Pré-condicionamento com dexmedetomidina protege contra lesões induzidas por lipopolissacarídeos em células epiteliais alveolares humanas

Resumo

Justificativa e objetivos

Dexmedetomidina (DEX) demonstrou ter efeito pré-condicionante e também efeitos protetores contra lesão organizada. Neste estudo, com células A549 (células epiteliais alveolares humanas), investigamos se o pré-condicionamento com DEX proporcionaria proteção contra lesão pulmonar aguda (LPA) in vitro.

Métodos

Células A549 foram aleatoriamente distribuídas em quatro grupos (n = 5): controle, DEX, lipopolissacarídeos (LPS) e D-LPS (DEX + LPS). Administramos solução de PBS (tampão fosfato-alcalino) ou DEX. Após 2 h de pré-condicionamento, o meio foi renovado e as células desafiadas com LPS por 24 h nos grupos LPS e D-LPS. Em seguida, malondialdeído (MDA), superóxido dismutase (SOD), Bcl-2, Bax, caspase-3 e em A549 foram testados. Apoptose também foi avaliada nas células.

Resultados

Em comparação com o grupo LPS, o pré-condicionamento com DEX reduziu a apoptose (26,43% ± 1,05% vs. 33,58% ± 1,16%, p < 0,05) em células A549, o que está correlacionado com a diminuição de MDA (12,84 ± 1,05 vs. 19,16 ± 1,89 nmol.mg^-1 de proteína, p < 0,05) e aumento da atividade de SOD (30,28 ± 2,38 vs. 20,86 ± 2,19 U.mg^-1 de proteína, p < 0,05). O pré-condicionamento com DEX também aumentou o nível de Bcl-2 (0,53 ± 0,03 vs. 0,32 ± 0,04, p < 0,05) e diminuiu o nível de Bax (0,49 ± 0,04 vs. 0,65 ± 0,04, p < 0,05), caspase-3 (0,54 ± 0,04 vs. 0,76 ± 0,04, p < 0,05) e citocromo c.

Conclusão

O pré-condicionamento com DEX tem efeito protetor contra LPA in vitro. Os potenciais mecanismos envolvidos são inibição da morte celular e melhoria da antioxidação.

Palavras-chave
Dexmedetomidina; Lipopolissacarídeos; Pré-condicionamento; Lesão pulmonar aguda; Células epiteliais alveolares

Abstract

Background and objectives

Dexmedetomidine (DEX) has demonstrated the preconditioning effect and shown protective effects against organize injury. In this study, using A549 (human alveolar epithelial cell) cell lines, we investigated whether DEX preconditioning protected against acute lung injury (ALI) in vitro.

Methods

A549 were randomly divided into four groups (n = 5): control group, DEX group, lipopolysaccharides (LPS) group, and D-LPS (DEX + LPS) group. Phosphate buffer saline (PBS) or DEX were administered. After 2 h preconditioning, the medium was refreshed and the cells were challenged with LPS for 24 h on the LPS and D-LPS group. Then the malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), Bcl-2, Bax, caspase-3 and the cytochrome c in the A549 were tested. The apoptosis was also evaluated in the cells.

Results

Compare with LPS group, DEX preconditioning reduced the apoptosis (26.43% ± 1.05% vs. 33.58% ± 1.16%, p < 0.05) in the A549, which is correlated with decreased MDA (12.84 ± 1.05 vs. 19.16 ± 1.89 nmoL.mg^-1 protein, p < 0.05) and increased SOD activity (30.28 ± 2.38 vs. 20.86 ± 2.19 U.mg^-1 protein, p < 0.05). DEX preconditioning also increased the Bcl-2 level (0.53 ± 0.03 vs. 0.32 ± 0.04, p < 0.05) and decreased the level of Bax (0.49 ± 0.04 vs. 0.65 ± 0.04, p < 0.05), caspase-3 (0.54 ± 0.04 vs. 0.76 ± 0.04, p < 0.05) and cytochrome c.

Conclusion

DEX preconditioning has a protective effect against ALI in vitro. The potential mechanisms involved are the inhibition of cell death and improvement of antioxidation.

Keywords
Dexmedetomidine; Lipopolysaccharides; Preconditioning; Acute lung injury; Alveolar epithelial cell

Introdução

A lesão pulmonar aguda (LPA) e sua forma mais grave, a síndrome do desconforto respiratório agudo (SARA), são uma condição relativamente comum em pacientes críticos, associada a uma alta taxa de morbidade e mortalidade e caracterizada por edema pulmonar com alto teor de proteína e insuficiência respiratória hipoxêmica grave que podem ser o resultado de muitos insultos clínicos, inclusive sepse e pneumonia.^1-3 Embora haja uma intensa pesquisa e uma melhor compreensão da fisiopatologia de LPA/SARA, não há tratamentos farmacológicos específicos que comprovem seus benefícios. Portanto, as taxas de morbidade e mortalidade permanecem significativas em 35%-40%.^3-5

Há relatos de que o pré-condicionamento oferece proteção efetiva contra LPA por meio de estímulo prévio.^6,7 Atualmente, o pré-condicionamento tem sido amplamente estudado na prática clínica por seu potencial de oferecer uma oportunidade única de exercer efeitos protetores. Hoje sabemos que a proteção pode ser provocada de forma mais segura por muitos fármacos, como dexmedetomidina (DEX).^8,9

O uso de DEX como sedativo é comum em contextos clínicos. Recentemente, pesquisadores descobriram que DEX tem potencial para imitar o efeito do pré-condicionamento e mostrou efeitos protetores contra lesões organizadas causadas por lipopolissacarídeos (LPS).^10,11 Essa evidência indica que DEX pode ter efeito protetor contra LPA. Neste estudo, usamos o modelo de lesão A549 induzida por LPS para simular LPA in vitro, investigamos se o pré-condicionamento com DEX produziria proteção contra LPA. Também investigamos os efeitos do pré-condicionamento com DEX na morte celular e na função da antioxidação para obter uma melhor percepção do(s) mecanismo(s).

Material e métodos

Cultura celular e tratamentos

Células humanas de linhagem epitelial alveolar (A549) foram obtidas do China Center for Type Culture Collection (CCTCC, Wuhan University, Wuhan, China). As células A549 foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com soro bovino fetal (10%), glutamina (2 mmol.L), penicilina (100 U.mL^-1) e estreptomicina (100 mg.mL^-1) e mantidas em ambiente úmido a 37 °C e CO₂ a 5%.

As A549 na fase logarítmica de crescimento foram semeadas em uma placa de 96 poços (2 × 10³). Após a cultura durante a noite, essas células foram randomicamente separadas em quatro grupos de tratamento diferentes: os grupos DEX (Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd., Jiangsu, China) e D-LPS receberam DEX (10 µg.mL^-1) e os grupos controle e LPS (Sigma-Aldrich, San Luis, MO, EUA) receberam o mesmo volume de solução tampão-fosfato salina (PBS). Após duas horas de exposição ao agente farmacológico, cada placa de poços foi lavada e as células foram desafiadas com LPS (50 µg.mL^-1) por 24 horas nos grupos LPS e D-LPS. Em seguida, as células foram coletadas para análise posterior.

Mensuração da formação de malondialdeído (MDA) e da atividade de superóxido dismutase (SOD)

O nível de formação de MDA e a atividade de SOD foram determinados como marcadores de estresse oxidativo com kits comercialmente disponíveis (Jiancheng Biologic Project Co., Nanjing, China). A concentração de proteína foi determinada com o kit de análise de proteína BCA (BestBio Co., Shanghai, China), de acordo com o protocolo do fabricante.

Western blotting

As células foram homogeneizadas e a concentração de proteína do sobrenadante foi determinada com o método BCA. O sobrenadante com 50 µg de proteína foi separado por SDS-PAGE e transferido para uma membrana de nitrocelulose. Os anticorpos primários incluíram caspase-3, Bcl-2, Bax (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) e β-actina (Abcam, Cambridge, MA, EUA). A membrana foi então incubada com um anticorpo secundário anticoelho conjugado com HRP (1:20.000; Pierce) por uma hora e o “borramento” (blotting) foi desenvolvido com um kit de detecção de quimioluminescência SuperSignal (Pierce). O imunoblotting foi visualizado com um processador de raios X Kodak 102 (Eastman Kodak, Rochester, NY, EUA) e analisado com o programa Quantity One-4.2.3 (Bio-Rad, Hercules, CA).

Ensaio de liberação do citocromo-c

Conforme descrito anteriormente,¹² as células A549 foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 15 minutos, permeabilizadas com Triton X-100 a 0,1% por 10 minutos e bloqueadas com 3% de soro dissolvido em PBS por 30 minutos em temperatura ambiente. As células foram então sondadas com anticorpo anticitocromo-c (1:100; Santa Cruz Biotechnology) durante a noite a 4 °C. As células foram lavadas com PBS duas vezes e incubadas com anticorpo secundário conjugado com FITC (1:200; Biovision, China) por duas horas no escuro a 37 °C. Após a lavagem, as imagens das células coradas foram obtidas com um microscópio de fluorescência.

Detecção de apoptose por citometria de fluxo

Com um kit de detecção de apoptose de anexina (Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit - BioVision, MA, EUA), as células apoptóticas foram avaliadas via análise da citometria de fluxo (FACScan, BD Biosciences, San Jose, CA, EUA).¹³ Os dados foram analisados com o programa CellQuest (BD Biosciences).

Análise estatística

Os dados de cinco experimentos independentes foram expressos em média ± EPM. Anova e o teste de Student-Newman-Keuls (SNK) foram feitos para determinar a significância estatística. Diferenças significativas foram estabelecidas em p < 0,05.

Resultados

Efeitos de DEX sobre o estresse oxidativo em A549

Em comparação com o grupo controle, os LPS diminuíram a atividade de SOD em A549 (46,34 ± 2,24 U.mg^-1 de proteína vs. 20,86 ± 2,19 U.mg^-1 de proteína, p < 0,05) (fig. 1A) e aumentaram a formação de MDA (7,68 ± 0,92 nmoL.mg^-1 de proteína vs. 19,16 ± 1,8 nmoL.mg^-1 de proteína, p < 0,05) (fig. 1B). Esse efeito foi significativamente atenuado pelo pré-condicionamento com DEX (30,28 ± 2,38 U.mg^-1 de proteína e 12,84 ± 1,05 nmoL.mg^-1 de proteína, p < 0,05 vs. grupo LPS).

Figura 1
(A) Atividade de SOD em A549. (B) Níveis de MDA em A549. Controle, sem lesões; DEX, dexmedetomidina; LPS, lipopolissacarídeos; D-LPS, DEX + LPS. Valores expressos em média + EPM, n = 5 para cada grupo. ^* p < 0,05 vs. grupo controle e ^# p < 0,05 vs. grupo LPS.

Efeitos de DEX sobre a expressão de Bcl-2, Bax e caspase-3

Em comparação com o grupo controle, os LPS diminuíram o nível de Bcl-2 (0,79 ± 0,03 vs. 0,32 ± 0,04, p < 0,05) e aumentaram a expressão de Bax (0,29 ± 0,03 vs. 0,65 ± 0,04, p < 0,05) em A549 (fig. 2A e 2 B). Esse efeito foi significativamente atenuado pelo pré-condicionamento com DEX (0,53 ± 0,03 e 0,49 ± 0,04, p < 0,05 vs. grupo LPS). Em comparação com o grupo controle, os LPS aumentaram a expressão da caspase-3 (0,36 ± 0,03 vs. 0,76 ± 0,04, p < 0,05) em A549 (fig. 2C e 2 D). Esse efeito foi significativamente atenuado pelo pré-condicionamento com DEX (0,54 ± 0,04, p < 0,05 vs. grupo LPS).

Figura 2
(A) Imagem representativa de Bcl-2 e Bax. (B) Níveis de Bcl-2 e Bax. (C) Imagem representativa de caspase-3. (D) Nível de caspase-3. Controle, sem lesões; DEX, dexmedetomidina; LPS, lipopolissacarídeos; D-LPS, DEX + LPS. Valores expressos em média + EPM, n = 5 para cada grupo. ^* p < 0,05 vs. grupo controle e ^# p < 0,05 vs. grupo LPS.

Efeitos de DEX sobre a liberação de citocromo-c

O citocromo-c do espaço intermembranar mitocondrial no citoplasma é um passo crítico na progressão da via apoptótica intrínseca. No grupo controle, o citocromo-c apresentou nível bem pouco detectável, enquanto LPS resultou em aumentos significativos. Esse efeito dos LPS foi atenuado pelo pré-condicionamento com DEX (fig. 3).

Figura 3
Seções representativas do citocromo-c. Controle, sem lesões; DEX, dexmedetomidina; LPS, lipopolissacarídeos; D-LPS, DEX + LPS. A fluorescência verde mostra o citocromo-c e a fluorescência azul (DAPI) mostra o DNA. Ampliação original 400×.

Efeitos de DEX sobre apoptose

Em comparação com o grupo controle, os LPS aumentaram a porcentagem de células apoptóticas em A549 (1,57% ± 0,52% vs. 33,58% ± 1,16%, p < 0,05) (fig. 4A e 4 B). Esse efeito foi significativamente atenuado pelo pré-condicionamento com DEX (26,43% ± 1,05%, p < 0,05 vs. grupo LPS).

Figura 4
(A) Imagem representativa da citometria de fluxo. (B) O grau de apoptose celular. Controle, sem lesões; DEX, dexmedetomidina; LPS, lipopolissacarídeos; D-LPS, DEX + LPS. Valores expressos em média + EPM, n = 5 para cada grupo. ^* p < 0,05 vs. grupo controle e ^# p < 0,05 vs. grupo LPS.

Discussão

Este estudo demonstrou que o pré-condicionamento com DEX diminuiu significativamente a lesão induzida por LPS em A549. Os principais achados são os seguintes: (1) o pré-condicionamento com DEX reduziu a formação de MDA e aumentou a atividade de SOD em A549; (2) o pré-condicionamento com DEX aumentou a relação Bcl-2/Bax e diminuiu os níveis de caspase-3 e citocromo-c; (3) o pré-condicionamento com DEX atenuou a apoptose em A549. Esses dados fornecem a primeira evidência de que o pré-condicionamento com DEX atenua a lesão em células A549 causada por LPS.

Estudos relataram que o estresse oxidativo desempenha um papel importante na lesão induzida por LPS.^14,15 Em linha com estudos anteriores, também observamos o estresse oxidativo induzido por LPS pelo aumento de MDA, mas uma redução de SOD em A549. MDA é o produto de degradação dos radicais livres derivados do oxigênio e da peroxidação lipídica. Portanto, o aumento de MDA implica comprometimento da estrutura normal da membrana e lesão tecidual oxidativa.¹⁶ Em contraste, SOD é considerada uma importante enzima antioxidante intracelular com múltiplas funções biológicas. O aumento da enzima antioxidante SOD pode indicar a capacidade celular de eliminação e extinção de radicais livres.^17,18 Estudos anteriores também relataram que DEX impediu as reações de peroxidação com o aumento de SOD, mas diminuiu o MDA nos tecidos.^19,20 No experimento, nossos resultados demonstraram obviamente que o pré-condicionamento com DEX resultou em aumento da atividade de SOD e diminuição de MDA em A549. Essas descobertas sugerem que o pré-condicionamento com DEX poderia exercer proteção contra o dano oxidativo induzido por LPS em A549 e modular assim a lesão e disfunção celular.

Várias evidências indicaram o envolvimento do estresse oxidativo nos mecanismos patológicos subjacentes da apoptose induzida por LPS em A549.^21,22 Como sugerido em nossos resultados, também descobrimos que os LPS apresentaram uma proporção significativamente reduzida de Bcl-2/Bax associada ao aumento de MDA e à diminuição da atividade de SOD em A549. Tanto Bcl-2 quanto Bax pertencem à família Bcl-2. Porém, Bcl-2 pode ser considerado um componente celular importante que não apenas protege contra a morte celular apoptótica, mas também influencia múltiplos eventos celulares. Em estudos recentes, descobriu-se que Bcl-2 fornece proteção contra lesões induzidas por LPS em alguns órgãos, inclusive A549.^23,24 Em contraste, Bax exibe ações proapoptóticas. Quando há superexpressão de Bax, canais ou poros podem ser formados para permitir a liberação de fatores como o citocromo-c das mitocôndrias para propagar a apoptose.²⁵ Portanto, a relação das proteínas Bcl-2/Bax é provavelmente crítica para a sobrevivência celular após a lesão.²⁴ No presente estudo, os resultados indicaram que DEX aumentou a expressão de Bcl-2 e diminuiu a expressão de Bax e levou a um aumento da relação Bcl-2/Bax.

A liberação de citocromo-c e a ativação da caspase-3 são um ponto crucial na cascata apoptótica e podem ser reguladas pela relação Bcl-2/Bax.²⁶ Estudos anteriores mostraram que a geração excessiva de oxidação pode causar a liberação de citocromo-c e a ativação de caspase-3. O processo pode ser deprimido pela Bcl-2. O citocromo-c liberado e a caspase-3 ativada clivam a jusante os alvos celulares críticos envolvidos na condensação de cromatina, fragmentação do DNA e destruição do citoesqueleto, expressam assim as dramáticas alterações morfológicas da apoptose.^25-27 Demonstrou-se que os LPS são uma das formas de induzir a liberação de citocromo-c e a ativação de caspase-3 em A549.²⁸ No presente estudo, os dados também mostram que a liberação de citocromo-c e a ativação de caspase-3 aumentaram significativamente após a administração de LPS em A549, em linha com os estudos anteriores. Além disso, observamos que a liberação de citocromo-c e a ativação de caspase-3 foram deprimidas pelo pré-condicionamento com DEX.

A apoptose é um processo fundamental da morte celular que ocorre por meio da ativação de vias de sinalização distintas e envolve uma regulação de forma decrescente da relação Bcl-2/Bax e liberação de citocromo-c e ativação de caspase-3 in vitro.^28,29 Como resultado final, as células são destruídas e formam órgãos apoptóticos.³⁰ LPS mostrou iniciar essa cascata apoptótica em A549.²⁴ Com um modelo de LPA in vitro, nossos dados demonstram redução significativa da apoptose após o pré-condicionamento com DEX, o que correlacionou com a regulação de forma crescente da relação Bcl-2/Bax e depressão da ativação de caspase-3 e liberação de citocromo-c.

Contudo, nosso estudo descritivo tem algumas limitações óbvias que precisam ser abordadas, tais como um único momento de coleta de amostra, o breve período de observação e a falta de correlação com as mensurações clínicas de LPA. Além disso, apenas investigamos a concentração de DEX, que é muito grande para a prática clínica. Em comparação com a clínica, uma grande dose é geralmente usada em laboratório.^31,32 Em experimentos, alguns estudos relataram até o uso de doses mais altas. Esses podem estar relacionados a diferentes espécimes.^31,32 A relação entre a dose e o efeito permanece obscura. Portanto, estudos relacionados à relação dose-efeito precisam de uma exploração mais abrangente do modelo.

Sumário

Nossos dados mostram que o pré-condicionamento com DEX pode efetivamente atenuar a lesão induzida por LPS em A549. Os efeitos protetores podem envolver uma redução do estresse oxidativo e da morte celular induzida por LPS. Esses resultados experimentais sugeriram DEX pode ser eficaz no tratamento de LPA induzido por LPS.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Nov-Dec 2017

Histórico

• Recebido
  17 Mar 2016
• Aceito
  27 Fev 2017