Triterpenóides pentacíclicos de Mentha villosa: identificação estrutural e atribuição dos deslocamentos químicos dos átomos de hidrogênio e carbono

Pentacyclic triterpenoids of Mentha villosa: structural identification and ¹H and 13C resonance assignments

Resumo

The structures of seven oleanene and ursene triterpenoids (1-7) isolated from aerial parts of Mentha villosa were identified. In addition, the complete ¹H and 13C resonance assignments of these triterpenoids were accomplished using 1D and 2D NMR spectroscopic experiments.

Mentha villosa; Labiatae; pentacyclic triterpenoids; 1D and 2D NMR

Mentha villosa; Labiatae; pentacyclic triterpenoids; 1D and 2D NMR

Artigo

TRITERPENÓIDES PENTACÍCLICOS DE MENTHA VILLOSA: IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL E ATRIBUIÇÃO DOS DESLOCAMENTOS QUÍMICOS DOS ÁTOMOS DE HIDROGÊNIO E CARBONO

Francisco J. Queiroz Monte, Eliete F. de Oliveira

Departamento de Química Orgânica e Inorgânica, Universidade Federal do Ceará, CP 12200, 60021-970 Fortaleza – CE

Raimundo Braz Filho

Setor de Química de Produtos Naturais, LCQUI-CCT, Universidade Estadual do Norte Fluminense, 28015-620 Campos - RJ

Recebido em 5/6/00; aceito em 10/10/00

PENTACYCLIC TRITERPENOIDS OF MENTHA VILLOSA: STRUCTURAL IDENTIFICATION AND ¹H AND ¹³C RESONANCE ASSIGNMENTS. The structures of seven oleanene and ursene triterpenoids (1-7) isolated from aerial parts of Mentha villosa were identified. In addition, the complete ¹H and ¹³C resonance assignments of these triterpenoids were accomplished using 1D and 2D NMR spectroscopic experiments.

Keywords:Mentha villosa; Labiatae; pentacyclic triterpenoids; 1D and 2D NMR.

INTRODUÇÃO

Várias espécies de Mentha têm sido investigadas, tanto por suas atividades biológicas^1-6 como também pelos óleos essênciais^5,7-10 produzidos por suas fôlhas. O gênero Mentha L., família Labiatae, da subfamília Nepetoidae e da tribo Mentheae, consiste aproximadamente de vinte e cinco espécies. A espécie Mentha villosa¹¹ é uma erva cultivada em todo o Brasil e é usada como remédio popular no tratamento de amebíase, giardíase³ e shistosomíase².

Este trabalho descreve o isolamento, purificação e identificação estrutural de sete triterpenóides (1-7) das séries oleanano e ursano, isolados do extrato etanólico das partes aéreas de M. villosa. A identificação foi estabelecida com base na interpretação de dados espectrais, principalmente RMN ¹H (500 MHz) e ¹³C (125 MHz). Experiências 1D e 2D de RMN¹H, RMN¹³C e NOESY foram também usados para a completa e inequívoca atribuição dos deslocamento químicos dos átomos de hidrogênio e carbono. Estes metabólitos estão sendo descritos pela primeira vez na espécie M. villosa.

Várias atividades biológicas para este tipo de compostos foram relatadas¹² nas duas últimas décadas, inclusive algumas delas determinando a relação entre estrutura química e atividade anti-câncer^13-19. Os dados espectrais corretos podem ser utilizados em posteriores investigações de novos membros desta importante classe de produtos naturais, assim como na compreensão das correlações entre conformação molecular e atividade biológica^20,21.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O resíduo obtido após concentração da parte solúvel em CHCl₃ do extrato etanólico das partes aéreas de M. villosa forneceu após sucessivos fracionamentos cromatográficos em colunas de sílica gel, quatro frações denominadas A, B, D e E. Estas foram identificadas como misturas de ácidos carboxílicos triterpênicos através de espectroscopia de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN¹H) e carbono-13 (RMN¹³C), infravermelho (IV) e espectrometria de massa (EM). As frações A, B e D foram metiladas e acetiladas e os respectivos ésteres metílicos acetilados (A-MeAc, B-MeAc e D-MeAc) submetidos a cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP) seguida de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), permitindo a separação dos triterpenos 1 – 7. Todos os derivados apresentaram-se como sólidos amorfos incolores e tiveram as fórmulas moleculares determinadas por espectrometria de massa em combinação com os espectros de RMN ¹H (500 MHz) e ¹³C (125 MHz).

Os sinais correspondentes aos átomos de carbono quaternário, metínico, metilênico e metílico (Tabelas 1-6) de todos os triterpenóides isolados (1-7) foram identificados por análise comparativa dos espectros de RMN¹³C-HBBD (Hydrogen Broad Band Decoupled) e RMN¹³C–DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer). A atribuição dos sinais dos átomos de carbono nos espectros de RMN ¹³C foi efetuada com base nos espectros bidimensionais [2D: ¹Hx¹³C–HMBC - ⁿJ_CH (n=2 e 3), ¹Hx¹³C–HMQC–¹J _CH, ¹Hx¹H–COSY e ¹Hx¹H–NOESY]. A atribuição dos sinais dos átomos de hidrogênio nos espectros de RMN ¹H por sua vez, foi conseguida pela utilização dos espectros de ¹Hx¹H–COSY e ¹Hx¹³C – HMQC (Tabelas 1-6).

Nos espectros de RMN ¹H de 1 e 3 obsevou-se os sinais do H-18 como dubleto de dubleto [J = 12,0 e 3,6 Hz (1) e J = 12,0 e 3,4 Hz (3)] em d_H 2,85 e 2,86, enquanto em 2 e 4 apareceram como dubletos [J = 12,0 Hz (2) e J = 10,4 Hz (4)] centrados em d_H 2,22 e 2.24, respectivamente. Estes dados associados aos demais, caracterizaram os triterpenoides 1 e 3 como oleananos e 2 e 4 como ursanos (J = 12,0 e 10,4 Hz são correspondentes a interação axial-axial, H-18b axial).

Os triterpenos 1 e 2 revelaram espectros de massa semelhantes, compatíveis com mesma composição elementar (m/z 512 [M] ⁺, C₃₅H₅₂O₄) e exibindo picos intensos em m/z 262 e 203 comumente observados em olean-12-en-28-ato de metila e ursa-12-en-28-ato de metila sem substituintes nos anéis C, D e E, atribuídos a fragmentos formados através de reação do tipo retro Diels-Alder envolvendo o anel C^22,23.

Um exemplo da estratégia aplicada de modo geral para os triterpenos 1-7 e que permitiu identificar facilmente os átomos de carbono não hidrogenados (exceção do C-17) além de vários carbonos hidrogenados, é ilustrado através do composto 1, onde estão indicadas as correlações a longa distancia (²J_CH e ³J_CH) entre os deslocamentos químicos dos hidrogênios metílicos (d_H) e os carbonos (d_C) marcados a e b em relação a estes hidrogênios (Figura 1). Utilizando-se o mesmo procedimento, os espectros de RMN ¹³C-HBBD, ¹³C-DEPT, HMBC, HMQC, COSY e NOESY forneceram os deslocamentos químicos de 2 - 7 (Tabelas 2 – 6).

Os compostos 3 e 4 revelaram espectros de massa com pico correspondente ao ion molecular em m/z 570 ([M]⁺), em acordo com a mesma fórmula molecular C₃₅H₅₄O₆ para as duas substâncias e compatível com a presença de um grupo acetoxílico adicional quando comparados com 1 e 2. Os sinais em d_H 2,11 e 1,95 (3) e d_H 2,04 e 2,07 (4) observados nos espectros de RMN ¹H foram usados para confirmar esta dedução. No espectro de RMN ¹³C de 3, o deslocamento químico do CH-5 (d_C 49,5) revelou-se consistente com a configuração 3a-OAc (efeito g sobre o CH-5) e, consequentemente, H-3b. Assim, o dubleto (J = 4,8 Hz) em d_H 4,96 corresponde a H-3 em posição equatorial. A localização do segundo grupo acetoxílico em posição a do C-2 foi deduzida com base no espectro 2D NOESY. Picos transversais de correlação do sinal em d_H 5,23 (td, J = 10,5 e 4,8 Hz) atribuído a H-2b mostrou sua proximidade espacial para com H-3b (d_H 4,96), 3H-24 (d_H 0,98) e 3H-25 (d_H 1,02). O valor de J = 10,5 Hz observado no sinal de H-2b (d_H 5,23) confirmou interação axial-axial deste hidrogênio com o H-1 do grupo metilênico CH₂-1 ocupando também posição axial. Por outro lado, o sinal atribuído a H-3b ((d_H 4,96) exibiu um efeito Overhauser com 3H-23 (d_H 0,87) e 3H-24 ((d_H 0,98), em acordo com a posição equatorial. Estas observações, confirmaram a presença do sistema 2a,3a-di-O-acetil em 3.

No espectro de RMN ¹H de 4, a presença de dois dubletos (J = 10,4 Hz) em d_H 4,38 e 4,12, representando um sistema AB correspondentes a dois hidrogênios geminados mutualmente acoplados, indicou a existência de um grupo acetoximetílico ligado a um carbono quaternário. Este grupo CH₂OAc foi localizado no C-4 em posição axial com base na ausência de efeito g no C-5 (d_C 56,01). Em adição, o hidrogênio H-3 com sinal no espectro de RMN¹H em d_H 4,58 (dd, J = 10,4 e 5,2 Hz), geminado com um grupo acetoxílico (AcO-3), foi situado em posição axial (orientação a) com base no valor de J=10,4 Hz (interação axial-axial) e nas correlações espaciais entre os hidrogênios H-3a (d_H 4,58), H-2a (d_H 1,66), H-5a (d_H 0,97) e 3H-23 (d_H 1,01) observadas no espectro NOESY.

Assim, com base nestes resultados e nos dados das Tabelas 1 – 4, os derivados triterpênicos 1, 2, 3 e 4 foram identificados como 3b-O-acetilolean-12-en-28-ato de metila, 3b-O-acetilursa-12-en-28-ato de metila, 2a,3a-di-O-acetilolean-12-en-28-ato de metila e 3b,24-di-O-acetilursa-12-en-28-ato de metila, respectivamente. Consequentemente, pode-se caracterizar os triterpenos naturais como ácidos 3b-hidroxiolean-12-en-28-óico, 3b-hidroxiursa-12-en-28-óico, 2a,3a-diidroxiolean-12-en-28-óico e 3b,24-diidroxiursa-12-en-28-óico, já que não se obesrvou a presença de sinais correspondentes a grupos acetoxílico e metoxílico nos espectros de RMN¹H das amostras antes de serem submetidas às reações de acetilação e metilação.

A fórmula molecular C₃₅H₅₂O₆ de 5, deduzida através do pico em m/z 568 ([M]⁺)observado no espectro de mssa e dados de RMN¹H e ¹³C, revelou uma diferença de dois átomos de hidrogênio quando comparada com a de 3 (C₃₅H₅₄O₆). Os espectros de RMN¹H e ¹³C (Tabela 5) permitiram reconhecer a presença do sistema 2a,3b-di-O-acetil, uma ligação dupla adicional tetrasubstituida (d_C 132,78 e 136,09), além dos sinais dos carbonos C-13 (d_C 138,72) e CH-12 (d_C 125,24 e d_H 5,36). O tipo ursano foi estabelecido pelo sinal de grupo metílico ligado a carbono sp² (d_H 1,70, 3H-29), localizando assim, a ligação dupla adicional entre os átomos de carbono 18 e 19, caracterizando-se um sistema diênico conjugado (D^12,18) na molécula de 5. Em uma publicação²⁴, relatando a presença do ácido 2a,3b-dihidroxiursa-12,18-dien-28-óico, o deslocamento químico do C-19 não foi descrito e o do C-21 (d_C 31,90) revelou-se inconsistente com o observado para o composto 5 (d_C 26,55). O espectro de correlação heteronuclear de hidrogêneio e carbono a longa distância ¹Hx¹³C–COSY-ⁿJ _CH (n=2 e 3, HMBC) de 5 permitiu atribuição inequívoca do deslocamento químico do C-19 (d_C 136,09) através dos picos transversais correspondentes aos sinais em d_H 1,70 (3H-29, ²J_CH) e d_H 1,05 (3H-30, ³J_CH) assim como, do sinal em d_H 1,70 (3H-29, ³J_CH) com o sinal em d_C 132,78 (C-18). Estes dados permitiram , obviamente, localizar o sistema diênico e confirmar a caraterização do triterpeno 5 como do tipo ursano. Por outro lado, a interação heteronuclear spin-spin revelada pela correlação entre os sinais em d_H 1,05 (3H-30, ³J_CH) e d_C 26,55 (CH₂-21) identificou o sinal deste átomo de carbono metilênico. Assim, o derivado 5 foi identificado como 2a,3b-di-O-acetilursa-12,18-dien-28-ato de metila e, em consequência, o produto natural como 2a,3b-diidroxiursa-12,18-dien-28-óico.

O derivado triterpênico 6, com peso molecular com 16 Daltons a mais quando comparado com 2 e fórmula molecular C₃₃H₅₂O₅ (m/z 528, [M]⁺), mostrou o espectro de RMN ¹H semelhante ao de 2. Nos espectros de RMN ¹³C (HBBD e DEPT) observou-se a ausência do sinal correspondente ao CH-19 (d_C 39,10) de 2 e a presença de um sinal representando um carbono quaternário oxigenado em d_C 73,20 (C-19 de 6). Deste modo, o átomo de oxigênio adicional indicado pelo peso molecular foi localizado no C-19 como um grupo hidroxila terciário (Tabela 6). Por tratamento com Ac₂O na presença de piridina somente o grupo hidroxila do C-3 foi esterificado, formando um derivado monoacetilado, conforme espectro de RMN ¹H (d_H 2,05). Consequentemente, a estrutura do derivado acetilado 6 foi estabelecida como a do 3b-O-acetil-19a-hidroxiursa-12-en-28-ato de metila e a substância natural como ácido 3b,19a-diidroxiursa-12-en-28-óico.

Finalmente, o EM do composto 7 mostrou o pico correspondente ao íon molecular em m/z 568, sugerindo a mesma fórmula molecular C₃₅H₅₂O₆, de 5. Os espectros de RMN ¹H e ¹³C revelaram-se muito semelhantes aos de 5, destacando-se nos espectros de RMN ¹³C como diferença mais significativa, os sinais atribuidos ao CH-5 (d_C 55,10) em 5 e d_C 49,88 em 7. Esta observação indicou a configuração 3a-Oac como em 3 (Tabela 6). Com base nestes dados e por comparação com 3 e 5, a estrutura de 7 foi estabelecida como sendo o 2a,3a-di-O-acetilursa-12,18-dien-28-ato de metila e o produto natural como 2a,3a-diidroxiursa-12-18-dien-28-óico.

Os dados de RMN ¹³C dos produtos analisados estão em acordo com valores descritos na literatura²⁴ para triterpenos semelhantes.

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais

Os espectros de RMN ¹H e de ¹³C foram registrados em um espectrômetro Bruker ARX 500, operando a 500 MHz para hidrogênio e 125 MHz para carbono-13, usando CDCl₃ como solvente. As soluções foram preparadas a partir de 1,5 – 8 mg dos triterpenos em 0,35 ml de CDCl₃ em tubos de 2,5 mm, com TMS como referência interna. Os espectros 2D foram obtidos e processados com um programa Bruker em um computador Aspect X32 com os seguintes parâmetros: temperatura = 279,0^oK; ns = 16 e 32; TD = 2048; ¹Hx¹³C-HMBC-ⁿJ (C,H) op = 7,0 Hz. A função quadrática de seno e sua troca de funções (p/4, p/6 e p/8) de apodização foram usadas para o processamento com valores de LB = 0,00 Hz e GB = 0. As condições de obtenção e processamento nas experiências COSY e NOESY foram: intervalo de espera, 1-2 s; 512-1024 experimentos; 1024-2048 t₂ pontos e, largura de varredura de 6 ppm. O tempo de mistura no espectro NOESY foi de 1,2-1,5 s. Para correlações de ¹H x ¹³C (canal do ¹³C) ) e ¹³C x ¹H (canal do ¹H), o mesmo intervalo de espera foi usado, 512-1024 t₂ experimentos, 1024-2048 pontos sendo a largura de varredura de 7 ppm para ¹H e 180 ppm para ¹³C. Os espectros de massa foram obtidos em um espectrômetro Finningan TSQ 70, operando a 70 eV; Os espectros no infravermelho foram registrados em um espectrômetro Perkin-Elmer, modelo 1000, em pastilhas de KBr; As separações por CLAE em instrumento Waters 6000A, equipado com detector refratométrico.

Material vegetal

Mentha villosa foi coletada no Horto de Plantas Medicinais da Universidade Federal do Ceará, Brasil e identificada pelo Dr. Roy Harley da Universidade de Oxford, Inglaterra. Uma exsicata (n^o 16545) foi depositado no Herbário Prisco Bezerra do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará.

Extração e isolamento dos constituintes

A planta, seca em estufa (60 ^oC) foi triturada e submetida a extração exaustiva com hexano e etanol, sucessivamente, na temperatura ambiente. Após filtração para remover os sais inorgânicos (5,25 g) o extrato etanólico (50 g) foi fracionado entre hexano, CHCl₃, Et₂O, EtOAc, n-BuOH e H₂O. A fase solúvel em CHCl₃ foi evaporada sob pressão reduzida e o correspopndente extrato (9,6 g) foi cromatografado em coluna de sílica gel 60 [0,050-0,20 mm; Carlo Erba (70 g)] eluída com misturas de hexano-CHCl₃ contendo quantidades crescentes de CHCl₃, na seguinte ordem: hexano-CHCl₃, 9:1 (300 ml), hexano-CHCl₃, 8:2 (450 ml), hexano-CHCl₃, 1:1 (800 ml), hexano-CHCl₃, 4:6 (400 ml) e hexano-CHCl₃, 2:8 (1200 ml). As frações 33-44 eluídas com hexano-CHCl₃, 2:8 forneceram um resíduo (1,4 g) que foi recromatografado em coluna de sílica gel 60 [0,050-0,20 mm; Carlo Erba (60 g)] usando CHCl₃ –EtOAc, 9,5:05 (1200 ml), CHCl₃–EtOAc, 7:3 (800 ml), EtOAc (1400 ml) e EtOAc-MeOH, 2:8 (1100 ml) como eluentes, para originar as frações A (560,0 mg), B (100,5 mg), D (169,5 mg) e E (186,0 mg), respectivamente.

Obtenção dos ésteres metílicos e dos acetados de A, B e D (A-MeAc, B-MeAc e D-MeAc)

Alíquotas das frações A (40 mg), B (27 mg) e D (54 mg) foram dissolvidas individualmente em uma mistura de éter etílico (9 ml) e metanol (1 ml). Uma solução etérea de diazometano (0 ^oC) recentemente preparada a partir de nitrosometilurea e hidróxido de potássio, foi adicionada às soluções de A, B e D à temperatura de 22 ^oC até que as soluções adquiriram coloração amarela. Após 24 horas à temperatura ambiente, os solventes das misturas foram evaporados originando sólidos amorfos incolores. Cada produto resultante da reação de metilação foi então acetilado em piridina (1 ml) e anidrido acético (1,5 ml). Após 24 horas à temperatura ambiente, o excesso deAc₂O foi decomposto por adição de H₂O (8 ml) e, a solução foi extraída com CHCl₃ (3 x 5 ml). A fase clorofórmica foi lavada com água, sêca com Na₂SO₄ anidro e evaporada. Os resíduos foram submetidos à cromatografia em fase preparativa (sílica gel 60, F₂₅₄, 0.50 mm; Merck) fornecendo os seguintes resultados: A-MeAc (40 mg) exibiu uma banda principal com R_f 0,65 (37 mg), B-MeAc (27 mg) mostrou três bandas com R_f 0,70 (3 mg), R_f 0,40 (4,5 mg) e R_f 0,20 (9 mg) e, D-MeAc (55 mg) duas bandas com R_f 0,35 (19 mg) e R_f 0,25 (17 mg). Todas as bandas foram obtidas por eluição com diclorometano e foram visualizadas através de lâmpada UV (254 nm) após prévia pulverização com solução de rhodamina 6G (Merck) em acetona.

Purificação dos produtos

A análise através de cromatografia gasosa (GC) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) revelou que a amostra com R_f 0,65 de A-MeAc, era constituída de três componentes. Uma alíquota (17 mg) foi submetida à cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) [coluna RP 18 Zorbax ODS (25 cm x 9.4 cm i.d., 7 mm); solvente: metanol – água, 8 : 2; fluxo: 5ml/min] em escala semi-preparativa permitindo coletar os dois componentes principais [1 (2,5 mg) e 2 (10,0 mg)]. A análise da amostra com R_f 0,20 de B-MeAc (9 mg) revelou a existência de três componentes. Através de CLAE utilizando as mesmas condições descritas acima, foi possível separar os três [3 (1,5 mg), 4 (4mg) e 5 (2 mg)]. A análise das amostras com R_f 0,25 (17,0 mg) e com R_f 0,35 (19,0 mg) de D-MeAc mostrou também que ambas tratavam-se de misturas. CLAE utilizando as mesmas condições anteriores, possibilitou a separação de 6 (5,5 mg) e 7 (2,5 mg), respectivamente.

Dados obtidos dos espectros de massa (EIMS) e IV classificados como principais

1: m/z 512 ([M]⁺), 452 (M-CH₃CO₂H), 392 (M-2CH₃CO₂H), 262, 203; n_max, cm^-1 1728, 1658, 1464, 1368, 1241; 2: m/z 512 ([M]⁺), 452 (M-CH₃CO₂H), 392 (M-2CH₃CO₂H), 262, 203; n_max cm^-1 1729, 1464, 1369, 1242; 3: m/z 570 ([M]⁺), 510 (M-CH₃CO₂H), 450 (M-2CH₃CO₂H), 262, 203; n_max cm^-1 1731, 1460, 1372, 1244, 1201; 4: m/z 570 ([M]⁺), 510 (M-CH₃CO₂H), 450 (M-2CH₃CO₂H), 391, 262, 203; n_max cm^-1 1741, 1460, 1372, 1247, 1039; 5: m/z 568 ([M]⁺), 508 (M-CH₃CO₂H), 449, 389, 247; n_max cm^-1 1742, 1460, 1373, 1247, 1039; 6: m/z 528 ([M]⁺), 510 (M-H₂O), 468 (M-CH₃CO₂H), 453, 260, 190, 179; n_max cm^-1 3440, 1732, 1460, 1373, 1244, 1201, 1027; 7: m/z 568 ([M]⁺), 508 (M-CH₃CO₂H), 448 (M-2CH₃CO₂H), 433, 389, 247; n_max cm^-1 1731, 1460, 1372, 1244, 1202, 1027.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Brasil, pelo auxílio financeiro, ao Laboratoire de Géochimie Organique, ULP, Estrasburgo, França, pelas facilidades nas separações cromatográficas e, ao Laboratoire de RMN et de Modelisation Moléculaire, ULP, Estrasburgo, França, pelos espectros de RMN.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  31 Ago 2001
• Data do Fascículo
  Ago 2001

Histórico

• Aceito
  10 Out 2000
• Recebido
  05 Jun 2000