Padronização da metodologia do RT-PCR utilizado para identificação do mRNA da alfa-amilase em sementes de milho

RT-PCR patterning for alpha-amylase messenger RNA identification in germinating maize seeds

Resumos

Durante a germinação das sementes, os carboidratos de reserva são degradados pela atividade de a-amilase. A identificação de mRNA é uma ferramenta fundamental para a definição da cinética de síntese de alfa-amilase. Objetivou-se padronizar a metodologia do RT-PCR para identificar o mRNA do gene de a-amilase em sementes de milho. Após três dias de germinação das cultivares Saracura-BRS 4154 e CATI-AL34, extraiu-se o RNA total pelo método do tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio, com algumas modificações. A partir do RNA total extraído foi obtido cDNA com utilização de "random primers". A amplificação por PCR de uma porção do gene da alfa-amilase foi realizada com os "primers": "sense" - CGACATCGACCACCTCAAC; "antisense" - TTGACCAGCTCCTGCCTGTC; gelatina; DMSO e 1,25 unidades de Taq DNA polimerase por reação e completados com água tratada com DEPC. Os ciclos para a amplificação foram 94ºC durante 4 minutos, seguidos por 34 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 42ºC durante 1 minuto e 72ºC durante 1,5 minutos e, finalmente, 72ºC por 5 minutos. O produto do RT-PCR apresentou uma banda de 249 pares de base (pb) bem definida, para as duas cultivares estudadas, não ocorrendo bandas inespecíficas. A técnica do RT-PCR mostrou ser uma metodologia eficiente para a identificação da expressão de alfa-amilase durante a germinação das sementes e pode ser usado para estudo qualitativo e quantitativo da cinética de síntese dessa enzima em experimentos de germinação.

Zea mays; sementes; alfa-amilase; RT-PCR

During germination the seed reserve carbohydrates are degraded by alpha-amylase activity. The identification of mRNA is a very important tool for definition of alpha-amylase synthesis kinetics. This study aimed to adapt a PT-PCR methodology for a-identification of amylase mRNA in germinating maize seeds. After three days germination of Saracura BRS4154 and CATI AL34 maize cultivars, the total RNA was isolated by the guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with some modifications. The cDNA was obtained from the total RNA, using random primers. The alpha-amylase gene PCR amplification was carried out with cDNA, primers (sense - CGACATCGACCACCTCAAC; antisense - TTGACCAGCTCCTGCCTGTC); gelatina; DMSO and 1,25 units of Taq DNA polimerase per reaction and complete with DEPC water. The amplification cycles were 94ºC/4 minutes, 34 cycles of 94ºC /1 minute, 42ºC/1 minute and 72ºC/1,5 minutes, and finally 72ºC/5 minutes. The RT-PCR product visualization in agarose gel eletcrophoresis indicated that this method presented well defined bands of 249 bp for the both the cultivars, without unspecific bands. The RT-PCR is an eficient method for alpha-amylase expression studies during germination and can be used as a tool for quantitative and qualitative research about alpha-amylase sinthesis kinetics.

seeds; Zea mays; alpha-amylase; RT-PCR

COMUNICAÇÃO TÉCNICA

Padronização da metodologia do RT-PCR utilizado para identificação do mRNA da a-amilase em sementes de milho

RT-PCR patterning for a-amylase messenger RNA identification in germinating maize seeds

Bárbara França Dantas^I; Carlos Alberto Aragão^II; João Pessoa Araújo-Junior^III; João Domingos Rodrigues^IV; Cláudio Cavariani^V; João Nakagawa^V

^IEngº Agrº MSc. Doutoranda, Pesquisadora, EMBRAPA/CPATSA, Cx. Postal 23, 56300-970, Petrolina - PE; e-mail: [e-mail]

^IIEngº Agrº, Msc., Doutorando, Prof. Departamento de Tec. e Ciências Sociais, FAMESF, UNEB, Juazeiro - BA

^IIIMédico Veterinário, Dr., Prof. Departamento de Microbiologia e Imunologia IB, UNESP, Botucatu - SP

^IVEngº Agrº, Dr., Prof. Departamento de Botânica, IB, UNESP, Botucatu - SP

^VEngº Agrº, Dr., Prof. Departamento de Produção Vegetal, FCA, UNESP, Botucatu - SP

RESUMO

Durante a germinação das sementes, os carboidratos de reserva são degradados pela atividade de a-amilase. A identificação de mRNA é uma ferramenta fundamental para a definição da cinética de síntese de a-amilase. Objetivou-se padronizar a metodologia do RT-PCR para identificar o mRNA do gene de a-amilase em sementes de milho. Após três dias de germinação das cultivares Saracura-BRS 4154 e CATI-AL34, extraiu-se o RNA total pelo método do tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio, com algumas modificações. A partir do RNA total extraído foi obtido cDNA com utilização de "random primers". A amplificação por PCR de uma porção do gene da a-amilase foi realizada com os "primers": "sense" - CGACATCGACCACCTCAAC; "antisense" - TTGACCAGCTCCTGCCTGTC; gelatina; DMSO e 1,25 unidades de Taq DNA polimerase por reação e completados com água tratada com DEPC. Os ciclos para a amplificação foram 94ºC durante 4 minutos, seguidos por 34 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 42ºC durante 1 minuto e 72ºC durante 1,5 minutos e, finalmente, 72ºC por 5 minutos. O produto do RT-PCR apresentou uma banda de 249 pares de base (pb) bem definida, para as duas cultivares estudadas, não ocorrendo bandas inespecíficas. A técnica do RT-PCR mostrou ser uma metodologia eficiente para a identificação da expressão de a-amilase durante a germinação das sementes e pode ser usado para estudo qualitativo e quantitativo da cinética de síntese dessa enzima em experimentos de germinação.

Termos para indexação:Zea mays, sementes, a-amilase, RT-PCR.

ABSTRACT

During germination the seed reserve carbohydrates are degraded by a-amylase activity. The identification of mRNA is a very important tool for definition of a-amylase synthesis kinetics. This study aimed to adapt a PT-PCR methodology for a-identification of amylase mRNA in germinating maize seeds. After three days germination of Saracura BRS4154 and CATI AL34 maize cultivars, the total RNA was isolated by the guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with some modifications. The cDNA was obtained from the total RNA, using random primers. The a-amylase gene PCR amplification was carried out with cDNA, primers (sense - CGACATCGACCACCTCAAC; antisense - TTGACCAGCTCCTGCCTGTC); gelatina; DMSO and 1,25 units of Taq DNA polimerase per reaction and complete with DEPC water. The amplification cycles were 94ºC/4 minutes, 34 cycles of 94ºC /1 minute, 42ºC/1 minute and 72ºC/1,5 minutes, and finally 72ºC/5 minutes. The RT-PCR product visualization in agarose gel eletcrophoresis indicated that this method presented well defined bands of 249 bp for the both the cultivars, without unspecific bands. The RT-PCR is an eficient method for a-amylase expression studies during germination and can be used as a tool for quantitative and qualitative research about a-amylase sinthesis kinetics.

Index terms: seeds, Zea mays, a-amylase, RT-PCR.

INTRODUÇÃO

O termo "qualidade das sementes" envolve aspectos genéticos, físicos, fisiológicos e sanitários (Carvalho & Nakagawa, 2000) que, avaliados de maneira integrada, propiciam o conhecimento do valor real e do potencial de utilização de um lote de sementes.

A pesquisa na área de biologia molecular associada ao controle de qualidade de sementes tem evoluído rapidamente e novas técnicas têm-se mostrado úteis na obtenção de classes distintas de marcadores moleculares. Estes auxiliam na elucidação dos fatores que afetam a qualidade, a manipulação, a identificação e preservação do material genético, permitindo o monitoramento de todo o processo produtivo.

Segundo Carvalho et al. (2000) várias pesquisas têm sido desenvolvidas para detectar as diversas reações metabólicas que envolvem síntese e degradação de moléculas durante o desenvolvimento, a germinação e a deterioração de sementes.

Esses mesmos autores afirmam que durante a fase de maturação das sementes, a análise do acúmulo de materiais de reserva por meio de marcadores moleculares pode fornecer indícios da qualidade das sementes e que a atividade da enzima a-amilase tem sido utilizada como marcador relacionado com a tolerância à secagem de sementes de milho.

Durante a germinação das sementes, as reservas insolúveis de alto peso molecular são degradadas e convertidas a formas solúveis, que são rapidamente transportadas aos tecidos em crescimento e utilizadas em reações de síntese ou de produção de energia. As modificações metabólicas que ocorrem nesses estágios são resultados da atividade de várias enzimas de hidrólise e transferência (Bewley & Black, 1985). A a-amilase tem um papel fundamental nesse processo por catalizar clivagens endoglicolíticas ao acaso das ligações a-1,4 entre os resíduos de glicose das cadeias de amilose e amilopectina que compõem as reservas de amido de sementes de cereais (Mayer & Poljakoff-Mayber, 1978). São vários os fatores que influenciam na síntese e atividade de a-amilase durante a germinação das sementes e grande número de estudos de caracterização e expressão de a-amilase tem sido conduzidos em cevada, trigo e arroz (Fincher, 1989). No milho, no entanto, existem poucos trabalhos sobre os processos de transcrição, tradução e ativação dessa enzima durante a germinação.

Muitas pesquisas têm sido realizadas utilizando a técnica da transcrição reversa acoplada com a reação de polimerase em cadeia, comumente chamada de RT-PCR ("Reverse Transcriptase-Polimerase Chain Reaction"). Carlson & Chouery (1998) utilizaram a RT-PCR para estudar a função da enzima invertase em sementes de mutantes mn1 de milho. Li (1998) utilizou essa técnica em combinação com análise de enzimas de restrição para diferenciar entre a expressão de genes ltk, responsáveis pela transdução de sinais durante o desenvolvimento do endosperma das sementes de milho.

A utilização de técnicas de identificação de RNA mensageiro (mRNA) durante o processo de germinação pode definir a cinética de produção de a-amilase, bem como a influência de fatores abióticos (umidade, temperatura) na atividade dessa enzima e, consequentemente, na germinação das sementes. No entanto, poucos trabalhos são realizados com o objetivo de se definir a expressão do gene de a-amilase em sementes de milho (Mundy et al., 1985; Sanwo & Demason, 1993; 1994; Sachs et al, 1996). O presente trabalho teve como objetivo padronizar a metodologia da técnica do RT-PCR utilizada na identificação do mRNA produzido a partir do gene de a-amilase durante a germinação de sementes de milho.

MATERIAL E MÉTODOS

O trabalho foi conduzido no Laboratório de Sementes do Departamento de Agricultura da Faculdade de Ciências Agronômicas e no Laboratório de Virologia do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu-SP, nos meses de janeiro a maio de 2001.

Sementes de milho das cultivares Saracura-BRS 4154 e CATI-AL34 foram distribuídas em caixas plásticas tipo "gerbox" sobre duas camadas de papel mata-borrão e colocadas em germinador a 27ºC, no escuro, durante 3 dias. Após esse período foi realizada a extração do RNA total, segundo método do tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio proposto por Chomczynski & Sacchi (1987), com algumas modificações. Os escutelos e embriões das sementes foram macerados em 2 mL de solução desnaturante composta por 4 mol.L^-1 de tiocianato de guanidina; 25 mmol.L^-1 do tampão citrato de sódio, pH 7,0; 0,5% sarcosil e 0,1 mmol.L^-1 2-mercaptoetanol, utilizando-se almofariz e pistilo até a formação de uma suspensão homogênea. Essa suspensão foi transferida para tubos de 1,5 mL, sendo então adicionados mais 500 mL de solução desnaturante; 50 mL do tampão acetato de sódio 2 mol.L^-1, pH 4,0 e 500 mL de fenol saturado em água.

As amostras foram centrifugadas a 12000 xg durante 10 minutos a 4ºC, coletando-se o sobrenadante. Foram adicionados 200 mL de clorofórmio às amostras, homogeneizadas e incubadas no gelo, durante 15 minutos. Estas foram então centrifugadas a 12000 xg durante 15 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi transferido para tubos novos e o RNA foi precipitado em 500 mL de isopropanol. As amostras foram mantidas à temperatura ambiente durante 10 minutos e centrifugadas a 12000xg por 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi removido sendo mantido o precipitado contendo RNA total. O RNA total foi lavado em etanol 75% por centrifugação a 7500 xg por 5 minutos a 4ºC e dissolvido em 100 mL de água tratada com DEPC (dietil pirocarbonato), contendo 10 unidades de inibidor de RNAse (RNAguard^®) e incubado a 56ºC durante 10 minutos.

Para comparação com este método, foi realizada extração do RNA total utilizando-se o reagente Trizol^®, conforme instruções do fabricante (GIBCO BRL^®).

A partir do RNA total extraído foi obtido cDNA adicionando, em tubos de 500 mL, 1 mL de "random primer" (75 ng); 2 mL do inibidor de RNAse (20 unidades); 1 mL de gelatina 1%; 1-5 mg RNA total e completados para 12 mL com água tratada com DEPC, sendo incubados a 70ºC durante 10 minutos e resfriados a 4ºC. Foi adicionado 5 mL de tampão 5X First Strand^® (250 mmol.L^-1 Tris-HCl pH 8.3, 375 mmol.L^-1 KCl, 15 mmol.L^-1 MgCl₂); 2 mL de 0,1 mol.L^-1 DTT e 1 mL de 10 mmol.L^-1 de dNTP. Após incubação a 42ºC durante 2 minutos foram adicionadas 20 unidades de transcriptase reversa (SUPERSCRIPT^® II, GIBCO BRL^®, Life Technologies) e agitado. O meio de reação foi, então, incubado a 25ºC por 5 minutos; 42ºC por 50 minutos; 70ºC por 15 minutos e resfriadas a 4ºC.

A amplificação por PCR do gene de a-amilase foi realizada em volume total de 25 mL contendo 3 mL do cDNA obtido anteriormente; 2,5 mL de tampão PCR buffer^® (200mmol.L^-1TRIS-HCl pH8.4, 500mmol.L^-1 KCl); 100 mmol.L^-1 dNTP; 1,5 mmol.L^-1 MgCl₂; 0,6 mmol.L^-1 de cada "primer" ("sense"- CGA CAT CGA CCA CCT CAA C; "antisense" - TTG ACC AGC TCC TGC CTG TC); 4% DMSO; 1,25 unidades de Taq DNA polimerase (GIBCO BRL^®) por reação e completados com água tratada com DEPC.

Além desses reagentes, foram adicionados 0,01% gelatina e 4% DMSO ao meio de reação para avaliar o efeito dessas substâncias na eficiência da amplificação.

Foi colocada nos tubos, em seguida, uma gota de óleo mineral. Os ciclos para a amplificação foram 94ºC durante 4 minutos, seguidos por 34 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 42ºC durante 1 minuto e 72ºC durante 1,5 minutos e finalmente 72ºC por 5 minutos. As amostras foram então resfriadas a 4ºC.

Os "primers" foram selecionados a partir da seqüência do gene a-amilase (Acesso L25805, Young et al., 1994) utilizando o software Gene Runnerâ (Figura 1).

A identificação do fragmento amplificado foi realizada por eletroforese em gel de agarose 1,5% e coloração com brometo de etídio.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A extração do RNA total pelo método proposto por Chomczynski & Sacchi (1987), com as soluções utilizadas preparadas no próprio laboratório, foi mais eficiente que o uso do kit de extração Trizol^®. Devido à alta concentração de CG (67%) do produto de RT-PCR (Figura 1a) as fitas de cDNA não se separam facilmente, não havendo amplificação, conforme observado em testes anteriores (dados não publicados). A adição de DMSO 4% ao meio de reação propiciou melhor separação das fitas de cDNA, permitindo o anelamento dos "primers" e uma amplificação satisfatória. A obtenção de cDNA com transcriptase reversa foi mais eficiente com a utilização do "random primer" do que quando foi utilizado oligoDT, devido ao tamanho do gene de a-amilase, 1627 pb (Figura 1, Young et al., 1994). O "primer" oligoDT inicia a transcrição reversa na cauda poli-A do mRNA (1605^3'-1621^5'), e a enzima transcriptase reversa não consegue transcrever todo o gene. Os "primers" selecionados para o PCR propiciaram o aparecimento de apenas uma banda de 249 pb, sendo específicos para o gene de a-amilase, uma vez que o cDNA foi obtido a partir do RNA total (Figuras 1 e 2). O produto do RT-PCR observado nas duas cultivares foi uma banda de 249 pb bem definida e sem a presença de bandas inespecíficas (Figura 2).

Pode-se concluir, portanto, que o RT-PCR é uma eficiente metodologia para a identificação da expressão de a-amilase durante a germinação das sementes.

Aceito para publicação em 23/09/2002.

• BEWLEY, J.D.; BLACK, M. Seeds: physiology of development and germination. NewYork: Plenum Press, 1985. 367p.
• CARLSON, S.J.; CHOUREY, P.S. Molecular analysis of maize miniature1 seed mutantsa progress report. In: MAIZE GENETICS CONFERENCE. Abstracts... Disponível em: <www.agron.missouri.edu/cgi-bin/sybgwmdb/mdb3/Reference/1460041998.> Acesso em: dia mês abreviado e ano. exemplo: 1 out. 2002)
• CARVALHO, M.L.M.; VIEIRA, M.G.G.C.; VON PINHO, E.R. Aplicação de técnicas moleculares no controle de qualidade de sementes. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, v.3, n.17, p.44-47, 2000. Disponível em <www.biotecnologia.com.br/bio/bio17/6.htm,2000.> Acesso: dia mês abreviado e ano.
• CARVALHO, N.M.; NAKAGAWA, J. Sementes, ciência, tecnologia e produção. Jaboticabal: FUNEP, 2000.
• CHOMCZYNSKI, P.; SACCHI, N. Single-step method of RNA isolation by acidguanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analitical Biochemistry, London, v.162, n.1, p.156-159, 1987.
• FINCHER, G.B. Molecular and cellular biology associated with endosperm mobilization in germinating cereal grains. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, v. 40, n.1, p.305-346, 1989.
• LI, Z. Do members of the ltk gene family transduce signals for endosperm development? In: MAIZE GENETICS CONFERENCE. Abstracts.. Disponível em: <www.agron.missouri.edu/cgi-bin/sybgwmdb/mdb3/Reference/2228631998> Acesso em: dia mês (abreviado) 2002.
• MAYER, A.M.; POLJAKOFF-MAYBER, A. The germination of plants. 4ed. Oxford: Pergamon Press 1978. 270p.
• MUNDY, J.; BRANDT, A.; FINCHER, G.B. Messenger RNAs from the scutellum and aleurone of germinating barley encode (1-3, 1-4)-b-D-glucanase, a-amylase anda carboxipeptidase. Plant Physiology, Rockville, v.79, n.4, p.867-871, 1985.
• SACHS, M.M.; SUBAIAH, C.C.; SAAB, I.N. Anaerobic gene expression and flooding tolerance in maize Journal of Experimental Botany, v.47, n.294, p.1-15, 1996.
• SANWO, M.M.; DEMASON, D.A. Characteristics of a-amylase during germination of two high-sugar sweet corn cultivars of Zea mays L. Plant Physiology, v.99, n.7, p.1184-92, 1993.
• SANWO, M.M.; DEMASON, D.A. Gibberellic acid (GA₃)-induced enhancement of a-amylase activity in the aleurone of shrunken-2 maize kernels. American Journal of Botany, v.81, n.8, p.987-96, 1994.
• YOUNG, T.E.; DEMASON, D.A.; CLOSE, T.J. Cloning of an a-amylase cDNA from aleurone tissue of germinating maize seed. Plant Physiology, Rockville, v.105, n.2, p.759-760, 1994.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  26 Maio 2011
• Data do Fascículo
  2002

Histórico

• Aceito
  23 Set 2002
• Recebido
  23 Set 2002