Contaminação versus manifestação endofítica: implicações no cultivo in vitro de plantas

Contamination versus endophytic manifestation: implications in plant in vitro culture

Resumo

A cultura de tecidos vegetais é imprescindível à propagação e multiplicação uniforme de plantas, à conservação de germoplasma, a programas de melhoramento e à transformação genética. Essa técnica tem exigido, cada vez mais, estudos que colaborem com o entendimento dos mecanismos envolvidos no crescimento dos microrganismos nos meios de cultivo, bem como as relações que eles estabelecem com a planta hospedeira. Dessa maneira, a presente revisão pretende esclarecer esses questionamentos e promover a distinção entre contaminação e manifestação endofítica que ocorrem no cultivo in vitro por diferentes causas. Tal distinção permite diminuir o pânico que se instala quando do seu aparecimento, além de auxiliar na adoção de medidas de prevenção e/ou controle desses eventos sem que haja descartes desnecessários de material de alto valor comercial e genético.

Palavras-chave:
cultura de tecidos; descarte desnecessário; endófitos; microrganismos

Abstract

Plant tissue culture is essential to the uniform propagation and multiplication of plants, to the germplasm conservation, to the genetic improvement programs and genetic transformation. This technique has been required more studies for the understanding of the mechanisms involved in microbial growth in culture media. As well as the relationships established with the host plant. Therefore, the present revision intends to clarify these questionings and to promote the distinction between contamination and endophytic manifestation which occur in vitro culture for different causes. This distinction allows to reduce the panic installed when the microorganisms appear, besides helping to adopt measures of prevention and /or control of these events avoiding unnecessary discards of material with high commercial and genetic value.

Key words:
plant tissue culture; unnecessary discard; endophytes; microorganisms

Introdução

A cultura de tecidos vegetais é uma ferramenta amplamente utilizada como alternativa à propagação de espécies, por essa razão estudos e pesquisas nessa área nunca se esgotam. No entanto, têm-se verificado uma tendência de trabalhos com enfoque nos microrganismos dentro do cultivo in vitro. Isso se deve ao fato de que os microrganismos podem representar perdas significativas na micropropagação e por esse motivo sua simples presença gera preocupação. Dessa maneira, inúmeros trabalhos atribuem a todo microrganismo, que cresce no meio de cultivo em qualquer momento do processo, o título de contaminação ou contaminante. Na sequência a esse surgimento o destino do material é, na grande maioria das vezes, o descarte, independentemente do tempo e dinheiro gastos, do valor genético e comercial do material. Porém, muitas pesquisas têm mostrado que nem todo microrganismo que aparece no frasco, oferece perigo ou riscos ao desenvolvimento da espécie a ser micropropagada (Almeida et al. 2005; Thomas et al. 2006, 2008; Esposito-Polesi 2011; Esposito-Polesi et al. 2015, 2017).

Essas pesquisas tem trazido à discussão a urgência em se estudar e entender como os microrganismos se distinguem. O que já se sabe, em linhas gerais, é que existe uma diferença entre os microrganismos que podem causar perdas e danos e aqueles que tem efeito neutro e em muitos casos até benéfico dentro do cultivo in vitro. Dessa maneira, a atribuição arbitrária de contaminação a todo microrganismo que cresce no meio de cultivo tem representado gastos e perdas desnecessárias.

A contaminação normalmente ocorre em razão do crescimento de microrganismos que não foram eliminados por completo, durante a desinfestação do material vegetal ou por falhas de assepsia de ferramentas, equipamentos, meios de cultivo, operador, etc. (Panicker et al. 2007; Thomas & Aswath 2013). Já o aparecimento de microrganismos em decorrência de outros mecanismos que não se relacionam a erros durante o processo de cultivo in vitro tem sido denominado de manifestação endofítica (Almeida et al. 2009; Abreu-Tarazi et al. 2010; Esposito-Polesi et al. 2015, 2017).

Sendo assim, a presente revisão objetiva esclarecer de que maneira as manifestações podem ocorrer, como evitá-las e combatê-las, bem como os mecanismos ecológicos que justificam e apoiam a distinção entre "contaminação" e "manifestação endofítica", fornecendo subsídios para o entendimento desses novos conceitos dentro da cultura de tecidos.

Cultivo in vitro de plantas

O cultivo in vitro de plantas é uma técnica de propagação assexuada que ocorre em condições assépticas e controladas, se baseia na totipotencialidade das células em gerar uma nova planta inteira e geneticamente idêntica à ancestral, a partir de um explante (célula ou qualquer fragmento de tecido ou órgão) (Torres et al. 2000; Palma et al. 2011; Xiao et al. 2011). A micropropagação se destaca como o método mais utilizado dentro do cultivo in vitro, principalmente para multiplicação de espécies de difícil propagação, limpeza clonal, conservação e intercâmbio de germoplasma, além de programas de melhoramento genético (Torres et al. 1998; Lima & Moraes 2006; Carvalho et al. 2007; Palma et al. 2011).

A microrpropagação permite, ainda, que um grande número de plantas, idênticas a planta matriz, seja obtido a partir de alguns explantes num curto período de tempo e dentro de uma pequena área (Davey & Anthony 2010; Brondani et al. 2012), produzindo mudas livres de doenças, independentemente da época e condições meteorológicas (Lima & Moraes 2006; Chandra et al. 2010; Xiao et al. 2011). Apresenta como vantagens o aumento da taxa de multiplicação de clones valiosos, ganhos genéticos rápidos e maiores rendimentos de plantações, devido ao aumento da produtividade (Aggarwal et al. 2012; Navroski et al. 2014).

Adicionalmente, esta técnica tem se despontado como uma ferramenta eficaz para reverter a maturação de material adulto utilizado como fonte de explante (como é o caso de espécies arbóreas), restituindo as características de juvenilidade do material, num processo conhecido como rejuvenescimento/revigoramento, refletindo, dentre outras coisas, no potencial de enraizamento, perdido com a maturidade da espécie (Grattapaglia & Machado 1998; Dutra et al. 2009; Wendling et al. 2014).

O processo de micropropagação (cultivo dos explantes em meio nutritivo e sob condições assépticas) inclui a seleção, desinfestação, multiplicação dos propágulos em sucessivos subcultivos e a indução de raízes adventícias das partes aéreas em meio de enraizamento com subsequente aclimatização em ambiente ex vitro (Murashige 1974; Dutra et al. 2009). Inúmeros são os fatores que influenciam o sucesso desse processo, tais como, tipo de explante, meio de cultivo, fonte e concentração de açúcares e reguladores de crescimento, taxa de multiplicação, altura das plantas, presença e intensidade de estiolamento, forma, coloração e tamanho das folhas, formação de calos, desenvolvimento de raízes, perdas por contaminação microbiana, oxidação e eficiência da aclimatização (Lima & Moraes 2006; Navroski et al. 2014). Uma desordem em qualquer um destes fatores pode culminar em alterações morfofisiológicas nocivas ao desenvolvimento da planta (Palma et al. 2011).

Neste contexto a contaminação microbiana se configura como um importante ponto de controle e cuidado, dentro da cultura de tecidos, sendo responsável por perdas consideráveis de material vegetal (Thomas et al. 2007, 2008; Thomas & Soly 2009; Thomas & Kumari 2010; Moreno-Vázquez et al. 2014; Thomas & Aswath 2014).

Contaminações microbianas

A contaminação microbiana pode ocorrer por diversos fatores, como por exemplo, o uso de explantes contaminados, ambientes laboratoriais limpos inadequadamente, técnicas de cultura de tecidos incorretas, ou ainda, uso de instrumentos contaminados durante a manipulação das culturas (Lata et al. 2006; Thomas et al. 2011; Thomas & Aswath 2014). Além disso, salienta-se que a intensidade de contaminação pode variar de acordo com o tipo e origem de explante, época do ano e do ambiente onde são coletados (Dutra et al. 2009).

Os contaminantes, em sua grande maioria, crescem imediatamente após a introdução das plantas in vitro. Os fungos filamentosos e leveduras, por exemplo, raramente permanecem latentes in vitro (Danby et al. 1994; Leifert et al. 1994). Já no caso de bactérias, segundo Leifert & Cassells (2001), o crescimento diferencial pode indicar falhas em diferentes pontos críticos de controle durante o estabelecimento. Sendo assim, considera-se que a presença de bactérias Gram negativas no ambiente in vitro geralmente ocorre quando a desinfestação inicial foi ineficiente e a presença de bactérias Gram positivas indica ineficiência na esterilização do meio de cultura ou no manuseio, além de assepsia inadequada do operador.

Os danos causados pela contaminação microbiana são inúmeros pelo fato de competirem com os explantes pelos nutrientes do meio de cultura, além de liberarem metabólitos tóxicos que podem ocasionar a morte da planta (Grattapaglia & Machado 1998; Pereira et al. 2003, 2014).

Para minimizar os efeitos desses contaminantes ou eliminá-los da superfície da planta, tem sido utilizado diferentes procedimentos de desinfestação durante a iniciação ou introdução dos explantes no cultivo in vitro (Fang & Hsu 2012). O método mais empregado, para este fim é a lavagem ou imersão do material vegetal em hipoclorito de sódio (0,1 a 0,5% de cloro ativo), e/ou em álcool (70 a 80%), pelo alto potencial germicida, além de um ótimo surfactante, facilitando a ação de outros produtos (Grattapaglia & Machado 1998; Dutra et al. 2009; Thomas 2012; Pereira et al. 2014).

A dificuldade de desinfestação dos explantes está intimamente relacionada à origem dessas plantas doadoras, ou seja, se o material for proveniente de árvores mantidas em ambientes protegidos a desinfestação será mais fácil e eficiente do que para os materiais cultivados em condições de campo (McComb & Bennett 1986; Dutra et al. 2009). Sendo assim, com o objetivo de minimizar as contaminações, tem sido recomendado o uso de tratamentos fitossanitários nas plantas matrizes, para manter a níveis baixos a comunidade epifítica. Em geral, soluções antimicrobianas de ação sistêmica e de contato são pulverizadas nas plantas para o controle de agentes microbianos (Wendling et al. 2006). Além disso, a manutenção nutricional e sanitária das matrizes fornecedoras dos explantes é imprescindível (Oliveira et al. 2013).

Contaminação versus manifestação

A contaminação tem sido muito confundida na literatura com manifestação endofítica. Para melhor compreender este conceito e a distinção desses eventos, faz-se necessário entender que as plantas, assim como os animais (extensivamente estudados), abrigam uma vasta gama de microrganismos que formam uma comunidade biológica complexa (microbioma) (Ryan et al. 2008; Pini et al. 2012; Jimtha et al. 2014). Dependendo da região da planta que coloniza, essa comunidade microbiana pode ser classificada como epifítica (quando habitam a superfícies de folhas ou hastes) ou endofítica (quando colonizam a endosfera, ou interior dos tecidos vegetais) (Ikeda et al. 2010; Pini et al. 2012).

Dessa forma, quando a comunidade epifítica cresce no meio de cultivo, o evento se denomina contaminação, devido, principalmente, à velocidade com que acontece (poucos dias após o estabelecimento in vitro) e aos danos que provoca, podendo indicar falhas no processo de iniciação das culturas (Panicker et al. 2007; Thomas & Aswath 2013). Entretanto, quando é a comunidade endofítica que cresce no meio de cultura esse evento se classifica como manifestação endofítica, por ser um evento de caráter mais restrito, menos danoso e, após, muito tempo de cultivo in vitro (Almeida et al. 2009; Abreu-Tarazi et al. 2010; Esposito-Polesi et al. 2015, 2017).

Portanto, a manifestação endofítica ocorre de maneira muito mais lenta e surge até anos após a introdução do material, em razão de alterações ambientais e estresses físicos e/ou químicos (Thomas & Soly 2009; Thomas & Kumari 2010). Em outras palavras, significa dizer que pequenas alterações nas condições ambientais (temperatura, pH, luminosidade, composição do meio, ou a transferência para a estufa) podem induzir um desequilíbrio da relação de convivência harmônica entre o endófito e seu hospedeiro e desencadear uma rápida manifestação endofítica no meio de cultura, mesmo depois de muito tempo em multiplicação (Leifert & Cassells 2001; Thomas & Kumari 2010; Esposito-Polesi et al. 2015, 2017).

O número de subcultivos, ou o cultivo in vitro prolongado de espécies, com vistas à manutenção de germoplasma (Jimtha et al. 2014) ou ao rejuvenescimento/revigoramento de espécies adultas (Dutra et al. 2009; Brondani et al. 2012; Wendling et al. 2014), tem sido apontado como um promotor da manifestação endofítica (Esposito-Polesi et al. 2015).

A manifestação endofítica pode atingir níveis variados de extensão. Quando ocorre em níveis aceitáveis sem prejudicar o desenvolvimento da planta (a grande maioria das vezes) recomenda-se manter o subcultivo das microplantas, realizando uma limpeza ou troca de meio (Piotto 2013), de modo a não descartar o material desnecessariamente. Em recente estudo com E. benthamii cultivado in vitro, Piotto (2013) constatou que na maioria dos casos em que houve o crescimento repentino no meio de cultivo (após meses de subcultivos = manifestação endofítica), o desenvolvimento das microcepas ou não sofreu alteração ou foi beneficiado com incremento no número de brotações e massa seca.

Em outros casos, porém, quando ultrapassam o limite aceitável (Fig. 1) e prejudicam o desenvolvimento das espécies, tornando-se vitropatogênicas (produzindo sintomas visíveis nas plantas e/ou com crescimento visível e de grande extensão no meio de cultura) (Thomas & Prakash 2004; Thomas 2006; Thomas et al. 2006, 2007; Moreno-Vázquez et al. 2014), o mais recomendável é o descarte do material, desde que não seja imprescindível mantê-lo. Nesse último exemplo, quando a manutenção é necessária, podem ser feitos tratamentos curativos adicionando ao meio de cultivo antibióticos (antibioticoterapia), como ampicilina sódica, agrimicina, cloranfenicol, ácido nalidíxico, gentamicina e cefazolina, por períodos que variam de dias a meses (Pereira et al. 2003, 2014; Thomas 2011; Leone et al. 2016).

Figura 1
Cultivo in vitro de Eucalyptus propinqua evidenciando a manifestação bacteriana endofítica acima do aceitável, prejudicando o desenvolvimento da microplanta e com crescimento intenso por sobre o meio de cultura.
Figure 1
Eucalyptus propinqua in vitro cultivation wtih intense endophytic manifestation (a and b). This high bacterial growth above the culture medium harms the microplant development and multiplication.

Sendo assim, a distinção entre os conceitos e mecanismos de "contaminação" e "manifestação endofítica" é fundamental para evitar prejuízos, além de se considerar que a interação entre os microrganismos endofíticos e as plantas não se finda no cultivo in vitro, como verificado em diversos trabalhos com microplantas consideradas axênicas, podendo trazer inúmeros benefícios nos processos morfogênicos. (Almeida et al. 2009; Dias et al. 2009; Abreu-Tarazi et al. 2010; Esposito-Polesi et al. 2013, 2015, 2017).

Microrganismos endofíticos

O entendimento sobre os microrganismos endofíticos ou endófitos, subsidia a compreensão de sua importância para a manutenção da vida vegetal, mesmo dentro do cultivo in vitro, e para quebrar o paradigma de que a existência de microrganismos na cultura de tecidos sempre será sinal de falhas no processo.

Sendo assim, os endófitos são classificados como aqueles que vivem dentro da planta em parte ou em todo o seu ciclo de vida, sem, no entanto, causar qualquer sintoma visível de sua presença, podendo ser isolados de tecidos de plantas com desinfestação superficial (Hardoim et al. 2008; Qin et al. 2011). Eles habitam as regiões saudáveis da planta, ou regiões assintomáticas, numa densidade entre 10³ a 10⁶ UFC por grama de tecido fresco (Bandara et al. 2006; Sheng et al. 2011). São transmitidos maternalmente (vertical) ou horizontalmente de forma passiva ou através de vetores (Hamilton et al. 2012).

Embora o conhecimento da ecologia e filogenia de microrganismos endofíticos tenha se acumulado rapidamente durante as últimas três décadas, perguntas básicas sobre a origem evolutiva, especiação e papel ecológico dos endofíticos permanecem sem resposta (Saikkonen et al. 2004). Sabe-se que dentre, aproximadamente, 300.000 espécies de plantas existentes na terra hospedam pelo menos um microrganismo endofítico (Saikkonen 2007; Guo et al. 2008), e que na maioria dos casos estabelece uma relação (endófito/planta hospedeira) de simbiose e provavelmente mutualística (Guo et al. 2008; Ardanov et al. 2012). Simbiose é a relação ecológica estabelecida entre dois ou mais indivíduos interespecíficos, que se estende por um contínuo e pode variar com o tempo (Crawford & Clardy 2011).

Uma interação simbiótica pode ser positiva (mutualismos), negativa (patogênese ou parasitismo), ou neutra para um ou ambos os indivíduos (comensalismo) (Hamilton et al. 2012). No caso específico do mutualismo, os endófitos ao habitarem regiões microecologicamente distintas recebem suprimento nutricional adequado (C e N) e são protegidos contra condições ambientais adversas, como por exemplo, excesso de luz solar, raios ultravioletas, etc. (Duan et al. 2013). Em se tratando das plantas hospedeiras os benefícios são inúmeros, a citar o controle biológico de plantas, promoção de crescimento e mecanismos de defesa, bem como, produção de metabólitos com interesse biotecnológico e farmacológico (Fig. 2) (Ryan et al. 2008; Sheng et al. 2011; Duan et al. 2013; Gagne-Bourgue et al. 2013; Ikeda et al. 2013).

Figura 2
Usos e aplicações dos endófitos nos mais variados setores. Adaptado de Ryan et al. (2008).
Figure 2
Endophyte applications in the different productive sectors and human activity. Adapted from Ryan et al. (2008).

Dentro do controle biológico de doenças o uso de microrganismos endofíticos tem gerado bons resultados (Aravind et al. 2010). Muitas pesquisas sugerem que as comunidades endofíticas estão diretamente envolvidas na defesa da planta, podendo reduzir a invasão de patógenos por vários mecanismos, dentre eles pode-se citar a competição pelo mesmo nicho de colonização, a produção de uma vasta gama de compostos contra o invasor, e a indução de resistência sistêmica das plantas (Ardanov et al. 2012; Chen et al. 2014).

Estudos revelam que endófitos podem melhorar o crescimento e desenvolvimento das plantas, de forma direta ou indireta (van der Lelie et al. 2009). De maneira direta, estão envolvidos na fixação de nitrogênio, aumento da disponibilidade de minerais, produção de sideróforos, produção de reguladores de crescimento (como auxinas, citocininas e giberelinas), e supressão da síntese de etileno (Rosenblueth & Martínez-Romero 2006; Hernandez et al. 2009; Jimtha et al. 2014). Indiretamente beneficiam a planta, impedindo o crescimento ou atividade de patógenos, por meio da competição por nicho e nutrientes, por antibiose, ou produção de enzimas hidrolíticas, inibição de enzimas ou toxinas produzidas pelo patógeno, ou pela indução de mecanismos de defesa sistêmica da planta (Rosenblueth & Martínez-Romero 2006; Singh et al. 2008; van der Lelie et al. 2009).

A fotossíntese, também responsável pelo crescimento e desenvolvimento do vegetal, é uma importante função fisiológica auxiliada por ecossistemas microbianos endofíticos, que podem fornecer energia para cada componente do sistema, proteger os fotossistemas através de uma rede de sinais e melhorar a cadeia transportadora de elétrons (Burlak et al. 2013).

Levando-se em consideração a necessidade de moléculas naturais e com eficiente uso biotecnológico e farmacológico, os endófitos têm sido utilizados na prospecção de compostos bioativos, usados pelas plantas hospedeiras para defesa contra patógenos, e que, alternativamente, mostram-se promissores não apenas como antibióticos, mas também como antitumorais, além de alcaloides, terpenoides, flavonoides e esteroides (Guo et al. 2008; Qiu et al. 2010; Aly et al. 2011; Katoch et al. 2014).

Mais recentemente, os microrganismos endofíticos têm despontado como úteis na produção de compostos bioativos com interesse na fitorremediação, devido à capacidade que possuem em melhorar esse processo, diretamente no metabolismo e assimilação dos metais pesados, ou indiretamente, impedindo a fitotoxidez da planta (Newman & Reynolds 2005; Esposito-Polesi 2011; Li et al. 2011; Ma et al. 2011; Gutiérrez-Ginés et al. 2014).

Distribuição nas plantas (nichos de colonização)

Pesquisas revelam que apesar de haver uma elevada diversidade taxonômica de microrganismos, apenas poucos táxons foram encontrados caracteristicamente associados à maioria das espécies de plantas, consequentemente, a ideia geralmente aceita é que a capacidade de colonizar a planta não é uma característica comum, estando ligada a um grupo geneticamente propenso à associação com plantas. Esta hipótese foi comprovada pela descoberta de que, pelo menos, na classe de Alphaproteobacteria, um repertório de genes comuns parece estar presente em todos os seus membros que se associam com plantas (Pini et al. 2011, 2012).

Dessa maneira, para que a colonização ocorra e o "endofitismo" se estabeleça, o microrganismo deve ser capaz de: (1) penetrar rapidamente e de maneira generalizada nas plantas jovens em condições de campo; (2) colonizar um ambiente dentro das plantas que suportem a sua função específica (isto é, deve haver um fornecimento adequado de carbono fixo, substratos apropriados, pH óptimo, tensão de oxigênio, umidade, bem como os meios para o fluxo de metabólitos bacterianos para os locais apropriados); (3) não comprometer significativamente a função normal da planta (McCully 2001).

Diversos estudos explicam que o início da colonização dos endófitos nas plantas ocorre, predominantemente, a partir do sistema radicular, mais precisamente nos locais de dano epidérmico, que surgem naturalmente, devido ao desenvolvimento de raízes laterais, ou por meio de pêlos radiculares ou em conjunções epidérmicas. Por essa razão acredita-se que as maiores densidades de endófitos se localizam na rizosfera e diminuem progressivamente a partir das raízes passando pelo caule chegando até as folhas (densidade é menor) (Rosenblueth & Martínez-Romero 2006; Compant et al. 2011). Uma vez que as exigências devem ser cada vez maiores e devidamente atendidas pelos endófitos.

Uma vez no interior das raízes, os endófitos se espalham sistematicamente, na planta (raízes, caules, folhas, flores, sementes, frutos, tubérculos e também dentro de nódulos de leguminosas) pela migração através do sistema vascular ou do apoplasto. (McCully 2001; Rosenblueth & Martínez-Romero 2006; van der Lelie et al. 2009; Piccolo et al. 2010; Compant et al. 2011; Qin et al. 2011), colonizando os espaços inter e intracelulares (Fig. 3) de diferentes tecidos como parênquima, epiderme, bainha do feixe vascular, xilema e floema (Almeida et al. 2009; Piccolo et al. 2010; Sheng et al. 2011; Thomas & Reddy 2013; Esposito-Polesi et al. 2017).

Figura 3
a-d. Fotomicrografias em microscopia eletronica de varredura em a-b e de transmissao em c-d, do terço médio da lâmina foliar de microplantas assintomáticas de violeta (Viola odorata). Com destaque às bactérias (setas brancas) presentes nas células parenquimáticas do mesofilo e da bainha do feixe vascular – a,b. microscopia eletrônica de varredura; c,d. microscopia eletrônica de transmissão (cit = citoplasma de células parenquimáticas, espaço intracelular).
Figure 3
Electron micrographs from leaf blades of asymptomatic violet microplants (Viola odorata) – a-b. scanning electron microscopy; c-d. transmission electron microscopy (cit = cytoplasm of parenchymal cells, intracellular space). With emphasis on bacteria (white arrows) present in the parenchymal cells of the mesophyll and the vascular bundle sheath

Estrutura e variação das comunidades endofíticas

A densidade e diversidade dos organismos são moldadas pelo ambiente em que vivem, pelas espécies que residem os mesmos habitats com adaptações comuns, por sua ecologia e história evolutiva (Borcard et al. 1992; Freckleton & Jetz 2009). A aplicação destes princípios às relações endófitos-hospedeiro, auxilia no entendimento das variações que ocorrem no microbioma vegetal, em decorrência da espécie, do cultivar, e até mesmo entre espécies transgênicas e suas respectivas progenitoras (Andreote et al. 2010). As populações endofíticas também podem ser influenciadas pela idade da planta, estádio de desenvolvimento, status fisiológico, práticas agrícolas, além de condições ambientais como temperatura, oferta de água e nutrientes (Hardoim et al. 2008; Barros et al. 2010; Compant et al. 2010; Islam et al. 2010; Davitt et al. 2011; Ardanov et al. 2012; Gagne-Bourgue et al. 2013).

A arquitetura da planta, estrutura e distribuição etária da folhagem, topografia da superfície foliar, nutrientes presentes na superfície das folhas e o microclima estabelecido (Saikkonen 2007; Mukhtar et al. 2010), bem como a presença de patógenos, ou ainda o resultado de processos estocásticos não explicados, podem também interferir na estrutura da comunidade endofítica (Liu et al. 2012, 2013; Hollants et al. 2013; Mejía et al. 2014).

Cabe salientar, porém, que independentemente dos fatores externos aos endófitos, existe uma especialização em colonizar uma determinada espécie (coevolução). Dessa maneira, de acordo com as estratégias de vida dos endófitos eles podem ser classificados em obrigatórios ou facultativos (Hardoim et al. 2008). Os obrigatórios são estritamente dependentes da planta hospedeira para seu crescimento e sobrevivência. Os facultativos, por outro lado, possuem uma fase de seu ciclo dentro da planta hospedeira e outra em que vivem fora delas (Hardoim et al. 2008). Alguns são mais frequentes em determinado tipo de vegetal, designados dominantes, em contraposição há outros mais raros, chamados de secundários (Pileggi 2006).

A especialização é um mecanismo biótico que depende de uma série de fatores intrínsecos e extrínsecos, como: a concorrência, parasitismo, herbivoria, reforço de barreiras reprodutivas, resistência do hospedeiro e coevolução de características correspondentes (Moricca & Ragazzi 2008; Mejía et al. 2014; Moricca et al. 2012). Este processo de adaptação leva à restrição de nicho, e pode favorecer a convivência duradoura de espécies de endofíticos no mesmo hospedeiro (Moricca et al. 2012). Por essa razão os microrganismos endofíticos obrigatórios estão filogeneticamente estruturados e regidos pela história evolutiva com o hospedeiro, enquanto que os facultativos devem estar distribuídos mais aleatoriamente entre as espécies hospedeiras e fortemente influenciados por todos esses fatores ambientais supracitados (Hollants et al. 2013).

A coevolução, também, faz com que mesmo que os endófitos tenham a disposição incontáveis recursos e hospedeiros, fiquem restritos a um seleto grupo de espécies vegetais, ou a uma única espécie, ou a um único indivíduo e até mesmo a certos órgãos de um mesmo indivíduo (Cook et al. 2009, 2012; Moricca et al. 2012; Sukumar et al. 2013). Dessa forma, uma vez dentro de uma determinada espécie hospedeira, os endófitos podem se distribuir de maneira distinta nos órgãos e tecidos, variando sua estrutura e diversidade (Errasti et al. 2010; Ardanov et al. 2012; Prasanna et al. 2012; Bodenhausen et al. 2013). Devido, primeiramente, às diferenças existentes na estrutura interna dos órgãos da planta e os diversos tecidos do mesmo órgão, e, posteriormente, devido à constituição química do tecido vegetal e ao estado nutricional oferecido para que os microrganismos possam crescer. Tais condições estabelecem uma especificidade desses microrganismos em sobreviver dentro de um determinado substrato (tecido diferente, textura e composição química) (Izumi et al. 2008; Gong & Guo 2009; Mejía et al. 2014).

Liu et al. (2013) estudaram diferentes estágios da embriogênese em linhagens de milho, mostrando que pode se estabelecer uma relação entre as fases de desenvolvimento do embrião com mudanças significativas na sucessão da comunidade bacteriana endofítica, comprovada pelas diferenças nas linhagens e espécies encontradas em cada fase. Segundo os mesmos autores isso ocorre, pois na fase inicial de maturação da semente, muito mais bactérias são capazes de penetrar, por ser mais tenra, representando, assim, uma diversidade relativamente maior de endófitos nesta fase. Durante o processo de maturação, a quantidade e a concentração da água e de matéria seca na semente mudam significativamente, influenciando os tipos de bactérias endofíticas capazes de colonizar esse novo ambiente.

Endófitos e a manifestação

No ambiente, as populações endofíticas são flutuantes, ou seja, alteram-se em número e espécie, respondendo, principalmente, às variações das condições ambientais (regime de luz, de chuvas, temperatura, geadas, nutrição do solo, patógenos, outras espécies adjacentes, entre outros) e com relações ecológicas mais diversas e complexas (Hardoim et al. 2008; Barros et al. 2010; Compant et al. 2010; Islam et al. 2010; Davitt et al. 2011; Ardanov et al. 2012; Gagne-Bourgue et al. 2013).

Mas como essas populações se comportam no ambiente in vitro, nos quais as condições são rigorosamente controladas (nutrição, fonte de carbono, luz, água, temperatura e pH) e os aspectos macroambientais são desconsiderados (estresse hídrico, balanço nutricional, por exemplo) tem sido o objeto de estudo de muitas pesquisas. A determinação dos fatores que induzem a manifestação endofítica, apesar de bem teorizada, não está totalmente elucidada havendo a necessidade de mais estudos que avaliem como ela se inicia, e qual momento certo de atuar para que haja uma convivência "amigável" sem descartes desnecessários, ou em que circunstâncias esse convívio passa a ser prejudicial à planta, levando à eliminação do material.

No entanto, o que já se sabe é que nesses ambientes as fontes geradoras de estresse, são outras, como a alta taxa metabólica (material em intensa multiplicação) uso de reguladores de crescimento e de sacarose (Leifert & Cassells 2001; Thomas & Kumari 2010). Sendo assim, quando o meio de cultura é modificado, por exemplo, altera-se a composição, balanço hormonal, estimula-se uma maior exsudação por parte das plantas, resultando no crescimento endofítico no meio de cultura. Do mesmo modo, a alteração na temperatura pode promover tanto o crescimento microbiano pelo estabelecimento de uma temperatura ótima ao desenvolvimento, quanto pelo aumento da exsudação, por parte da planta (Leifert & Cassells 2001).

Outro aspecto importante a ser ressaltado é o fato de que as pressões ocasionadas por um sistema de cultivo tão restritivo têm gerado uma redução em número de espécies, isto significa que as comunidades endofíticas são bem menores (em diversidade) nas microplantas, quando comparadas às plantas do campo (Pirttilä et al. 2008; Almeida et al. 2009; Dias et al. 2009; Abreu-Tarazi et al. 2010; Esposito-Polesi et al. 2015, 2017).

Ulrich et al. (2008) ao compararem a comunidade bacteriana endofítica de plantas de Populus sp. oriundas de campo e de micropropagação observaram redução no número de espécies quando o material do campo foi introduzido in vitro. Segundo Fang & Hsu (2012), o ambiente in vitro é responsável por acomodar apenas espécies de endófitos específicos, em detrimento da supressão de outros, além disso, cada espécie, cultivar ou clone vegetal pode gerar um ambiente in vitro único e exclusivo, de modo a permitir a colonização de espécies mais adaptadas. Dessa maneira, como mencionado anteriormente por Hollants et al. (2013), majoritariamente são os endófitos obrigatórios que conseguem resistir às alterações microambientais, devido a uma história ecológica evolutiva e, por essa razão, dificilmente tenderão a crescer fora da planta (isto é, no meio de cultivo), já a minoria de facultativos poderá, eventualmente, se manifestar no meio de cultura.

Esse fenômeno foi recentemente observado por Esposito-Polesi et al. (2015), no qual ao utilizar diferentes fontes de explantes oriundos de uma mesma planta matriz de Eucalyptus benthamii Maiden & Cambage observaram um comportamento distinto dessas fontes, no tocante à manifestação endofítica. Esses mesmos autores afirmaram por meio de análises moleculares que as populações endofíticas mais variáveis em estrutura ao longo dos subcultivos proporcionaram maiores taxas de manifestação, em contrapartida, as populações mais intimamente relacionadas e pouco variáveis não manifestaram.

Neste contexto, aliado a capacidade de estabelecimento e multiplicação in vitro, a escolha de um tipo de explante acarreta, invariavelmente, na "escolha" de uma comunidade endofítica diversa em estrutura de táxons, em decorrência do local de onde foi retirado (copa, base, ramos jovens ou adultos, gemas, rizomas, etc.) e por essa razão, dependendo das relações ecológicas que estabelece com seus endófitos, o explante será mais ou menos propenso a induzir manifestações no meio de cultura (Esposito-Polesi et al. 2015).

Benefícios dos endófitos no cultivo in vitro

Segundo Thomas et al. (2007) o cultivo in vitro livre de patógenos e seguros do ponto de vista fitossanitário é uma exigência a ser respeitada para essa técnica, o que não significa um cultivo asséptico ou estéril (plantas axênicas). Estudos recentes têm combatido e refutado a existência de plantas axênicas, uma vez que todas elas abrigam endófitos em seu interior (onipresentes) sem lhes causar danos, dentre esses trabalhos podemos citar os com microplantas de crisântemo, uva, mamão, melão, banana, abacaxi, orquídea, eucalipto, morango, entre outros (Almeida et al. 2005, 2009; Thomas et al. 2007, 2008; Dias et al. 2009; Abreu-Tarazi et al. 2010; Esposito-Polesi 2011; Esposito-Polesi et al. 2013, 2015, 2017).

Dessa maneira, assim como no ambiente in vivo e ao contrário do que se supunha, os microrganismos endofíticos tem despontado como importantes aliados no cultivo in vitro (Esposito-Polesi 2011). A presença de tais microrganismos pode não representar problemas reais à cultura, e ainda ser positivo sua manutenção na planta, pois, além de não apresentarem características patogênicas, também se configuram como vetores genéticos, agentes de controle biológico e fonte de metabólitos secundários, dentre outros (Almeida et al. 2005; Donato et al. 2005; Londe et al. 2007).

Segundo Pirttilä et al. (2008), o genótipo da planta e a composição de espécies endofíticas, aliados às condições de cultivo in vitro, representam um fator chave para a obtenção de culturas com alta capacidade de regeneração. Muitos estudos sugerem que os endófitos auxiliam a microplanta no ajuste osmótico, no desenvolvimento, pela produção de fitormônios, absorção de nutrientes e proteção contra ação de patógenos, além de favorecer o crescimento e sobrevivência das microplantas na fase de aclimatização e na rapidez da produção de biomassa (Almeida et al. 2005, 2009; Dias et al. 2009; Thomas & Soly 2009; Abreu-Tarazi et al. 2010). Adicionalmente alguns endófitos podem aumentar a tolerância ao estresse causado durante os subcultivos (Lata et al. 2006).

Espécies endofíticas do gênero Methylobacterium são relatadas na literatura como benéficas na cultura de tecidos vegetais, por promoverem a embriogênese e organogênese, além de induzirem a formação de calos e brotações em Triticum aestivum, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, e Linum usitatissimum, e permitir o desenvolvimento das plantas regeneradas, pela biossíntese de compostos e fitormônios como auxinas e citocininas (Trotsenko et al. 2001; Pirttilä et al. 2008). Além disso, essas bactérias podem produzir vitamina B12, e remover o metanol e outros resíduos metabólicos do meio de cultivo (Pirttilä et al. 2004, 2005).

Algumas actinobactérias, por exemplo, produzem auxinas que podem aumentar a capacidade de germinação e o crescimento da microplanta (Qin et al. 2011). No caso específico de microplantas de Pinus sylvestris, sabe-se que alguns endófitos podem minimizar o escurecimento dos calos, através da formação de biofilmes que protegem contra as reações de oxidação e escurecimento, além da produção de compostos que afetam a morfologia e aumentam a viabilidade dos explantes (Pirttilä et al. 2002, 2004, 2008).

Conclusão

Com base no exposto, fica claro que ainda há uma grande carência de estudos mais aprofundados a respeito da relação endófito e planta hospedeira. No cultivo in vitro essa necessidade é ainda maior. De qualquer modo, muito já foi feito, grupos de pesquisas nacionais e internacionais, buscam desvendar os mistérios nos mecanismos que desencadeiam essa manifestação. Além disso, já se sabe que as relações serão mais sólidas e menos propensas a desenvolver problemas na micropropagação (manifestações) quanto maior for a coevolução entre os grupos e, consequentemente, maior a obrigatoriedade de convivência (interdependência = endossimbiontes). E quanto mais facultativo o microrganismo for, mais sofrerá às pressões exercidas pelo sistema restrito de cultivo in vitro, levando ao crescimento no meio de cultura. Antever que o tempo de cultivo, o tipo de explante, mudanças abruptas nas condições de cultivo (como luz, temperatura, pH, por vezes ocasionada por quedas de energia nos ambientes onde essas plantas estão acondicionadas), uso indiscriminado de agentes químicos de controle (desinfestantes e antibióticos) e de reguladores de crescimento, podem induzir a manifestação repentina desses microrganismos, servirá como uma ferramenta essencial para evitar que esse evento ocorra e que o material seja descartado. Entretanto, se mesmo assim a manifestação ocorrer, ela poderá servir como um indicador de desequilíbrio, tornando-se um ponto de tomada de decisões no ajuste do protocolo de cultivo, na escolha do melhor método de controle e contenção desse crescimento (quando for requerida a manutenção in vitro do material) e, por fim, no descarte crítico, devidamente avaliado. Essa quebra de paradigma, do descarte imediato e desnecessário, retira do pesquisador a responsabilidade sobre o evento e lhe permite tempo para ponderar a melhor alternativa de acordo com o objetivo e o material cultivado in vitro.

• Editora de área: Dra. Georgia Pacheco

Agradecimentos

À Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ/USP), ao Departamento de Ciências Biológicas (LCB/ESALQ/USP) e ao Laboratório de Morfogênese e Biologia Reprodutiva de Plantas com especial distinção ao professor Doutor Marcílio de Almeida e à Doutora Cristina Vieira de Almeida pelo apoio técnico/científico prestados ao longo do desenvolvimento das pesquisas.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  06 Jul 2020
• Data do Fascículo
  2020

Histórico

• Recebido
  12 Fev 2018
• Aceito
  24 Out 2018