Relación entre el gen Rps 1k y la resistencia a Pythium ultimum y P. irregulare en soja

Relationship between Rps 1k gene and resistance to Pythium ultimum and P. irregulare in soybean

Relação entre gene e resistência Rps 1k com resistência a Pythium ultimum e P. irregulare em soja

RESUMEN

En el cultivo de soja Pythium spp. produce la pudrición de semillas y raíces, y “damping off”. El objetivo del presente trabajo fue verificar la relación entre el gen Rps 1k de resistencia a Phytophthora sojae y P. ultimum y P. irregulare. Cuatro genotipos de soja, dos con el gen Rps 1k (SE+1y SE+2) y dos sin el gen (SE-1 y SE-2) se sembraron en suelo inoculado y sin inocular. Los genotipos SE-1 y SE-2 no difirieron entre sí, ya sea que estuviesen inoculados o no, ni tampoco difirieron del SE+2. En cambio, los genotipos con el gen Rps1k difirieron entre sí, tanto los que estuvieron inoculados como los no inoculados. SE+2 presentó un 95% de emergencia mientras que SE+1 presentó un 78.35% de emergencia pero en ambos casos la emergencia disminuyó cuando se inoculó, con 63.35% y 34.15% respectivamente. Bajo las condiciones del presente ensayo las variedades utilizadas conteniendo el gen Rps 1k a Ph. sojae no presentaron mayor número de plántulas emergidas frente a las cepas probadas de P. ultimum ni de P. irregulare.

Palabras claves
Oomycetes; Damping off; Glycine max; Phytophthora sojae

ABSTRACT

In soybean Pythium spp. produces seed and root rot and “damping off”. The aim of this study was to verify the relationship between resistant gene Rps 1k to Phytophthora sojae with Pythium ultimum and P. irregulare. Four genotypes of soybean were sown on inoculated soil, two of them with gene Rps 1k and the other two without it. Genotypes without the gene did not differ among themselves, no matter whether they were inoculated or not. On the other hand, Rps1k genotypes differed from each other, whether or not they were inoculated. SE+2 presented 95% of emergence whereas SE+1 presented 78.35% of emergence, but in both cases the emergence decreased when genotypes were inoculated with 63.35% and 34.15% respectively. Under the assayed conditions the gene Rps1k resistant to Ph. sojae did not show a greater number of emerged seedlings against the tested strains of P. ultimum or P. irregulare.

Keywords
Oomycetes; Damping off; Glycine max; Phytophthora sojae

RESUMO

Em soja Pythium spp. causa apodrecimento de sementes, da raiz e “tombamento”. O objetivo deste estudo foi verificar a relação do gene de resistência Rps 1k de Phytophthora sojae com Pythium ultimum e P. irregulare. Quatro genótipos de soja foram semeados em solo inoculado ou não com Pythium spp, dois deles com o gene Rps 1k (SE+1 e SE+2) e os outros dois sem ele (SE-1 e SE-2). Os genótipos SE-1 e SE-2 não diferiram entre si, não importa se eles foram inoculados ou não, nem eram diferentes de SE + 2. Por outro lado, genótipos com Rps 1k diferiam uns dos outros, sendo inoculados ou não. SE + 2 apresenta uma emergência de 95% enquanto que a SE + 1 tinha 78.35% de emergência, mas em ambos os casos a emergência diminuiu quando foram inoculados, com 63.35% e 34.15% respectivamente. Nas condições analisadas o gene Rps 1k de resistência a Ph. sojae não mostrou aumento do número de plântulas emergidas testados contra as espécies de P. ultimum ou P. irregulare.

Palavras-chave
Oomycete; Damping off; Glycine max; Phytophthora sojae

Mundialmente se considera que las enfermedades de la soja [Glycine max (L.) Merr.] son las responsables del 10% al 15% de las pérdidas ocasionadas en la producción de esta oleaginosa (³²). Las principales enfermedades de la raíz y de la base del tallo son producidas por un complejo de microorganismos del suelo. Dentro de este complejo se encuentran distintas especies de Pythium que causan la pudrición de semillas y de raíces, y el “damping off” de pre y postemergencia. El desarrollo de estas enfermedades se ve favorecido por un deficiente drenaje y la consecuente baja aireación del suelo, que permite la dispersión de las zoosporas (¹⁵).

Hasta el presente se han identificado 160 especies de Pythium (³) al menos 17 de estas especies son patógenas de soja (²⁵). En Argentina las especies determinadas asociadas a plántulas de soja son: P. irregulare Buisman, P. ultimum Trow, P. sylvaticum Campbell & Hendrix, P. inflatum Matthews, P. debaryanum Hesse, P. rostratum Butler, P. catenulatum Matthews y Phytopythium helicoides Drechsler (¹⁴, ²¹).

Generalmente el control de la enfermedad se efectúa con el tratamiento de curasemillas específicos para oomycetes. Según Grijalba y Ridao (¹³) el control químico de la podredumbre por Pythium en plántulas de soja fue eficaz con la aplicación del fungicida metalaxil, de manera preventiva, con respecto a otros fungicidas probados. Sin embargo, se han reportado cepas resistentes a metalaxil en varios países (²², ²⁶, ³⁰, ³¹) por lo que es necesario implementar otras técnicas de manejo para esta enfermedad, tanto químicas como biológicas, que provean un control adecuado.

Rosso et al. (²) encontraron que cultivares de soja con el gen de resistencia a Phythophthora sojae Kaufmann & Gerdemann Rps 1k tenían significativamente menor decoloración de raíces e incidencia de Pythium en parcelas de campo que aquélos que no tenían el gen. Posteriormente se determinó que el gen de resistencia a P. aphanidermatum Edson Fitzp. denominado RPA1 estaba cerca pero no contenía al gen Rps 1k (²³) y posiblemente podría conferir resistencia a diferentes especies de Pythium patógenas de soja (²⁵).

El objetivo del presente trabajo fue verificar la relación del gen Rps 1k con las especies de Pythium prevalentes en la provincia de Buenos Aires.

MATERIALES Y METODOS

Obtención de los aislados.

Los aislados fueron colectados a partir de campos de las localidades de Pergamino y Balcarce (provincia de Buenos Aires, Argentina) durante los años 2009 a 2011. Se utilizó la técnica de trampa con plántulas de soja, aislando Pythium spp. a partir de suelo plantado principalmente con soya durante varios años. Raíces con necrosis o con podredumbre se lavaron para remover partículas de suelo y se desinfectaron superficialmente con hipoclorito de sodio (al 1,5% de Cl activo) durante 30 segundos. Luego se lavaron con agua destilada estéril y se secaron con servilletas de papel, sembrándolas en medio PARP-APG (¹⁷). Se empleó la técnica de la burbuja o del agar invertido para evitar el desarrollo de bacterias (²⁷). Después de 24- 48 h los aislados se transfirieron a nuevas placas de Petri con APG. Los aislados de Pythium spp. se identificaron mediante técnicas morfológicas. En caso de dudas se utilizaron técnicas moleculares (no descriptas en este trabajo) para su confirmación. Así mismo se evaluó su patogenicidad tanto in-vitro como in-vivo con ensayos de plántulas.

Selección de aislados para ensayos:

Para inducir la formación de estructuras reproductivas de los aislados obtenidos, se colocaron 3 o 4 secciones de agar con micelio de aprox. 0.5 cm de diámetro y 7 días de crecimiento. Luego fueron colocados en cajas de Petri conteniendo agua destilada estéril con el agregado de 15 a 20 trocitos de hojas de Agrostis sp. de 0.5 a 1 cm de longitud previamente hervidos durante 10-15 minutos. Posteriormente, a la 48-72 h, los segmentos de césped colonizado se observaron en microscopio óptico (²). La identificación y caracterización se efectuó teniendo en cuenta la morfología de las colonias en APG y V8, las estructuras vegetativas y reproductivas sexuales y asexuales (⁶, ¹⁰, ¹¹, ²⁹).

Ensayo de patogenicidad:

Se probó la patogenicidad de los aislados tanto in vitro como in vivo según la metodología de Dorrance et al. (⁸). A) in vitro: Se sembró cada uno de los aislados en el centro de cajas de Petri de 9 cm de diámetro. Cuando las colonias estuvieron por completar las cajas (2-3 días aproximadamente) se colocaron en cada una 10 semillas de soja previamente desinfectadas con hipoclorito de sodio (al 1,5% de Cl activo) durante 30 segundos. A siete días de la siembra se contaron las semillas y/o plántulas muertas. B) in vivo: En macetas plásticas de 12 cm de diámetro se colocó sustrato comercial (previamente tindalizado dos veces con vapor de agua durante una hora y regado hasta saturación) hasta su mitad. Se colocó el contenido de una caja de petri de 9 cm de cada aislado desarrollado en APD durante 4 días a 22 °C, se tapó con un cm de espesor de sustrato tindalizado, sobre el que se sembraron 20 semillas de soja que fueron tapadas también con un centímetro de espesor de sustrato tindalizado. Las macetas inoculadas se mantuvieron durante 15 días a 20-22 °C hasta que se efectúo el recuento de plántulas emergidas.

Genotipos/Semilla con y sin gen Rps 1k

Un semillero local proveyó cuatro genotipos de soja de similar pedigree, dos con el gen Rps 1k, de resistencia a Ph. sojae (identificados como SE+1y SE+2), y dos sin el gen (identificados como SE-1 y SE-2). Para corroborar la presencia o no del gen estudiado, los genotipos se inocularon mediante la técnica del hipocótile con los aislados de Ph. sojae F13-1 (Fórmula de virulencia Rps 1a-1c-1k-3a-7) y F13-3 (Fórmula de virulencia Rps 1c-3a-7) obtenidos durante 2013 a partir de plantas con síntomas de la localidad de Fontezuela (provincia de Buenos Aires), los mismos se chequearon con un set de ocho genotipos diferenciales. Se sembraron 10 a 12 semillas de cada genotipo por maceta de 10 cm de diámetro. Se utilizó sustrato comercial. La inoculación se realizó en estado vegetativo VC (⁹). Se usaron cultivos de 10 a 12 días crecidos en medio AV8 semi-sólido (1.2% de agar). La inoculación se efectuó por el método de herida al hipocótile sobre la que se colocó 0.1 ml de inóculo. Posteriormente, las plantas se mantuvieron a 100% de humedad relativa durante 24 horas a 20-25ºC. Los genotipos se consideraron susceptibles cuando a los cinco días posteriores a la inoculación se produjo la muerte del 70% o más de las plantas, y resistentes. En el mismo momento de observación se detectó el 70% o más de plantas vivas, la reacción se consideró intermedia entre ambos valores. Cada genotipo se repitió dos veces y en los casos de dudas se inoculó una maceta más.

Inoculación de suelo:

La inoculación se efectuó mediante la infestación de suelo con cinco aislados de P. ultimum y cinco de P. irregulare (todos de patogenicidad probada) obtenidos a partir de cultivos comerciales de los partidos de Pergamino y Balcarce durante los años 2009 a 2011.

El micelio de los aislados (aprox. 40 g de agar colonizado) se colocó en suelo previamente tindalizado y colocado en bandejas plásticas (10 x 20 x 5 cm) en las que se sembraron 20 semillas de cada variedad. Los tratamientos fueron asignados a las unidades experimentales (bandejas) de acuerdo a un diseño completamente aleatorizado con 6 repeticiones por tratamiento. Se evaluó el porcentaje de emergencia a los 21 días desde la siembra. Los resultados obtenidos se analizaron mediante un análisis de varianza para un modelo con dos factores y posterior prueba de comparaciones múltiples DGC (⁷). En todos los casos se empleó un nivel de significancia del 5%. Se verificaron los supuestos del modelo mediante pruebas de Shapiro Wilks y Levene. Se empleó InfoStat (¹⁶) como software. El ensayo se repitió dos veces.

Tabla 1
Emergencia de plántulas a los 21 días desde la siembra de genotipos sin inoculo e inoculados con Pythium spp.

Genotipos		Inoculado		Emergencia			% de Emergencia
SE+2		No Inoc		19.00 A			95.00%
SE-1		No Inoc		18.00 A			90.00%
SE-2		No Inoc		18.00 A			90.00%
SE+1		No Inoc		15.67 B			78.35%
SE-1		Inoc		15.33 B			76.65%
SE-2		Inoc		15.00 B			75.00%
SE+2		Inoc		12.67	C		63.35%
SE+1		Inoc		6.83	D		34.15%

• Emergencia: Número promedio de plántulas emergidas (de un total de 20 semillas sembradas).
  Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p<= 0.05)

RESULTADOS Y DISCUSION

Obtención y selección de aislados para ensayos:

De los 114 aislados obtenidos se seleccionaron 10 de las especies de mayor prevalencia, cinco aislados de P. irregulare y cinco de P. ultimum, que además presentaron una patogenicidad del 100% in vitro y de 80% o más in vivo. Entre los aislados obtenidos ninguno perteneció a la especie P. aphanidermatum. En el género Pythium existen especies muy patógenas como P. aphanidermatum o P. graminicola (², ¹⁸). En Argentina P. aphanidermatum fue determinado en cultivos intensivos en invernáculos de Garín y La Plata (Provincia de Buenos Aires) (¹², ¹⁹) aunque hasta el momento no ha sido reportado en el cultivo de soja. Los ensayos para la determinación del gen de resistencia RPA1 (²³) se efectuaron con P. aphanidermatum que infecta a temperaturas de 30 °C o mayores (²⁸). Mientras que P. irregulare y P. ultimum atacan a la soja a temperaturas de 20 °C o menos (²⁰). Además la técnica utilizada para la determinación del gen RPA1 fue la inoculación del hipocótile (²⁷), la que deja de lado resistencias de campo o generales (¹), entre ellas la resistencia a la penetración por parte de las zoosporas y/o del micelio infectivo.

Genotipos/Semilla con y sin gen Rps 1k

Cinco días después de la inoculación, los genotipos SE+1y SE+2 presentaron reacción de compatibilidad tanto con el aislado F13-1 como con el aislado F13-3. Por su parte los genotipos SE-1y SE-2 presentaron reacción de compatibilidad con el aislado F13-1, pero no así con el F13-3.

Se ha observado cierta diferencia varietal en soja con suelos inundados (²⁵) lo que puede tener una relación directa ya que Pythium es un oomycete que requiere agua para el ataque de las zoosporas. Entre las variedades sobresalió el cultivar Archer que se liberó al mercado en 1990 con resistencia a Ph. sojae Rps 6 y Rps1k (⁵), especulándose que la resistencia a Pythium se debía al gen de resistencia Rps1k (²⁵). Pero en el presente ensayo no se detectaron diferencias significativas entre las medias de los genotipos sin el gen, ya sea que estuviesen inoculados o no, ni tampoco difirieron del SE+2. En cambio, los genotipos con el gen Rps1k difirieron entre sí, tanto los que estuvieron inoculados como los no inoculados. SE+2 presentó 19 plántulas promedio emergidas (95% de emergencia) mientras que SE+1 presentó 15.67 plántulas promedio emergidas (76.35% de emergencia) pero en ambos casos la emergencia disminuyó cuando se inoculó, con 12.67 y 6.83 plántulas promedio emergidas (63.35% y 34.15% de emergencia) respectivamente. Existen citas de resistencia genética a Pythium en este sentido, la resistencia a P. inflatum en maíz esta controlada por un gen dominante (Rpi1), la resistencia a P. ultimum en poroto esta controlada por un gen dominante, mientras que la resistencia a P. ultimum var. ultimum en poroto también esta controlada por un gen dominante (²⁵). Es necesario continuar con estos ensayos para encontrar genes de resistencia específicos o poder implementar otras técnicas de manejo para esta enfermedad.

Se concluye que con las condiciones del presente ensayo las variedades utilizadas que contienen el gen Rps 1k a Ph. sojae no presentaron mayor número de plántulas emergidas frente a las cepas probadas de P. ultimum ni de P. irregulare.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al semillero Don Mario por la provisión de los genotipos de soja y a la alumna Carolina Cardoso de Jesús por su apoyo como tesista de grado.

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Fechas de Publicación

• Publicación en esta colección
  Apr-Jun 2017

Histórico

• Recibido
  08 Oct 2015
• Acepto
  19 Ene 2016