Implicações do estresse oxidativo sobre o metabolismo eritrocitário de pessoas com Síndrome de Down

Implications of the oxidative stress on the erythrocyte metabolism of Down Syndrome individuals

ARTIGO ARTICLE

Implicações do estresse oxidativo sobre o metabolismo eritrocitário de pessoas com Síndrome de Down

Implications of the oxidative stress on the erythrocyte metabolism of Down Syndrome individuals

Rinaldo H. Aguilar-da-Silva^I; Thiago P. Moraes^II; Gilberto Moraes^III

^IDocente de Bioquímica da Faculdade de Medicina de Marília (Famena)

^IIResidente de Clínica Médica –Fanema

^IIIUniversidade Federal de São Carlos –UFSCar

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Portadores da Síndrome de Down estão sob estresse oxidativo endógeno e crônico que pode ser resultado do excesso de atividade da SOD-1. Este trabalho descreve alguns indicadores e adaptações das defesas frente aos danos oxidativos. Observamos que, nas pessoas com Síndrome de Down, a presença de estresse oxidativo (aumento de 48% na atividade da SOD-1) induziu várias adaptações no metabolismo eritrocitário, sendo que a redução da meta-hemoglobina, via aumento da atividade da meta-hemoglobina redutase (29%), garantiria a eficiência do transporte de oxigênio, enquanto o aumento da GSH (61%) propiciaria a integridade funcional do eritrócito. A diminuição dos valores de concentração de hemoglobina e hematócrito, possivelmente, resulta do aumento de atividade da enzima Glicose-6-fosfato desidrogenase e redução da meia-vida eritrocítica. Os efeitos destas adaptações sob a oxigenação do sangue merecem maiores investigações.

Palavras-chave: Síndrome de Down; estresse oxidativo; GSH; SOD-1; eritrócito.

ABSTRACT

Down's Syndrome carriers are under endogenous and chronic oxidative stress that can result from an excessive SOD-1enzyme activity. This work describes some indicators and adaptations of the defense system faced with oxidative damage. We observed that, in Down's Syndrome individuals, the presence of oxidative stress (with an increase of 48% in the SOD-1 activity) induced several adaptations of the erythrocyte metabolism, with a reduction of methemoglobin, through an increase of methemoglobin reductase activity (29%) which guaranteed the efficiency of oxygen transportation. The increase of GSH (61%) would propitiate the maintenance of the integrity of the membrane, essential to the functional integrity of erythrocytes. The decrease in the hemoglobin and hematocrit concentrations, possibly, results from the increase in the activity of the glucose-6-phosphate dehydrogenase enzyme, and a reduction in the half-life of erythrocytes. The effects of these adaptations on blood oxygenation require further investigations.

Key words: Down's Syndrome; oxidative stress; GSH; SOD-1; erythrocyte.

Introdução

A Síndrome de Down é uma doença cromossômica que consiste na presença e expressão de três cópias de genes localizados no cromossomo 21. Presume-se que o fenótipo nesta trissomia seja resultante da expressão de certos genes encontrados no cromossomo 21,¹ principalmente como conseqüência da duplicação da região 21q22,² onde se localiza o gene que codifica a superóxido dismutase-1(SOD-1).^3-9 A cópia extra do gene da superóxido dismutase-1 (SOD-1) confere aos portadores da Síndrome de Down uma atividade da enzima aumentada em 50% em diferentes tipos de células – eritrócitos, leucócitos, plaquetas e fibroblastos.^4,10-15 Isto proporcionaria um quadro de agressão endógena constante, dada a aceleração da reação de formação de peróxido de hidrogênio (H₂O₂) e pelo desequilíbrio entre a atividade da SOD-1⁴ e glutationa peroxidase (GSH-Px),¹⁶ com a conseqüente oxidação dos grupos sulfídricos e a peroxidação dos lipídios insaturados causando dano celular.¹⁷ Estes pacientes trissômicos possuem algumas características como envelhecimento precoce, dano cerebral e modificações bioquímicas que são secundárias ao dano oxidativo dentro da célula, o que poderia ser conseqüência desse desequilíbrio genético-bioquímico.

Um indicador sensível na avaliação do nível de estresse oxidativo são os glóbulos vermelhos, que, durante seu ciclo vital, entram em contato com as mais diversas estruturas orgânicas. Apesar de apresentarem um metabolismo mínimo, este é fisiologicamente significativo, sendo responsável pela manutenção da estrutura da membrana e da hemoglobina, da forma do eritrócito e da defesa contra o dano oxidativo. Sua função como transportador de gases os torna particularmente susceptíveis à oxidação pelo O₂ e radicais livres e, assim, diversos parâmetros da integridade e funcionalidade das células vermelhas são negativamente afetados pelo aumento do estresse oxidativo.^18-21 Deste modo, os eritrócitos se apresentam como marcadores biológicos das agressões tóxicas e oxidantes em diferentes órgãos e sistemas.

Frente às repercussões fisiológicas da presença do estresse oxidativo endógeno e crônico, avaliamos suas implicações sobre os índices hematológicos, concentração de meta-hemoglobina e defesas antioxidantes eritrocitárias em indivíduos com Síndrome de Down.

Casuística e Métodos

No presente estudo foram analisados 24 amostras de sangue pertencentes a indivíduos (6,4 ± 1,3 anos) do sexo masculino, 12 portadores da Síndrome de Down da APAE – Associação dos Pais e Amigos dos Excepcionais de Marília e 12 indivíduos controle. Todos tiveram autorização de seus responsáveis, que foram previamente esclarecidos sobre a pesquisa. O presente estudo foi realizado de acordo com a declaração de Helsinki (1989) e foi aprovado pelo Comitê de Ética da APAE de Marília – SP.

As amostras de sangue foram obtidas por punção venosa e colocadas em tubos de ensaios, um contendo anticoagulante EDTA em solução aquosa a 5% (1 gota/ml de sangue) para a utilização de sangue total e plasma e outro sem anticoagulante para a obtenção de soro.

A enzima SOD-1 foi determinada, segundo Beutler,²² com uma substância denominada pirogalol, que se auto-oxida rapidamente em solução aquosa, produzindo uma coloração amarelada cuja intensidade de cor pode ser determinada em 420 nm. Este processo é dependente da presença de ânions superóxidos. A SOD-1 inibe a auto-oxidação do pirogalol porque catalisa a quebra do ânion superóxido. Esta inibição pode, então, ser monitorada em 420 nm. A quantidade de enzima capaz de promover 50% de inibição é definida como sendo uma unidade de enzima ativa.

Para a determinação da atividade da meta-hemoglobina redutase, o método²² baseia-se na redução da meta-hemoglobina pelo citocromo b₅, sendo que este é mantido no seu estado reduzido por ação de um elétron derivado da NADH através da ação enzimática da NADH meta-hemoglobina redutase. Neste teste, o substrato utilizado para receber os elétrons foi o ferricianeto de potássio e a reação monitorada em 340 nm.

A meta-hemoglobina foi determinada, segundo Naoum,²³ em 630 nm, e a glutationa reduzida (GSH), segundo Beutler,²² em 412 nm. As determinações hematológicas: hemoglobina (Hb), hematócrito (Hct), hemoglobina corpuscular média (HCM) e volume corpuscular médio (VCM) foram determinadas através de um Contador Coulter Automático.

Para cada uma das variáveis, foram calculadas a média e o desvio padrão. A significância estatística (p <0,05) das diferenças encontradas foi avaliada pelo teste-t de Student. A relação entre variáveis foi determinada pela análise de correlação de Pearson.

Resultados

Os valores médios da SOD-1 foram de 2.191,30 U/g de Hb para o grupo controle e 3.245,20 U/g de Hb para o grupo Síndrome de Down. O teste estatístico mostrou que, no nível de significância de 5%, os valores da atividade no grupo Síndrome de Down são, significativamente, diferentes do grupo controle (P<0,0001), revelando aumento de, aproximadamente, 48% quando comparadas as médias dos dois grupos (Figura 1).

Em relação à enzima meta-hemoglobina redutase, os valores da atividade foram significativamente aumentados no grupo Síndrome de Down (24.96 U/g de Hb) em relação ao grupo controle (19,28 U/g de Hb). O teste estatístico (P<0,001) revelou o aumento de, aproximadamente, 29% no grupo Síndrome de Down (Figura 2).

O teste de correlação linear demonstrou que, em nível de significância de 5%, existiu correlação positiva (controle : r=0,59 e Síndrome de Down: r=0,72) entre os níveis da atividade enzimática da SOD-1 e da meta-hemoglobina redutase, em ambos os grupos. O coeficiente de determinação (r²) foi de 35% no grupo controle e 52% no grupo Síndrome de Down.

Para a GSH, os valores obtidos para o grupo controle (5,923 µmoles/g Hb ± 0,94) mantiveram-se dentro do intervalo de referência (6.57 µmoles/g Hb ± 1.04; média ± SD). No grupo Síndrome de Down, o teste estatístico mostrou que, no nível de significância de 5%, os valores obtidos (9,69 µmoles/g Hb ± 1,85) são, significativamente, diferentes do grupo controle (P<0.001), revelando o aumento de, aproximadamente, 61% quando comparadas as médias dos dois grupos.

Os valores de meta-hemoglobina foram de 0,736% (± 0,28) para o grupo controle e 2,027% (± 0,56) para o grupo Síndrome de Down. O teste estatístico, no nível de significância de 5%, revelou que os valores são estatisticamente diferentes (P<0.001).

As determinações hematológicas mostraram-se significativamente diferentes para concentração de Hb e Hct com P<0.001 (Tabela 1).

Discussão

Os eritrócitos são células altamente especializadas para a função de transporte de O₂. Essa atividade só pode ocorrer em decorrência da presença do seu sistema enzimático herdado durante o período eritroblástico, que mantém-se ativo durante o tempo em que eles permanecem na circulação sangüínea. A importância do sistema oxirredutor eritrocitário reside no fato de que, tanto a glutationa no seu estado reduzido, quanto o ferro no estado Fe⁺⁺, são fatores determinantes na manutenção da integridade funcional do eritrócito, incluindo sua capacidade de deformabilidade e de ligação reversível do O₂. Deste modo, os processos oxidativos estão intimamente relacionados ao metabolismo das células vermelhas incluindo a via glicolítica, via das pentoses fosfato, metabolismo da glutationa, metabolismo do NAD e NADP e atividades das enzimas SOD-1 e meta-hemoglobina redutase.

Diversos agentes químicos, incluindo os peróxidos, podem oxidar o Fe⁺⁺ na hemoglobina para Fe⁺⁺⁺, produzindo a meta-hemoglobina, que não possui mais capacidade de ligar-se ao O₂, e íon superóxido.

Fisiologicamente, em indivíduos normais, a produção de meta-hemoglobina é constante. Porém, as enzimas de reconversão do processo atuam no sentido de manter valores fisiológicos de, aproximadamente, 1,7%, o que não comprometerá o funcionamento do sistema carreador de O₂ do sangue. Deste modo, a quantidade de meta-hemoglobina circulante em indivíduos saudáveis resulta do equilíbrio entre sua produção e redução.

O processo de redução da meta-hemoglobina em células vermelhas normais é conseguido, primariamente, por um sistema ligado a NADH,²⁴ onde a meta-hemoglobina redutase utiliza NADH gerado na reação da gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase para reduzir o ferro da hemoglobina de forma trivalente para a bivalente.

No caso de indivíduos com Síndrome de Down, sujeitos ao estresse oxidativo endógeno crônico, os efeitos sobre a integridade estrutural e funcional da hemoglobina seriam muito mais acentuados. No entanto, observamos aumento da atividade da meta-hemoglobina redutase, o que corrobora os dados de Pantelakis et al²⁵ para Síndrome de Down e o encontrado em outros modelos de estresse oxidativo.^26,27,28 Este aumento seria compensação metabólica secundária ao aumento da concentração de meta-hemoglobina, conseqüente ao aumento de radicais livres, como evidenciado pela correlação positiva estabelecida entre as atividades da SOD-1 e meta-hemoglobina redutase.

Schraufstatter et al²⁹ e Hyslop et al³⁰ descreveram o efeito dos oxidantes, principalmente o H₂O₂ (que em Síndrome de Down está aumentado), inibindo a via glicolítica, principalmente, na reação da gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (G3 PDH). Esta inibição foi acompanhada por elevação dos intermediários metabólicos, gliceraldeído-3-fosfato e diidroxiacetona-fosfato em aproximadamente 1/6, e diminuição das concentrações de lactato na mesma proporção. Conseqüente a isto, ocorreu uma diminuição nos níveis de NADH. Pastor et al³¹ observaram aumento da atividade da GSH-Px (8,3%) e da catalase (24,3%) em eritrócitos de pessoas com Síndrome de Down, evidenciando indução, por excesso de H₂O₂, provavelmente devido à resposta adaptativa ao estresse oxidativo. Assim, a inibição da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase seria minimizada, de forma a garantir um suprimento adequado de NADH para a atividade da meta-hemoglobina redutase.

Isto pode estar refletido nos valores de meta-hemoglobina observados que, embora aumentados em relação ao grupo controle, encontram-se dentro do intervalo de referência de normalidade. Este fato indica que a resposta de defesa é efetiva em ajustar o sistema ao nível normal de homeostase redox, numa tentativa de prevenir o aumento da formação de meta-hemoglobina que poderia levar à formação de corpos de Heinz e hemólise.

Recebido: 06/06/2003

Aceito após modificações: 09/09/2003

Avaliação: Editor e dois revisores externos

Conflito de interesse: não declarado

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  27 Abr 2004
• Data do Fascículo
  2003

Histórico

• Recebido
  06 Jun 2003
• Aceito
  09 Set 2003