Tolerância de rizóbios de diferentes procedências ao zinco, cobre e cádmio

Tolerance of rhizobia genera from different origins to zinc, copper and cadmium

Tolerância de rizóbios de diferentes procedências ao zinco, cobre e cádmio(¹)

Alexandre Matsuda(²), Fátima Maria de Souza Moreira(³) e José Oswaldo Siqueira(³)

Resumo ¾ Sessenta estirpes/isolados dos gêneros Bradyrhizobium, Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium e Azorhizobium, procedentes de diferentes locais (Mata Atlântica, Amazônia, culturas agrícolas e experimentos com metais pesados) e de espécies hospedeiras pertencentes às subfamílias Papilionoideae, Mimosoideae e Caesalpinoideae, foram avaliadas quanto à tolerância a Zn, Cu e Cd em meio YMA modificado pela adição de tampões biológicos (HEPES e MES) e suplementados com Cu (0 a 60 mg L^-1), Cd (0 a 60 mg L^-1) e Zn (0 a 1.000 mg L^-1). Mediante padrões de crescimento atribuídos às culturas nas diferentes concentrações dos metais, avaliaram-se as concentrações máximas toleradas e as doses tóxicas destes metais para redução de crescimento em 25% (DT₂₅) e 50% (DT₅₀). Não houve influência da procedência na concentração máxima de metal tolerada. A ordem de sensibilidade aos metais, considerando-se as concentrações máximas toleradas, foi Azorhizobium > Rhizobium = Mesorhizobium = Sinorhizobium > Bradyrhizobium. A DT₂₅ e a DT₅₀ foram úteis para diferenciarem estirpes/isolados de um mesmo gênero, que atingiram a mesma concentração máxima tolerada a Zn, Cu e Cd. A ordem de toxicidade dos metais estudados foi Cu > Cd > Zn.

Termos para indexação: simbiontes, toxicidade, metais pesados, crescimento.

Tolerance of rhizobia genera from different origins to zinc, copper and cadmium

Abstract ¾ Sixty strains/isolates of the genera Bradyrhizobium, Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium and Azorhizobium, isolated from different hosts (legume subfamilies: Papilionoideae, Mimosoideae and Caesalpinoideae) and location (Atlantic Forest, Amazon region, crop plantings and heavy metal experiments), were evaluated for Zn, Cu and Cd tolerance in YMA medium modified by the addition of biological buffers (HEPES and MES) and supplemented with Cu (0 to 60 mg L^-1), Cd (0 to 60 mg L^-1), and Zn (0 to 1,000 mg L^-1)sulphates. Growth standards were applied to evaluate rhizobia cultures growth at different metal concentrations, allowing evaluation of highest tolerated concentrations of Zn, Cu, and Cd and the toxic doses (concentrations) of these metals, which reduce the growth standard in 25% (DT₂₅) and 50% (DT₅₀). It was verified that there was no influence of the origin (host and location) on the highest tolerated concentration of each metal; the order of sensitivity to heavy metals, considering the highest tolerable concentrations, was Azorhizobium > Rhizobium = Mesorhizobium = Sinorhizobium > Bradyrhizobium. The DT₂₅ and the DT₅₀ were useful to differentiate strain/isolates of the same genus, which reached the same highest tolerated concentration to Zn, Cu, and Cu; and the order of toxicity was Cu > Cd > Zn.

Index terms: symbionts, toxicity, heavy metals, growth.

Introdução

A poluição ambiental por resíduos industriais contendo metais pesados tem gerado graves problemas ao ambiente, comprometendo ecossistemas (Doelman & Haanstra, 1984). As leguminosas capazes de formarem simbiose eficiente com rizóbio são espécies promissoras em programas de revegetação de solos degradados (Franco et al., 1992). A diversidade de rizóbios e de espécies de leguminosas no Brasil (Moreira et al., 1993) representam importantes fontes de recursos genéticos para programas de seleção de genótipos adaptados a diversas condições. O desenvolvimento de trabalhos de revegetação com leguminosas em solos contaminados requer, entre outros fatores, a obtenção de rizóbios tolerantes a níveis tóxicos de metais pesados.

Os efeitos dos metais pesados sobre os rizóbios têm sido investigados através da adição de sais de metais em concentrações crescentes aos meios nutritivos (Duxbury & Bicknell, 1983; Kinkle et al., 1987; Rózycki, 1992; Angle et al., 1993), sendo as avaliações feitas por meio de contagens em placa, ou pela estimativa da tolerância, através de valores atribuídos aos padrões de crescimento (Martensson, 1992). Uma limitação do uso de métodos in vitro é que as concentrações dos íons metálicos livres e, conseqüentemente, suas atividades reais não são conhecidas (Angle & Chaney, 1989). Além disso, alguns metais, como Cu, Pb e Ni, são, geralmente, menos tóxicos quando complexados com compostos orgânicos do que em forma livre (Babich & Stotzky, 1980, 1983), e, conseqüentemente, pode se superestimar as concentrações de metais toleradas. Além disso, estas podem não estar relacionadas às concentrações metálicas reais encontradas nos habitats dos quais o rizóbio foi isolado (Chaudri et al., 1993a, 1993b). Apesar disso, os dados de tolerância in vitro, por serem qualitativos, permitem comparar um grande número de microrganismos, e o teste em meio sólido, por ser um método mais rápido e acessível, tem sido empregado em estudos de tolerância de rizóbio a metais (Kinkle et al., 1987; Martensson, 1992; Angle et al., 1993; Trannin et al., 2001).

O objetivo deste trabalho foi avaliar in vitro a tolerância de 60 estirpes/isolados de rizóbio (Bradyrhizobium, Azorhizobium, Rhizobium, Mesorhizobium e Sinorhizobium), de diferentes procedências de hospedeiro e de local, a cobre, cádmio e zinco.

Material e Métodos

Sessenta estirpes/isolados de bactérias diazotróficas que formam simbiose com leguminosas, aqui coletivamente chamadas de rizóbios, num total de 20 simbiontes de cada subfamília (Papilionoideae, Mimosoideae e Caesalpinoideae), e provenientes de diferentes locais (Tabelas 1, 2 e 3), foram estudados quanto à tolerância a Zn, Cu e Cd em meio YMA (Yeast Mannitol Agar) (Vincent, 1970) modificado. Cada estirpe ou isolado cresceu em 30 mL de meio YM (Yeast Mannitol) (Vincent, 1970) com pH 6,8, sob agitação orbital a 105 rpm a 28^oC. Passados dois dias de crescimento de Meso/Sino/Rhizobium (1,3x10¹⁰ cel mL^-1), quatro dias de crescimento de Azorhizobium (10⁹ cel mL^-1) e seis dias de crescimento do Bradyrhizobium (1,2x10¹⁰ cel mL^-1 ), sendo estes os tempos necessários para que as culturas de cada gênero atingissem a fase log, uma alíquota de 1 mL de cultura de cada estirpe ou isolado foi transferida para tubos eppendorf de 1,5 mL esterilizados, e centrifugada a 8.000 rpm, a 25^oC, por quatro minutos. O sobrenadante foi descartado, e as células, ressuspensas em 1 mL de solução salina estéril (NaCl 5,5 g L^-1) e centrifugadas novamente, repetindo o processo de lavagem em solução salina, por três vezes. Posteriormente, alíquotas de 0,1 mL de suspensões de células lavadas de rizóbio foram inoculadas e espalhadas com alça de Drigalsky em placas contendo meio YMA modificado por adição de tampões biológicos HEPES (1,3 mg L^-1 de N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) e MES [1,1 mg L^-1 de 2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid] (Cole & Elkan, 1973), suplementado com diferentes concentrações de cada metal, testados individualmente. As concentrações de Zn (ZnSO₄.7H₂O) utilizadas foram: 0, 200, 400, 500, 600, 800 e 1.000 mg L^-1 para os cinco gêneros, estabelecidas com base em estudos já realizados neste laboratório (Trannin et al., 2001). Após a adição das soluções de ZnSO₄.7H₂O, o pH dos meios foi ajustado para 6,8 com solução de KOH 0,5 N esterilizada. O Cd e o Cu foram adicionados em concentrações superiores às utilizadas por Trannin et al. (2001), já que a estirpe BR-4406 e os isolados de solo contaminado (UFLA-01-456, UFLA-01-457 e UFLA-01-469), pertencentes ao gênero Bradyrhizobium, cresceram na maior concentração testada pelos autores, o que indica que poderiam tolerar concentrações maiores; assim Cd e Cu foram adicionados nas formas de CdSO₄.8H₂O e CuSO₄.5H₂O, nas concentrações: 0, 5,0, 10, 20, 30, 40 e 60 mg L^-1, e 0, 2,5, 5,0, 10, 20, 40 e 60 mg L^-1, respectivamente, também para os cinco gêneros. Para auxiliar a visualização de alterações em pH do meio durante a avaliação, tratamentos controles, sem inoculação, foram mantidos para cada nível de contaminação com metal. Após inoculação, as placas foram incubadas a 28^oC durante 10 dias. Os tratamentos foram distribuídos em delineamento inteiramente casualizado (DIC), com três repetições.

O comportamento de rizóbio nas diferentes concentrações de metais foi avaliado atribuindo-se valores aos diferentes padrões de crescimento (PC) observados: 0 = sem crescimento; 1 = sem colônias visíveis, mas com alcalinização (Bradyrhizobium/Azorhizobium) ou acidificação/ausência de alteração da cor do meio (dependendo da estirpe ou isolado do Meso/Sino/Rhizobium) e crescimento positivo após repicagem para meio sem metal; 2 = pouco; 3 = médio; 4 = abundante, com distribuição heterogênea na placa; 5 = máximo, com distribuição uniforme por toda a placa, não diferindo do crescimento em meio sem contaminação. A concentração máxima tolerada (CMT) correspondeu à maior concentração de metal que apresentou PC³1.

Através dos valores atribuídos aos diferentes PC para avaliação do comportamento do rizóbio nas diferentes concentrações de Zn, Cu e Cd, foram obtidas equações de regressão (programa Table Curve 2D for Windows v. 2.03 ¾ Jandel Corporation), e a partir destas, foram calculadas as doses tóxicas dos metais que reduzem o PC em 25% (DT₂₅) e 50% (DT₅₀).

Resultados e Discussão

Considerando a CMT de Zn, a estirpe BR-4406 e os isolados de solo contaminado UFLA-01-457 e UFLA-01-473, pertencentes ao gênero Bradyrhizobium e oriundos de Mimosoideae, foram os mais tolerantes (Tabela 4). Dos outros representantes desse gênero nas três subfamílias (SF), nove tiveram PC 2, e o restante, PC 1, na mesma CMT. Todos os representantes da SF Caesalpinoideae tiveram PC 1 na CMT de Zn, e os da subfamília Mimosoideae, que tiveram PC 2 nessa concentração, são de hospedeiros nativos da Amazônia. A CMT de 800 mg L^-1 também foi verificada por Trannin et al. (2001) em relação às estirpes e isolados de Bradyrhizobium mais tolerantes a zinco. Angle et al. (1993) constataram que a espécie de Bradyrhizobium (Bradyrhizobium japonicum) mais tolerante a Zn apresentou CMT de 500 mg L^-1, sendo esta a maior concentração testada por esses autores. A CMT a Zn por todos representantes de Rhizobium, Mesorhizobium e Sinorhizobium foi menor que a CMT por Bradyrhizobium (Tabela 4). Na CMT, todas estirpes/isolados de Rhizobium e Sinorhizobium oriundos de Caesalpinoideae tiveram o maior PC (2), enquanto os representantes oriundos de Papilionoideae e Mimosoideae tiveram PC 1; Mesorhizobium obteve PC 2 na CMT a zinco. Como Mesorhizobium teve apenas uma representante, a estirpe BR-3804 (Caesalpinoideae) não pode ser comparada com outras de mesmo gênero que tivessem sido isoladas de espécies de outras subfamílias. Já os isolados de Rhizobium testados por Angle et al. (1993) também mostraram ser menos tolerantes a Zn que Bradyrhizobium, apresentando CMT de 100 mg L^-1. A maior tolerância de estirpes oriundas da subfamília Caesalpinoideae a estresses também foi verificada por Silva & Franco (1984), que constataram que das 211 estirpes de Rhizobium sp. testadas em meio de cultura sob condições de acidez, 85,7%, 48,8% e 28,0% isoladas, respectivamente, das subfamílias Caesalpinoideae, Mimosoideae e Papilionoideae, cresceram em meio de cultura com pH 4,6 com e sem 50 mM Al³⁺, e que uma estirpe cresceu na ausência, mas não na presença de Al⁺³. Para os dois isolados de Azorhizobium (UFLA-01-486 e UFLA-01-510), a concentração máxima tolerada (CMT) a Zn foi menor que para os outros gêneros, diferindo, entretanto, nos PCs, na concentração de 200 mg L^-1 (Tabela 4). Como Azorhizobium é restrito a hospedeiros do gênero Sesbania, não foi possível a comparação entre subfamílias. A CMT de 400 mg L^-1 também foi encontrada pelas estirpes e isolados de Azorhizobium mais tolerantes a Zn estudados por Trannin et al. (2001).

A estirpe BR-4406 e os isolados de solo contaminado UFLA-01-457 e UFLA-01-473, os três pertencentes a Bradyrhizobium e oriundos de Mimosoideae, também foram os mais tolerantes a Cu, considerando a CMT, porém os dois isolados tiveram PC 2 nesta concentração, e a BR-4406 PC 1 (Tabela 5). Com relação aos outros representantes de Bradyrhizobium houve variação com relação a CMT. Já no estudo de Trannin et al. (2001), a CMT obtida para Cu pela estirpe e isolados de Bradyrhizobium mais tolerantes foi 40 mg L^-1, e portanto menor que a dos mais tolerantes obtidos neste estudo, porém esta foi a maior concentração testada pelos autores. Angle et al. (1993) obtiveram, em relação ao Cu, a CMT de apenas 5,0 mg L^-1 pelo Bradyrhizobium mais tolerante. Por outro lado, as estirpes/isolados de Rhizobium, Mesorhizobium e Sinorhizobium toleraram o Cu duas vezes mais que os isolados de Azorhizobium (Tabela 5). Todas as estirpes/isolados de Rhizobium e Sinorhizobium oriundos das subfamílias Caesalpinoideae e Papilionoideae tiveram PC 2 na CMT, e os de Mimosoideae, PC 1; Mesorhizobium também obteve PC 2 na CMT a cobre. No trabalho de Angle et al. (1993) a CMT pelo isolado de Rhizobium mais tolerante a Cu foi bastante inferior (2,0 mg L^-1) à encontrada neste estudo. Os isolados de Azorhizobium foram os mais sensíveis ao Cu (Tabela 5), resultado também encontrado por Trannin et al. (2001) com relação às estirpes e isolados de Azorhizobium testados.

A estirpe e isolados de solo contaminado de Bradyrhizobium mais tolerantes a Zn e Cu também foram mais tolerantes a Cd (Tabela 6). No estudo de Trannin et al. (2001), a CMT a Cd pela estirpe e isolados de Bradyrhizobium mais tolerantes foi 40 mg L^-1; porém, como ocorreu com o Cu, esta foi a maior concentração testada pelos autores. Quanto ao Cd, Angle et al. (1993) obtiveram a CMTs de apenas 7,5 mg L^-1 pelo Bradyrhizobium mais tolerante. Borges & Wollum (1980, 1981), ao examinarem a tolerância a Cd de estirpes de Bradyrhizobium japonicum simbiontes de soja, verificaram que as CMTs variaram de 10 a 90 mg L^-1. Isto sugere que concentrações mais elevadas de Cd e Cu poderiam ser testadas para a estirpe e isolados mais tolerantes de Bradyrhizobium (BR-4406, UFLA-01-457 e UFLA-01-473) verificados neste estudo, que toleraram até 60 mg L^-1 de Cd e Cu, concentrações máximas estudadas. Todas as estirpes/isolados de Rhizobium, Mesorhizobium e Sinorhizobium atingiram menores CMT do que Bradyrhizobium, em relação a este metal, sendo que os do gênero Rhizobium oriundos de Papilionoideae tiveram o maior PC (2) na CMT (Tabela 6). No trabalho de Angle et al. (1993), como aconteceu com Zn e Cu, a CMT atingida pelos isolados de Rhizobium mais tolerantes a Cd foi bastante inferior (2,5 mg L^-1)à obtida no presente estudo. Os dois isolados de Azorhizobium também foram os mais sensíveis a Cd(Tabela 6). Das dez estirpes/isolados de Azorhizobium utilizadas por Trannin et al. (2001), nove apresentaram a mesma CMT a Cd neste estudo, e uma atingiu CMT de 30 mg L^-1.

Apesar de a CMT de cada metal ter sido a mesma para todas as estirpes e isolados dos gêneros Rhizobium e Sinorhizobium, os representantes da subfamília Mimosoideae mostraram ser mais sensíveis, obtendo PC 1 para Zn e Cu nesta concentração. Em relação ao Cd, as mais sensíveis foram Mimosoideae e Caesalpinoideae. A ausência de diferenças entre estirpes/isolados dentro dos gêneros Rhizobium e Sinorhizobium quanto à CMT aos metais pode ser atribuída ao fato de não terem sido testados isolados de solos contaminados, diminuindo, conseqüentemente, a possibilidade de serem encontradas diferenças quanto à tolerância a metais. No entanto, no caso de Bradyrhizobium, estirpes não procedentes de solos contaminados (e.g. BR-4406) também podem apresentar alta tolerância, e no caso de Azorhizobium, isolados de solos contaminados podem ser sensíveis (e.g. UFLA-01-486 e UFLA-01-510).

Quanto a Bradyrhizobium, que tinha maior diversidade de origens, não houve influência das SFs na tolerância aos metais. Bradyrhizobium apresentou maior variação de PC que Rhizobium, Sinorhizobium e Azorhizobium, quando exposto aos metais; como o gênero Mesorhizobium teve apenas um representante, não foi possível avaliar a variação em seu PC.

A ordem de toxicidade dos metais a todas as estirpes e isolados estudados foi Cu>Cd>Zn, o que concorda com os resultados de Chaudri et al. (1992), Angle et al. (1993) e Trannin et al. (2001).

Algumas estirpes/isolados de um mesmo gênero, que atingiram a mesma concentração máxima tolerada a Zn, Cu e Cd, apresentaram comportamento diferenciado, ou seja, DT₂₅ e DT₅₀ diferentes (Tabelas 4, 5 e 6). Os dois isolados de Azorhizobium (UFLA-01-486 e UFLA-01-510), por exemplo, que atingiram a mesma CMT a Zn (Tabela 4), apresentaram DT₂₅ e DT₅₀ diferentes. O isolado UFLA-01-510 mostrou-se mais sensível a Zn, já que a concentração necessária para redução do padrão de crescimento em 25% foi menor (Tabela 4).

As estirpes/isolados mais sensíveis (menores DT₂₅)e mais tolerantes (maiores DT₅₀)a Zn, Cu e Cd pertencem, predominantemente, a Bradyrhizobium; este gênero foi o que apresentou as maiores CMT a estes metais (Tabelas 4, 5 e 6). Nos estudos de Angle et al. (1993) e Trannin et al. (2001), Bradyrhizobium também foi mais tolerante a metais pesados que Rhizobium e Azorhizobium, respectivamente. Azorhizobium foi o gênero que apresentou as menores CMT aos três metais e também obteve as menores DT₅₀. Não houve influência da origem (subfamílias e locais) na DT₂₅ e DT₅₀ a metais.

As diferenças na tolerância a metais entre Bradyrhizobium (crescimento lento) e Rhizobium (crescimento rápido), que já são conhecidas (Borges & Wollum, 1980, 1981; Kinkle et al., 1987; Angle et al., 1993), estão associadas à densa cápsula polissacarídica ao redor das células, especialmente de Bradyrhizobium, que retém os metais, impedindo que sejam absorvidos (Beveridge & Doyle, 1989, citados por Angle et al., 1993). Além disso, Bradyrhizobium causa reação alcalina no meio, o que pode reduzir a solubilidade e atividade dos metais (Alexander, 1977). Ao contrário, Rhizobium geralmente diminui o pH em seu meio, aumentando a disponibilidade e toxicidade dos metais. Por outro lado, Azorhizobium, que apresenta crescimento intermediário, apesar de produzir menos polissacarídeos extracelulares que Bradyrhizobium e Rhizobium, promove maior alcalinização do meio que esses dois gêneros (Dreyfus et al., 1988). No entanto, o estudo envolvendo os cinco gêneros (Bradyrhizobium, Rhizobium, Mesorhizobium, Sinorhizobium e Azorhizobium) quanto à toxicidade dos metais in vitro está sendo realizado pela primeira vez, e, pelos resultados obtidos, verificou-se que na concentração máxima tolerada aos metais, prevaleceu a maior produção de polissacarídeos extracelulares (EPS) pelo Rhizobium, Mesorhizobium e Sinorhizobium, em detrimento da alcalinização do meio por Azorhizobium. Já a maior tolerância de Bradyrhizobium que Rhizobium, Mesorhizobium e Sinorhizobium, pode ser atribuída à produção de EPS associada à sua capacidade de alcalinizar o meio.

Conclusões

1. A estirpe BR-4406 e os isolados de solo contaminado UFLA-01-457 e UFLA-01-473, pertencentes a Bradyrhizobium, e os isolados de hospedeiros de Enterolobium são os mais tolerantes a Zn, Cu e Cd.

2. Não há influência da subfamília e dos locais de origem na concentração máxima de metais tolerada (CMT) pelas estirpes estudadas; porém há influência nos padrões de crescimento nas CMTs.

3. A ordem de toxicidade dos metais para o rizóbio é Cu>Cd>Zn, e as concentrações máximas toleradas são de 60 mg L^-1, 60 mg L^-1 e 800 mg L^-1, respectivamente.

4. A ordem de tolerância aos metais pesados, considerando-se as concentrações máximas toleradas, é Bradyrhizobium > Rhizobium = Mesorhizobium = Sinorhizobium > Azorhizobium.

5. As doses tóxicas dos metais pesados para redução de crescimento em 25% (DT₂₅) e 50% (DT₅₀) são úteis para diferenciarem algumas estirpes/isolados de um mesmo gênero, que atingiram a mesma concentração máxima tolerada a Zn, Cu e Cd.

Referências

• ALEXANDER, M. Introduction to soil microbiology New York: J. Wiley, 1977. 467 p.
• ANGLE, J. S.; CHANEY, R. L. Cadmium resistance screening in nitrilotriacetate-buffered minimal media. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 55, n. 8, p. 2101-2104, Sept. 1989.
• ANGLE, J. S.; McGRATH, S. P.; CHAUDRI, A. M.; CHANEY, R. L.; GILLER, K. E. Inoculation effects on legumes grown in soil previously treated with sewage sludge. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 25, n. 5, p. 575-580, May 1993.
• BABICH, H.; STOTZKY, G. Environmental factors that influence the toxicity of heavy metal and gaseous pollutants to microorganisms. CRC Critical Reviews in Microbiology, Boca Raton, v. 8, p. 99-145, 1980.
• BABICH, H.; STOTZKY, G. Nickel toxicity to estuarine marine fungi and amelioration by magnesium in sea water. Water Air and Soil Pollution, Dordrecht, v. 19, n. 2, p. 193-202, 1983.
• BORGES, A.; WOLLUM, A. A field study of a soil-soybean plant-Rhizobium system amended with cadmium. Journal of Environmental Quality, Madison, v. 9, n. 3, p. 420-423, 1980.
• BORGES, A.; WOLLUM, A. Effect of cadmium on symbiotic soybean plants. Journal of Environmental Quality, Madison, v. 10, n. 2, p. 216-221, 1981.
• CHAUDRI, A. M.; McGRATH, S. P.; GILLER, K. E. Metal tolerance of isolates of Rhizobium leguminosarum biovar trifolii from soil contaminated by past application of sewage sludge. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 24, n. 2, p. 83-88, Feb. 1992.
• CHAUDRI, A. M.; McGRATH, S. P.; GILLER, K. E.; ANGLE, J. S.; CHANEY, R. L. Screening of isolates and strains of Rhizobium leguminosarum biovar trifolii for heavy metal resistance using buffered media. Environmental Toxicology and Chemistry, Oxford, v. 12, n. 9, p. 1643-1651, 1993a.
• CHAUDRI, A. M.; McGRATH, S. P.; GILLER, K. E.; RIETZ, E.; SAUERBECK, D. R. Enumeration of indigenous Rhizobium leguminosarum biovar trifolii in soil previously treated with metal contaminated sewage sludge. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 25, n. 3, p. 301-309, Mar. 1993b.
• COLE, M. A.; ELKAN, G. H. Transmissible resistance to penicillin G, neomycin, and chloramphenicol in Rhizobium japonicum Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Washington, v. 4, n. 2, p. 248-253, Sept. 1973.
• DOELMAN, P.; HAANSTRA, L. Short-term and long-term effects of cadmium, chromium, copper, nickel, lead and zinc on soil microbial respiration in relation to abiotic soil factors. Plant and Soil, Dordrecht, v. 79, n. 3, p. 317-327, 1984.
• DREYFUS, B.; GARCIA, J. L.; GILLIS, M. Characterization of Azorhizobium caulinodans gen. nov., sp. nov., a stem-nodulating nitrogen fixing bacterium isolated from Sesbania rostrata International Journal of Systematic Bacteriology, Washington, v. 38, n. 1, p. 89-98, Jan. 1988.
• DUXBURY, T.; BICKNELL, B. Metal tolerant bacterial population from natural and metal-polluted soils. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 15, n. 3, p. 243-250, May/June 1983.
• FRANCO, A. A.; CAMPELLO, E. F. C.; SILVA, E. M. R.; FARIA, S. M. de. Revegetação de solos degradados Seropédica: Embrapa-CNPAB, 1992. 11 p. (Comunicado Técnico, 9).
• KINKLE, B. K.; ANGLE, J. S.; KEYSER, H. H. Long term effects of metal-rich sewage sludge application on soil population of Bradyrhizobium japonicum. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 53, n. 2, p. 315-319, Feb. 1987.
• MARTENSSON, A. M. Effects of agrochemicals and heavy metals on fast-growing rhizobia and their symbiosis with small-seeded legumes. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 24, n. 5, p. 435-445, May 1992.
• MOREIRA, F. M. S. Caracterização de estirpes de rizóbio isolados de espécies florestais pertencentes a diversos grupos de divergência de Leguminosae introduzidas ou nativas da Amazônia e Mata Atlântica Rio de Janeiro: UFRJ, 1991. 160 p. Tese de Doutorado.
• MOREIRA, F. M. S.; GILLIS, M.; POT, B.; KERSTERS, K.; FRANCO, A. A. Characterization of rhizobia isolated from different divergence groups of tropical Leguminosae by comparative polycrylamide gel electrophoresis or their total proteins. Systematic and Applied Microbiology, Stuttgart, v. 16, n. 1, p. 135-146, 1993.
• RÓZYCKI, H. A. Rapid agar-diffusion test for quantifying the toxic effects of copper on microorganisms. Acta Microbiologica Polonica, Gagarina, v. 41, n. 1/2, p. 469-477, 1992.
• SILVA, G. G. da; FRANCO, A. A. Seleção de estirpes de Rhizobium spp. de leguminosas florestais em meio de cultura tolerantes à acidez e à toxidez do Al. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 19, s/n, p. 169-173, jun. 1984.
• TRANNIN, I. C. B.; MOREIRA, F. M. S.; SIQUEIRA J. O.; LIMA, A. S. Tolerância de estirpes e isolados de Bradyrhizobium e Azorhizobium a zinco, cádmio e cobre in vitro Revista Brasileira de Ciência do Solo, Viçosa, v. 25, n. 25, p. 305-316, 2001.
• VINCENT, J. M. A. Manual for the practical study of root-nodule bacteria London: International Biological Programme, 1970. 164 p. (Handbook, 15).

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  11 Jun 2002
• Data do Fascículo
  Mar 2002

Histórico

• Aceito
  02 Jun 2001