Controle biológico da podridão de raiz causada por Pythium aphanidermatum e promoção de crescimento de alface hidropônica com Clonostachys rosea

Biological control of Pythium aphanidermatum root rot and growth promotion of hydroponic lettuce by Clonostachys rosea

Resumos

Clonostachys rosea foi avaliado como promotor de crescimento e no controle da podridão de raiz (Pythium aphanidermatum) em sistemas de fluxo laminar de nutrientes (NFT) e "floating". Na promoção de crescimento, Clonostachys (0, 10³, 10(4), 10(5), 10(6) e 10(7) conídios/mL) foi introduzido na solução nutritiva (SN) e avaliada a massa das plantas. O biocontrole, em sistema NFT, foi avaliado introduzindo Clonostachys na SN (10(6) conídios/mL) i. um dia após o transplantio na ausência do patógeno; ii. três dias antes e no momento da infestação com Pythium e, iii. três dias antes, no momento e três dias após infestação com Pythium. Em sistema "floating", Clonostachys foi introduzido na SN (10(6) conídios/mL) i. quatro dias antes e no momento da infestação com Pythium, e ii. quatro dias antes, no momento e quatro dias após a infestação com Pythium. Nesses experimentos foram determinadas as massas das plantas, e a recuperação do patógeno e antagonista. O antagonista não promoveu o crescimento das plantas, entretanto protegeu-as do subdesenvolvimento causado pelo patógeno no sistema NFT. Não foi observada proteção em sistema "floating". Clonostachys reduziu a incidência do patógeno nas raízes no sistema NFT em 28,6% e 42,8%, quando aplicado duas e três vezes, respectivamente.

Lactuca sativa; biocontrole; antagonismo; hidroponia

Clonostachys rosea was evaluated for growth promotion and control of root rot (Pythium aphanidermatum) in hydroponic lettuce in NFT and floating systems. For growth promotion, Clonostachys (0, 10³, 10(4), 10(5), 10(6) and 10(7) conidia/mL) was added in nutrient solution (NS) and the mass of the plants was measured. To evaluate the control of the disease in NFT, Clonostachys was applied to the NS (10(6) conidia/mL) i. one day after transplanting in the absence of Pythium; ii. three days before and simultaneously with Pythium infestation; and, iii. three days before, simultaneously and three days after Pythium infestation. To evaluate the control of root rot in floating system, Clonostachys was added in NS (10(6) conidia/mL) i. four days before, and at the moment of pathogen infestation, and, ii. four days before, simultaneously, and four days after pathogen infestation. Plant mass and the recovery of pathogen and antagonist from the roots were evaluated. Clonostachys did not improve plant growth in the absence of Pythium. In the NFT system Clonostachys protected the plants from yield losses caused by Pythium, but not in the floating system. Pythium recovery from the roots was reduced by 28,6% and 42,8% when Clonostachys was applied two or three times, respectively.

Lactuca sativa; biocontrol; antagonist; hydroponic systems

COMUNICAÇÃO SHORT COMMUNICATION

Controle biológico da podridão de raiz causada por Pythium aphanidermatum e promoção de crescimento de alface hidropônica com Clonostachys rosea

Biological control of Pythium aphanidermatum root rot and growth promotion of hydroponic lettuce by Clonostachys rosea

Élida B. Corrêa^I; Wagner Bettiol^II; Marcelo A.B. Morandi^II

^IUniversidade Federal de Lavras, 37200-000, Lavras, MG

^IIEmbrapa Meio Ambiente, 13820-000, Jaguariúna, SP, Brasil

RESUMO

Clonostachys rosea foi avaliado como promotor de crescimento e no controle da podridão de raiz (Pythium aphanidermatum) em sistemas de fluxo laminar de nutrientes (NFT) e "floating". Na promoção de crescimento, Clonostachys (0, 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶ e 10⁷ conídios/mL) foi introduzido na solução nutritiva (SN) e avaliada a massa das plantas. O biocontrole, em sistema NFT, foi avaliado introduzindo Clonostachys na SN (10⁶ conídios/mL) i. um dia após o transplantio na ausência do patógeno; ii. três dias antes e no momento da infestação com Pythium e, iii. três dias antes, no momento e três dias após infestação com Pythium. Em sistema "floating", Clonostachys foi introduzido na SN (10⁶ conídios/mL) i. quatro dias antes e no momento da infestação com Pythium, e ii. quatro dias antes, no momento e quatro dias após a infestação com Pythium. Nesses experimentos foram determinadas as massas das plantas, e a recuperação do patógeno e antagonista. O antagonista não promoveu o crescimento das plantas, entretanto protegeu-as do subdesenvolvimento causado pelo patógeno no sistema NFT. Não foi observada proteção em sistema "floating". Clonostachys reduziu a incidência do patógeno nas raízes no sistema NFT em 28,6% e 42,8%, quando aplicado duas e três vezes, respectivamente.

Palavras-chave:Lactuca sativa, biocontrole, antagonismo, hidroponia.

ABSTRACT

Clonostachys rosea was evaluated for growth promotion and control of root rot (Pythium aphanidermatum) in hydroponic lettuce in NFT and floating systems. For growth promotion, Clonostachys (0, 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶ and 10⁷ conidia/mL) was added in nutrient solution (NS) and the mass of the plants was measured. To evaluate the control of the disease in NFT, Clonostachys was applied to the NS (10⁶ conidia/mL) i. one day after transplanting in the absence of Pythium; ii. three days before and simultaneously with Pythium infestation; and, iii. three days before, simultaneously and three days after Pythium infestation. To evaluate the control of root rot in floating system, Clonostachys was added in NS (10⁶ conidia/mL) i. four days before, and at the moment of pathogen infestation, and, ii. four days before, simultaneously, and four days after pathogen infestation. Plant mass and the recovery of pathogen and antagonist from the roots were evaluated. Clonostachys did not improve plant growth in the absence of Pythium. In the NFT system Clonostachys protected the plants from yield losses caused by Pythium, but not in the floating system. Pythium recovery from the roots was reduced by 28,6% and 42,8% when Clonostachys was applied two or three times, respectively.

Key words:Lactuca sativa, biocontrol, antagonist, hydroponic systems.

A alface é a hortaliça folhosa mais consumida no Brasil e destaca-se como a mais cultivada em sistemas hidropônicos. A principal técnica de cultivo hidropônico utilizado no Brasil é a de fluxo laminar de nutrientes, denominada NFT ("Nutrient Film Technique"). Apesar de oferecer vantagens como a antecipação do ciclo da cultura, o cultivo hidropônico exige cuidados especiais quanto à sanidade das plantas. A elevada densidade e uniformidade genética de plantas, a baixa diversidade biológica e a circulação da solução nutritiva no sistema favorecem a dispersão de patógenos e o desenvolvimento de epidemias (Sutton et al., 2006).

Dentre os mais importantes e destrutivos patógenos das culturas em sistemas hidropônicos destacam-se espécies do gênero Pythium (Utkhede et al., 2000). Pythium ultimum Trow e Pythium aphanidermatum (Edson) Fitzp. são espécies comumente associadas à podridão de raiz na cultura da alface hidropônica. A principal medida de controle da doença é a preventiva, por meio da utilização de mudas sadias, água de boa qualidade e uso de materiais e ferramentas não contaminadas (Sutton et al., 2006). Após a entrada de Pythium no sistema hidropônico podem ser adotadas medidas culturais para a sua desinfestação, como a limpeza por meio de soluções de cloro, radiação ultravioleta, filtração e elevação da temperatura da solução (Sutton et al., 2006). No entanto, medidas de desinfestação da solução nutritiva têm se mostrado pouco efetivas, pois não afetam a população do patógeno presente na zona de infecção das raízes (Khan et al., 2003; Sutton et al., 2006). O controle químico não é recomendado, pois não há fungicidas registrados para o patógeno nessa cultura no Brasil, além de, potencialmente, causarem fitotoxidez em alface cultivada em hidroponia (Utkhede et al., 2000). Em face dessas limitações, torna-se necessária a busca por alternativas para o controle da doença, sendo que a efetividade do biocontrole foi demonstrada em vários sistemas (Utkhede et al., 2000; Liu & Sutton, 2002; Khan et al., 2003). O isolado PG-710 de Clonostachys rosea (Link) Schroers, Samuels, Seifert e W. Gams protegeu as plantas de pepino contra a infecção por Pythium spp. e promoveu o crescimento, quando na presença do patógeno (Liu & Sutton, 2002). A introdução do isolado 88-710 de C. rosea na solução nutritiva promoveu o desenvolvimento da área foliar e do sistema radicular de plantas de pepino (Sutton et al., 2008). O objetivo deste trabalho foi estudar a capacidade do isolado Cr61 de C. rosea, obtido de restos culturais de roseira e pertencente à coleção da Embrapa Meio Ambiente, em promover o crescimento e controlar a podridão de raiz causada por P. aphanidermatum em alface hidropônica.

Nos estudos com promoção de crescimento, sementes de alface cv. Vera (Sakata Seed Sudamérica) foram semeadas em espuma fenólica, e, após 17 dias, foram transferidas para berçário no sistema NFT, com condutividade elétrica (CE) da solução nutritiva (Qualifértil) mantida a 0,7 mS/cm. Mudas com 30 dias de idade foram transferidas para um sistema definitivo (NFT) formado por duas mesas (1,22 m de altura, 1,5 m de largura e 15% de declividade) sendo cada mesa composta por seis canaletas (5,9 m de comprimento com 23 furos de 5 cm de diâmetro), alimentadas individualmente por solução nutritiva (CE=1,5 mS/cm) por meio de bomba submersa com capacidade para 540 L/h (Sarlo Better, modelo B500) em tanques reservatórios de 50 L. O pH e a CE da solução nutritiva foram monitorados a cada quatro dias. O isolado de C. rosea (Cr61) foi multiplicado no substrato arroz em casca. Suspensões de conídios foram aplicadas nos tanques de solução nutritiva, 24 h após a transferência das plantas para o sistema definitivo, para atingir as concentrações finais de 10⁷, 10⁶, 10⁵, 10⁴ e 10³ e 0 conídios/mL. Após 21 dias de desenvolvimento foram realizadas avaliações da massa fresca e seca das plantas. A população de C. rosea na solução nutritiva foi determinada no 4º e 19º dia após a sua introdução. Portanto, amostras retiradas dos tanques e diluídas em série foram transferidas para o meio BGTEA (200 g de batata, 15 g de D-glucose, 12 g de Ágar, 1000 mL de água destilada e 2 mL de Triton XR 100 + 100 mg de sulfato de estreptomicina adicionados após autoclavagem) contido em placas de Petri e incubadas por 72 h a 25 ± 2ºC, sob luz constante, quando foi determinado o número de colônias. O experimento foi montado em duas bancadas com seis linhas de cultivo cada (blocos), sendo cada linha composta por 20 plantas (unidades amostrais).

O controle biológico da podridão de raiz com C. rosea (Cr61) foi avaliado duas vezes, sendo uma no sistema NFT e outra no sistema "floating". Para a produção do inóculo de P. aphanidermatum (isolado SP 1973, do Instituto de Botânica de São Paulo), discos contendo a cultura do patógeno foram transferidos para placas de Petri contendo 20 mL do meio de cultura V8 (100 mL de suco V8, 2 g de CaCO₃ e 16 g de Ágar em 900 mL de água destilada), com incubação por cinco dias a 25 ± 2ºC, sob regime de luz contínua. A infestação do sistema NFT com o patógeno foi realizada por meio da introdução, nos tanques com 80 L de solução nutritiva, de um sache de tela de náilon com cinco placas de meio de cultura V8 com o patógeno em pleno desenvolvimento, sendo retirado após três dias. Os seguintes tratamentos foram estudados: i. C. rosea aplicado 24 h após transferência das mudas e sem a infestação com o patógeno; ii. C. rosea aplicado três dias antes e no momento da infestação com o patógeno; iii. C. rosea três dias antes, no momento e três dias após a infestação com o patógeno; iv. testemunha sem inoculação e v. testemunha inoculada. Em todos os tratamentos com C. rosea foi utilizada a concentração de 10⁶ conídios/mL de solução nutritiva obtida conforme descrito anteriormente. Mudas de alface com 24 dias, produzidas conforme descrito anteriormente, foram transferidas para o sistema definitivo. Após 21 dias, foi avaliada a massa das plantas, bem como a recuperação de P. aphanidermatum e C. rosea das raízes. A recuperação do patógeno foi realizada transferindo 10 fragmentos de, aproximadamente, 1 cm de comprimento das raízes para meio de cultura Ágar-Água acrescido de ampicilina (250 mg/L) e rifampicina (10 mg/L). A incidência do patógeno na raiz foi determinada após quatro dias de incubação a 25 ± 2ºC, sob regime de luz constante. A mesma metodologia para a recuperação de C. rosea das raízes, descrita anteriormente, foi utilizada, porém em meio PCA (200 mg de cloranfenicol; 0,1 mL de paraquat e 16 g de Ágar, em 1000 mL de água). A temperatura da solução nutritiva foi monitorada diariamente no período da manhã e da tarde, por meio de um termômetro Chektemp^®. O pH e a CE da solução nutritiva foram determinados a cada quatro dias. O experimento foi montado em duas bancadas com cinco linhas de cultivo cada (blocos), sendo cada linha composta por 12 plantas (unidades amostrais).

A mesma cultivar de alface e os mesmos isolados de P. aphanidermatum e de C. rosea foram utilizados no ensaio da avaliação do controle da doença em sistema "floating". Mudas de alface com 22 dias, produzidas em espuma fenólica, foram transferidas para bandejas de isopor contidas em caixas com 30 L de solução nutritiva (CE=1,5 mS/cm), sendo essas oxigenadas por meio de mangueiras ligadas a um compressor. A infestação com o patógeno foi realizada após oito dias da transferência das plantas para as caixas contendo solução nutritiva, conforme descrito no ensaio em NFT. C. rosea foi aplicado à solução nutritiva (10⁶ conídios/mL) quatro dias antes e no momento da infestação com o patógeno; e quatro dias antes, no momento e quatro dias após a infestação com o patógeno. Os tratamentos foram comparados com a testemunha com e sem infestação com P. aphanidermatum. As plantas permaneceram por 26 dias no sistema "floating", quando foram realizadas as avaliações descritas anteriormente. A recuperação do patógeno e o monitoramento da temperatura, da CE e do pH da solução nutritiva foram realizados conforme descritos anteriormente. O experimento foi montado em duas bancadas (blocos), contendo as caixas preenchidas com solução nutritiva e com as bandejas de isopor, sendo que, as bandejas foram compostas por 10 plantas (unidades amostrais). Para a análise dos resultados foi utilizado o pacote estatístico SAS^® (SAS Institute Inc., Cary, NC). Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA), sendo cada planta avaliada como uma sub-amostra dentro das parcelas em delineamento em blocos casualizados; e os tratamentos comparados pelo teste de Tukey.

Clonostachys rosea, nas concentrações de 10³ a 10⁷ conídios/mL, não promoveu o crescimento de alface cultivada em hidroponia quando aplicado 24 h após as plantas serem transferidas para o sistema definitivo. Apesar de não promover o crescimento da alface, C. rosea não causou efeito negativo no desenvolvimento das plantas, como o observado por Corrêa & Bettiol (2006), com a adição de Trichoderma harzianum (10⁷ conídios/mL) na solução nutritiva. Vários fatores afetam a capacidade de promoção de crescimento de plantas por microrganismos, como o tipo do inóculo, a temperatura, o pH, a umidade, a composição da microbiota e a disponibilidade de nutrientes (Jjemba & Alexander, 1999). Assim, há necessidade de se estudar as melhores condições para a introdução de C. rosea com essa finalidade.

A população de C. rosea, após quatro dias de sua introdução nos tanques de solução nutritiva, foi de 0; 11; 10; 51 e 265 ufc/mL para os tratamentos nas concentrações de 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶ e 10⁷ conídios/mL, respectivamente, sendo que não houve recuperação 19 dias após a sua introdução na solução nutritiva. A redução da população de C. rosea na solução pode ser explicada pela não adaptação do fungo a essas condições, acrescida pela falta de compostos orgânicos disponíveis neste ambiente para o seu crescimento. C. rosea é um fungo cosmopolita, podendo ser encontrado em diferentes ecossistemas em regiões tropicais, temperadas, subárticas e desérticas, sendo isolado em solos cultivados, pastos, matas, florestas, em água doce e em solos costeiros. (Sutton et al., 1997). A baixa sobrevivência do isolado Cr61 de C. rosea no ambiente hidropônico pode ser explicada pela maior capacidade de sobrevivência do isolado em ambientes terrestres do que em ambientes aquáticos, visto que o fungo foi isolado de restos culturais de roseira cultivada no solo. De acordo com Sutton et al. (2006), existe uma baixa disponibilidade de compostos orgânicos no ínicio do desenvolvimento das plantas no sistema hidropônico. Entretanto, exsudados são liberados pelas raízes para a solução possibilitando o desenvolvimento de microrganismos (Postma et al., 2008), com o desenvolvimento das plantas. Dessa forma, sugere-se que ocorra a re-introdução de C. rosea no sistema após a solução atingir essas condições; e que se trabalhe com isolados melhor adaptados às condições do sistema hidropônico.

Espécies de Pythium podem infectar raízes de alface cultivadas em hidroponia sem causar sintomas típicos da doença, como a podridão de raiz e a murcha, mas provocar o subdesenvolvimento das plantas (Utkhede et al., 2000). A aplicação de C. rosea foi efetiva na proteção das plantas cultivadas em sistema NFT contra a infecção do patógeno, incrementando significativamente as massas em relação à testemunha inoculada, independentemente do período de aplicação (Tabela 1). Muitas vezes essa redução no desenvolvimento não é percebida pelos produtores durante o cultivo, que perdem parte do investimento quando da comercialização. Pythium foi recuperado em 77% das raízes das plantas da testemunha inoculada com o patógeno. A incidência do patógeno nas raízes diminuiu proporcionalmente com a adição do antagonista na solução nutritiva, sendo de 55% quando C. rosea foi aplicado duas vezes e de 44% quando aplicado três vezes. Resultados semelhantes foram obtidos por Khan et al. (2003) na diminuição da incidência de P. aphanidermatum nas raízes de pepino hidropônico com a aplicação de Pseudomonas chlororaphis, e na prevenção da diminuição de biomassa, altura e produtividade. Nesse experimento a temperatura da solução nutritiva variou de 20 a 35ºC, sendo favorável ao desenvolvimento da doença (Gold & Stanghellini, 1985; Sutton et al., 2006).

A recuperação de C. rosea ao final do experimento no sistema NFT foi de 100, 89 e 100% para as raízes dos tratamentos C. rosea, C. rosea (-3d e 0d) e C. rosea (-3d, 0d e +3d), respectivamente. A capacidade de colonização radicular é uma característica imprescindível de um agente de biocontrole de podridões radiculares (Howel, 2003). Os mecanismos de ação conhecidos de C. rosea são parasitismo, competição por nutrientes e por tecidos senescentes e indução de resistência (Sutton et al., 1997; Morandi et al., 2003). Considerando a efetiva presença de C. rosea nas raízes das plantas ao final do ensaio, a competição por espaço e nutrientes com o patógeno pode ter sido um dos mecanismos de sua ação no controle da podridão de raiz, sendo que a colonização das raízes senescentes por C. rosea pode ter desfavorecido a produção de inóculo secundário do patógeno.

No sistema "floating", após 18 dias da inoculação do patógeno, observou-se redução em 41% na massa da parte aérea das plantas (Tabela 2). Nenhum tratamento controlou o subdesenvolvimento causado pelo patógeno, sendo esse re-isolado em todos os tratamentos em que foi aplicado. A temperatura da solução nutritiva durante o ensaio variou de 24,8 a 41,1ºC, sendo essa condição um fator chave para o desenvolvimento da podridão de raiz causada por Pythium (Sutton et al., 2006). Severas epidemias causadas por P. aphanidermatum em hidroponia são relatadas quando predominam elevadas temperaturas na zona radicular (Gold & Stanghellini, 1985; Sutton et al., 2006). Além das elevadas temperaturas na solução nutritiva, sistemas utilizando lâminas de água estáticas como o "floating" favorecem o desenvolvimento da podridão de raiz quando comparados com sistemas NFT (Gold & Stanghellini, 1985). Isto pode ser explicado pela maior concentração dos zoósporos na zona de infecção, pois esses não são transportados pela solução nutritiva. A maior predisposição das plantas devido a elevadas temperaturas da solução nutritiva e o cultivo em sistema "floating" pode explicar a ausência do controle por C. rosea. A capacidade de C. rosea em prevenir os danos causados pela colonização de P. aphanidermatum nas raízes de plantas de alface cultivadas em sistema hidropônico NFT, suprimindo o subdesenvolvimento das plantas ocasionado pelo patógeno, independente de não ter promovido o seu crescimento, indica a possibilidade de uso do antagonista nesse sistema de produção.

AGRADECIMENTO

O autor Wagner Bettiol agradece ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq pela bolsa de produtividade em pesquisa.

Recebido 26 Agosto 2009

Aceito 14 Junho 2010

Autor para Correspondência: Wagner Bettiol, e-mail: [e-mail]

Parte da Dissertação da primeira autora. Universidade Federal de Lavras. Lavras MG. 2006.

TPP 9110

Editor de Seção: Marciel J. Stadnik

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  03 Nov 2010
• Data do Fascículo
  Ago 2010

Histórico

• Aceito
  14 Jun 2010
• Recebido
  26 Ago 2009