado com uma fonte de auxina, o 2,4-D, combinado com as citocininas BAP e KIN (Tabelas 1 e 2), em que os explantes permaneceram por 30 dias em cultivo em sala de crescimento, com temperatura de 24 ± 1^oC, 16 horas de luz e 8 horas de escuro. Foram realizados dois experimentos com 20 tratamentos e quatro repetições, sendo distribuídos de forma inteiramente casualizada.

As avaliações foram realizadas após 30 dias de cultivo, levando-se em consideração a presença e intensidade de regeneração dos calos, para os quais foram atribuídas as notas de 0, 1 e 2 no tocante a ausência de calo, pouco calo e muito calo, respectivamente, e no tocante à presença ou ausência de nódulos, 0 ou 1. Para analisar os dados obtidos, foi aplicada a análise não-paramétrica pelo Kruskal-Wallis Statistic.

Para a regeneração ou amadurecimento das estruturas semelhantes a embriões somáticos (fase II), utilizou-se o mesmo meio nutritivo, com a concentração de sacarose reduzida de 30 para 20 g/L e suplementado com reduzidas concentrações de 2,4-D, BAP e AG₃ ou totalmente desprovido destes (Tabela 3). Nesta fase, os calos provenientes da fase I, avaliados e selecionados como calos embriogênicos, foram subcultivados por mais 30 dias, nas mesmas condições. Todos os meios foram solidificados com ágar, e o pH foi ajustado para 5,9 antes da autoclavagem a 120^oC por 15 minutos, para esterilização do meio de cultura.

O material usado para as observações histológicas foi fixado em Carnoy (ác. acético: álcool etílico - 1:3 v/v), durante 8 horas, e, após este período, mantidos em álcool a 70% (v/v) à temperatura ambiente. Os tecidos fixados foram desidratados e em seguida infiltrados e envoltos em parafina, segundo Johansen (1950). O material foi cortado com 10-15 mm, para montagem das lâminas, que foram, parte, coradas com safrarina e fast green, e parte, com hematoxilina eosina, para visualização dos núcleos.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Indução de calos de aspecto embriogênico

As citocininas podem favorecer a produção de calos embriogênicos (Chée & Cantliffe, 1990), mas, em algumas famílias, por exemplo, nas Umbelliferae, parece que não são necessárias (Horák et al., 1975). No presente trabalho, verificou-se que a KIN foi inefetiva para indução de calos embriogênicos, pois das 20 combinações entre 2,4-D e KIN somente foram selecionados os calos desenvolvidos nos meios desprovidos de KIN.

Mesmo assim, os calos provenientes dos meios acima referidos foram repicados, sendo parte submetida a observações histológicas, e parte subcultivada em meio para regeneração ou amadurecimento dos embriões, a partir do que, se verificou que os calos não apresentavam desenvolvimento de estruturas isoladas semelhantes a embriões somáticos, porém mostraram, nos estudos histológicos, que as células que constituíam os calos eram, na maioria, tipicamente embriogênicas. Ao contrário, para outras culturas, como o aipo (Willians & Collin, 1976), café (Sondahl & Sharp, 1977) e pepino (Chée, 1990), os autores observaram que entre outros reguladores de crescimento avaliados, a combinação entre 2,4-D e KIN apresentava maior freqüência de indução, tanto de calos como do próprio embrião somático.

Por outro lado, quanto às combinações entre 2,4-D e BAP, verificou-se que até mesmo na presença das mais reduzidas concentrações de BAP, como nos meios suplementados com 0,01 e 0,05 mg/L, os calos apresentavam melhor desenvolvimento e características embriogênicas mais definidas, como os nódulos mais proeminentes em relação aos calos cultivados na presença de KIN (Fig. 1A). Esses nódulos estiveram presentes em 82% dos calos cultivados na presença do BAP, enquanto na presença da KIN, apenas 60% dos calos apresentavam nodulações pouco desenvolvidas.

De acordo com a análise estatística, não houve diferença significativa quanto à intensidade de calo e à presença ou ausência de nódulos, tanto entre os tratamentos que combinaram o 2,4-D e KIN (Tabela 4), como entre os que combinaram 2,4-D e BAP (Tabela 5). No entanto, foram selecionados os provenientes dos meios contendo 0,01 e 1,0; 0,1 e 1,0; 1,0 e 1,0; 0,05 e 2,0 mg/L de BAP e 2,4-D, respectivamente, pois apresentavam maior quantidade de calo de coloração amarelada, além da presença intensa de nódulos, características que são atribuídas a calos embriogênicos (Chée, 1990). Esses resultados foram semelhantes às observações realizadas por Quazi (1978) em brócolis, e Chée & Cantliffe (1990) em batata-doce. Ambos afirmam que a presença de 0,45 mg/L de BAP aumentou o percentual de proliferação de calos embriogênicos. Os calos selecionados foram subdivididos, sendo uma parte subcultivada em meios de regeneração (Fase II) e outra parte destinada às observações histológicas.

A partir das análises histológicas, verificou-se que apenas os calos cultivados nos meios suplementados com 0,1 e 1,0; 1,0 e 1,0; 0,05 e 2,0 mg/L de BAP e 2,4-D, respectivamente, apresentavam estruturas isoladas muito semelhantes a embriões somáticos (Figs. 1B, 1C e 1D). Subseqüentemente, observou-se que o meio que continha maior concentração de BAP (1,0 mg/L) destacou-se, por apresentar maior número de estruturas que mostravam tecido vascular bem formado, além de apresentar duas polaridades, que se constituíram em características muito evidentes de embriões somáticos.

As evidências de diferenciação de embriões somáticos apresentados neste trabalho foram baseadas em estudos histológicos dos calos cultivados com maior e menor concentrações de BAP, o que permitiu observar a presença de estruturas isoladas bem definidas, semelhantes a embriões somáticos, nos calos selecionados em meio de cultura com maior concentração de BAP (1,0 mg/L). Essas estruturas apresentavam dupla polaridade e vasos bem visíveis, conectando o pólo meristemático apical ao radicular (Fig. 1E).

Regeneração de estruturas semelhantes a embriões somáticos

Segundo observações realizadas neste trabalho, dos calos selecionados durante a fase de indução, apenas os provenientes do meio com 5,00 mg/L de 2,4-D apresentaram características aparentes de diferenciação embriogênica, quando subcultivados em meios de regeneração (Fase II). Entre eles, apenas aquele com 0,1 mg/L de BAP destacou-se por promover o desenvolvimento de estruturas facilmente destacáveis, bem definidas e com dupla polaridade. Para melhor caracterização, esses calos e estruturas provenientes dos meios com 5,0 mg/L de 2,4-D na fase de indução de calo e 0,1 mg/L de BAP na fase de regeneração, foram submetidos a preparações e observações histológicas que confirmaram a habilidade embriogênica desse material, pela presença de estruturas que apresentavam tecido vascular bem formado e sem conexão com o calo de origem.

Da mesma forma, Nomura & Komamine (1985) observaram que embriões somáticos de cenoura foram induzidos pela transferência dos agregados de células embriogênicas para meios de cultura que continham apenas citocinina. Ao contrário, Smith & Street (1974) e McWilliam et al. (1974) observaram que o desenvolvimento de embriões somáticos, também de cenoura, foi promovido pela transferência do calo de um meio contendo 2,4-D, para outro totalmente desprovido de reguladores de crescimento.

De acordo com Evans et al. (1981), se o desenvolvimento do calo foi iniciado e mantido em meio com 2,4-D, este deve ser utilizado para completar o processo de desenvolvimento dos embriões. Entre os calos pré-cultivados em meios que combinaram BAP e 2,4-D, os meios com 0,1 e 1,0; 1,0 e 1,0; 0,05 e 2,0 mg/L de BAP e 2,4-D, respectivamente,destacaram-se, na primeira fase, inicialmente, por apresentarem calos com nódulos mais proeminentes, e posteriormente, pela presença de células com características embriogênicas e com estruturas semelhantes a embriões, constatadas nas análises histológicas. Durante a segunda fase, verificou-se que apenas os calos provenientes do meio constituído de 1,0 e 1,0 mg/L de BAP e 2,4-D, respectivamente, quando subcultivados em meio de regeneração com 0,001 mg/L de 2,4-D e 0,01 mg/L de BAP destacaram-se por promover o desenvolvimento de nódulos mais proeminentes, além de estruturas isoladas muito semelhantes a embriões (Fig. 2A).

Foi possível observar, mediante cortes longitudinais dos calos provenientes dos meios com 1,0 e 1,0 mg/L de BAP e 2,4-D (fase I) e 0,001mg/L de 2,4-D e 0,01 mg/L de BAP (fase II), o desenvolvimento de um embrião somático, desde o início da organização celular do nódulo (Fig. 2B), passando pela fase intermediária, onde se verificou que o embrião somático em desenvolvimento se encontrava preso ao calo original, embora os vasos estivessem fechando a conexão com o mesmo (Fig. 2C). Chegou-se finalmente, à última fase, em que o embrião se encontrava isolado e totalmente independente, apresentando os meristemas radicular e apical conectados por vasos completamente formados semelhantes a embriões zigóticos (Fig. 2D). Desta forma, uma vez que essas estruturas assemelham-se a embriões zigóticos pelas suas similaridades morfológicas e histológicas, e considerando que elas não estabelecem conexão vascular com o calo de origem, segundo Haccius (1978), elas podem ser chamadas de embriões somáticos.

Quanto aos efeitos causados pela presença do AG₃ nos meios de cultura para regeneração (Fase II), observou-se que em todos os calos subcultivados na presença deste regulador de crescimento ocorreu uma estimulação expressiva de enraizamento, ou seja, os nódulos presentes nos calos diferenciaram-se em raiz. Resultado semelhante foi observado por Kochba et al. (1974), os quais denominaram de falsos nódulos os que na presença de AG₃ desenvolveram raiz. De acordo com Ammirato (1983), as giberelinas são utilizadas freqüentemente para promover a maturação ou estimular o enraizamento. Por outro lado, segundo Sharp et al. (1980), as giberelinas não têm efeito na frequência de embriogênese, embora afetem o índice de desenvolvimento dos embriões.

Características das células e calos embriogênicos

Foi possível observar, mediante estudos histológicos, duas categorias de células, uma das quais muito semelhante às células meristemáticas, o que concorda com as observações de Sharp et al. (1980), quando afirmam que as células embriogênicas podem ser diferenciadas de outras dentro do calo, por sua semelhança morfológica com as células do meristema apical. Um outro tipo de célula observada apresentava formato não muito regular e com vacúolo grande, semelhante às descritas por El Maâtaoni et al. (1990) como células não-embriogênicas.

As células embriogênicas encontravam-se localizadas nos pontos de diferenciação, ou nódulos. Da mesma forma, McCain et al. (1988) afirmaram que embriões somáticos de milho surgiram de calos com superfície nodular, e constataram, por meio de análises histológicas, que estes nódulos eram constituídos de grupos de 2-8 células típicas que regeneravam embriões. Foi observado, por meio de estudos histológicos, que as células presentes nos calos com características embriogênicas também encontravam-se distribuídas em grupos de 3-8 células. Nomura & Komamine (1985) também relatam a presença de aglomerados embriogênicos distribuídos em grupos de 3-10 células, em culturas de cenoura.

CONCLUSÕES

1. A KIN não é a fonte de citocinina mais indicada para promover o desenvolvimento de calos embriogênicos em couve-comum.

2. A BAP demonstra ser a melhor fonte de citocinina para a promoção do desenvolvimento de estruturas semelhantes a embriões somáticos; o meio de cultura suplementado com 1,0 e 1,0 mg/L de BAP e 2,4-D respectivamente, é responsável pelo desenvolvimento de estruturas semelhantes a embriões em maior número e melhor definidas.

3. A interação entre o meio de cultura para indução de calos (1,0 mg/L de BAP e 1,0 mg/L de 2,4-D - fase I) e o meio para regeneração (0,01 de BAP e 0,001 mg/L de 2,4-D - fase II) é a mais eficiente para a promoção do desenvolvimento de estruturas semelhantes a embriões somáticos em couve-comum.

4. A presença do AG₃ nos meios de regeneração promove o desenvolvimento de raiz, sendo dispensada a sua utilização para regeneração de estruturas semelhantes a embriões somáticos em couve-comum.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  10 Out 2001
• Data do Fascículo
  Abr 2000

Histórico

• Aceito
  02 Jul 1999