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Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia

Print version ISSN 0102-0935On-line version ISSN 1678-4162

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. vol.54 no.6 Belo Horizonte Dec. 2002

http://dx.doi.org/10.1590/S0102-09352002000600005 

Expressão dos filamentos intermediários no diagnóstico dos tumores mamários de cadelas

 

[Expression of intermediate filaments in canine mammary tumors diagnosis]

 

 

D.A.P.C. ZuccariI,*; A.E. SantanaII; N.S. RochaIII

IHospital Veterinário "Dr. Halim Atique" – Fac. Medicina Veterinária, UNIRP
II
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da UNESP, Jaboticabal
III
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP, Botucatu

Suporte financeiro FAPESP – Processo nº 96/07908

Endereço para correspondência

 

 


RESUMO

Foram utilizados anticorpos monoclonais para marcação imunoistoquímica dos tecidos tumorais e obtenção de informações sobre a histogênese dos tumores mamários utilizando-se anti-citoqueratinas para marcação de células epiteliais, e anti-actina e anti-vimentina para células mioepiteliais. O procedimento imunoistoquímico mostrou-se esclarecedor com relação à histogênese dos tumores mamários, confirmando a marcação de células epiteliais com as citoqueratinas que perdem sua expressão na transformação celular maligna. A a-actina e a vimentina mostraram-se eficientes na marcação de células mioepiteliais. A a-actina diminuiu a marcação na metaplasia óssea ou cartilaginosa contrariamente à vimentina cuja marcação foi aumentada. Os resultados permitem melhor entendimento da classificação dos tumores mamários de cadelas com a utilização de anticorpos monoclonais como marcadores do citoesqueleto, que se mostraram eficientes nessa caracterização.

Palavras-chave: Cão, tumor de mama, imunoistoquímica


ABSTRACT

Immunohistochemical evaluation was performed to study the histogenesis of canine mammary tumors and to contribute to a better understanding of their classification. Monoclonal antibodies specific for different types of intermediate filaments (cytokeratins, vimentin, a-actin) were used. Epithelial cells stained positively for cytokeratins and their expression was lost as the malignant transformation occurs. Myoepithelial cells stained positively for vimentin and a-actin. In contrast to vimentin, a-actin lost the expression as the cartilaginous or osseous metaplasia occurs. Immunohistochemical evaluation with monoclonal antibodies proved to be efficient for identification of tumor histogenesis. a-actin) were used. Epithelial cells stained positively for cytokeratins and their expression was lost as the malignant transformation occurs. Myoepithelial cells stained positively for vimentin and a-actin. In contrast to vimentin, a-actin lost the expression as the cartilaginous or osseous metaplasia occurs. Immunohistochemical evaluation with monoclonal antibodies proved to be efficient for identification of tumor histogenesis.

Keywords: Dog, mammary tumor, immunohistochemistry


 

 

INTRODUÇÃO

A complexidade dos tumores mamários em cadelas é resultado da presença de células epiteliais e mesenquimatosas em estreita associação, o que coloca em questão a sua histogênese, sobretudo nas áreas tumorais de aparência fibrosa, cartilaginosa e óssea.

Destexhe et al. (1993) consideram a classificação dos tumores mamários em cadelas mais simples se forem utilizados os filamentos intermediários marcados com anticorpos monoclonais pela técnica da imunoistoquímica. Os autores acreditam ser esta uma ferramenta poderosa na caracterização do componente celular neoplásico e de sua histogênese. Seguindo esse procedimento, as células epiteliais, mesenquimais e musculares vão expressar, respectivamente, filamentos intermediários de citoqueratina, vimentina e desmina. Outros marcadores podem também ser utilizados para identificar tipos celulares como por exemplo os microfilamentos de a-actina para miofibroblastos e a-actina e proteína S-100 para células mioepiteliais. Hellmén & Lindgren (1989) usaram anticorpos monoclonais para marcar células epiteliais, mesenquimais, musculares e nervosas, respectivamente, citoqueratinas, vimentina, desmina e neurofilamentos, e demonstraram que a estabilidade dos filamentos intermediários possibilitou a caracterização e o estudo da histogênese de diversos tumores.

A necessidade de se determinar com mais precisão a origem das células nas neoplasias mamárias canina é crescente. Estudos têm demonstrado que as células mioepiteliais e as células do epitélio luminal têm, possivelmente, suas origens de uma mesma célula mãe, ou de uma célula dita intermediária, geneticamente instável e com capacidade de assumir uma expressão fenotípica comum aos dois tipos celulares (Peleteiro, 1994).

Dairkee et al. (1985) caracterizaram as células mioepiteliais como células derivadas do ectoderma que exibem características tanto epiteliais como mesenquimais. Os pesquisadores demonstraram a utilização de um anticorpo monoclonal do grupo das citoqueratinas, específico para células mioepiteliais e para a camada basal epitelial dos ductos mamários e das glândulas sudoríparas e salivares humana, que se caracteriza por seu baixo peso molecular (51 kilodaltons) e por ser o anticorpo não reativo ao epitélio luminal, ao estroma, à musculatura, à gordura e aos vasos. É utilizado como importante ferramenta no estudo da influência do componente mioepitelial no desenvolvimento normal da mama durante a lactação e na sua involução, assim como na formação tumoral maligna e metastática.

No ser humano, grande atenção tem sido dispensada às queratinas como marcadores potenciais de diferenciação e progressão neoplásica em carcinomas mamários. O mais interessante é utilizar citoqueratinas para marcação de células epiteliais luminal e basal (mioepitelial), já que a expressão das citoqueratinas é conservada após a transformação das células epiteliais. Muitos estudos têm demonstrado que os derivados neoplásicos dessas células contêm citoqueratinas características, as quais podem ser detectadas com anticorpos específicos (Rabanal & Else, 1994). Desse modo, as diferentes camadas de epitélio podem ser diferenciadas de acordo com as citoqueratinas utilizadas. Durante a transformação celular no desenvolvimento ou na progressão tumoral há mudança na especificidade da citoqueratina que irá reconhecer tal camada epitelial, o que possibilita subdividir o epitélio e, com isso, analisar a origem e o desenvolvimento do tumor.

A vimentina tem sido demonstrada em algumas células basais de ductos do tecido mamário normal de mulheres e cadelas e na maioria dos epitélios fetais (Héllmen & Lindgren, 1989). O anticorpo monoclonal V9 (vimentina), que identifica o epitopo da molécula de vimentina altamente sensível à fixação excessiva, tem sido usado como controle de qualidade de diversas reações imunoistoquímicas. No caso de neoplasias mamárias em mulheres, sendo os epitopos de proteínas receptoras hormonais e de oncoproteínas altamente sensíveis à fixação, tal procedimento tem se mostrado útil. Além disso, pequena quantidade de neoplasias mamárias apresenta positividade para vimentina em muitas células epiteliais tumorais (mais de 50%), e esse achado torna o prognóstico mais reservado (Battifora & Kopinsksi, 1986).

A actina é um microfilamento protéico, estrutural e contráctil que identifica o isótopo alfa da actina de músculo liso e reage com células musculares lisas normais, neoplásicas e células mioepiteliais.

O objetivo desta pesquisa foi localizar os filamentos intermediários específicos pela técnica de imunomarcação para o estudo da histogênese dos tumores mamários de cadelas.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Entre abril e dezembro de 1997, selecionaram-se 31 cadelas com idade entre quatro e 17 anos, portadoras de tumor mamário e pertencentes ao Hospital Veterinário da FCAV-UNESP, campus de Jaboticabal. Os tumores das cadelas foram submetidos à exérese cirúrgica e os fragmentos de tecidos (histopatologia) encaminhados ao laboratório de patologia animal, após serem fixados em formol tamponado a 10% por 24 horas, seguiram o procedimento histopatológico de rotina. Para o procedimento imunoistoquímico as lâminas foram previamente lavadas com detergente neutro Extran (Merck Sharp Dome – USA), em água corrente, secas com gaze e submetidas à preparação com Polylisina (Sigma – St. Louis, USA). Os cortes com 5mm de espessura foram desparafinizados de acordo com os procedimentos rotineiros com duas passagens em xilol a 60oC por 15 minutos e quatro passagens em etanol, em concentrações decrescentes (100, 95, 80 e 70%), por 30 segundos cada.

Após lavagens em águas corrente e destilada, procedeu-se ao bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio a 3%, com duas trocas de cinco minutos cada. Repetiram-se as lavagens em águas corrente e destilada e em seguida com solução salina tamponada (PBS) 0,01M, pH 7,4, por cinco minutos.

O método escolhido para a recuperação antigênica foi o da digestão enzimática. As lâminas foram incubadas com solução de tripsina (30mg%) durante 20 minutos à 37oC, e a seguir lavadas com água corrente, água destilada e PBS.

O método avidina-biotina peroxidase constou da utilização de três soros: o primeiro, não marcado, é dirigido contra o antígeno, o segundo, conjugado à biotina, é dirigido contra o primeiro soro e se fixa sobre os complexos devido à grande afinidade da biotina pela avidina e o terceiro, complexo A-B-PO formado de grupos avidina-biotina e de uma enzima, a peroxidase, conjuga-se facilmente à biotina. A atividade da peroxidase foi revelada pela diaminobenzidina em presença de água oxigenada ou pelo amino-etil-carbazol (AEC).

Os anticorpos utilizados foram adquiridos sob a forma de kits comerciais (pancitoqueratinas AE1/AE3, citoqueratinas de baixo peso molecular CAM 5.2, vimentina, actina de músculo liso) (Dako – USA), cuja seqüência de procedimentos técnicos padrões para a imunomarcação seguiram os passos descritos por Zuccari (1999).

 

RESULTADOS

No diagnóstico histopatológico dos tumores mamários houve prevalência de carcinomas (42%), com o tumor misto maligno aparecendo em segundo lugar com 32,3%. Os tumores benignos foram apenas 16% do total, um cistadenoma, um condroma e três tumores mistos benignos (Tab. 1).

 

 

No procedimento imunoistoquimíco observou-se que as citoqueratinas AE1/AE3 demonstraram expressão positiva em 100% das células do epitélio basal e luminal do tecido mamário normal e neoplásico (Tab. 2), semelhante aos resultados de Destexhe et al. (1993). Não houve alteração na sua expressão nos tumores benignos em relação aos malignos, sendo sua expressão positiva mesmo nos tumores mais agressivos e indiferenciados como nos carcinomas sólidos.

 

 

As citoqueratinas de baixo peso molecular (CAM 5.2) que se caracterizam pela marcação de epitélios simples, no caso dos tumores mamários, tiveram sua expressão positiva apenas no epitélio luminal dos ductos (Fig. 1A) e alvéolos (Fig. 1B). Observou-se que essa expressão foi melhor visualizada nos tumores benignos e nos tumores malignos diferenciados onde a arquitetura do tecido estava melhor preservada (cistoadenoma, carcinoma alveolar, comedocarcinoma). A segunda camada de células epiteliais basais ou também chamadas células mioepiteliais foram negativas para a marcação das citoqueratinas CAM 5.2 (Fig. 1B). As células mioeopiteliais apresentaram 100% de positividade com os anticorpos AE1/AE3 e também com a a-actina e aproximadamente 50% de positividade com a vimentina.

 

 

A a-actina, considerada o melhor marcador para células mioepiteliais da glândula mamária, confirmou sua expressão com positividade de até 100% nessa camada celular (Fig. 1C). Observou-se diminuição da intensidade da expressão desse marcador na metaplasia das células mioepiteliais nos tumores mistos mamários (Fig. 1D), benignos ou malignos.

Contrariamente à a-actina, as células mioepiteliais tiveram expressão fracamente positiva pela vimentina (Fig. 1E e 1F), que se intensificou nas metaplasias óssea e cartilaginosa dos tumores mistos benignos e malignos. As células intersticiais, as células fusiformes ou "spindle shape" e os condrócitos e osteócitos presentes nos tumores mistos mamários demonstraram expressão positiva em 100% das amostras analisadas para esse marcador.

 

DISCUSSÃO E CONCLUSÕES

No estudo imunoistoquímico dos tumores mamários neste grupo de cadelas, independentemente do seu diagnóstico e classificação, foram utilizados anticorpos de largo espectro que identificam citoqueratinas de alto e baixo peso molecular (AE1/AE3) e anticorpos para citoqueratinas de baixo peso molecular que as identificam nos epitélios simples (CAM 5.2). Conforme esperado, as citoqueratinas AE1/AE3 marcaram as camadas epiteliais luminal e basal dos tecidos mamários normal e neoplásico. As citoqueratinas CAM 5.2 marcaram a camada luminal dos epitélios dos ductos e dos alveólos, perdendo a expressão nos epitélios dos carcinomas pouco diferenciados. O uso de anticorpos para marcação de tecidos específicos tem aumentado a possibilidade de se estudar a histogênese dos tumores mamários caninos. A marcação das células epiteliais por anti-citoqueratinas nos ductos inter e intralobulares e nos alvéolos mamários conseguida neste estudo é semelhante à observada por Hellmén & Lindgren (1989).

As células epiteliais basais ou mioepiteliais que se apresentam de forma contínua nos epitélios dos ductos e de forma descontínua no alvéolos mamários demonstraram intensa marcação pela anti- a-actina. De acordo com Destexhe et al. (1993), as células mioepitelias sob estímulo neoplásico sofrem metaplasia, evoluindo da fase de repouso para proliferativa, passando por uma fase intermediária na qual assumem uma forma estrelada até se transformarem em condrócitos normais, transformação esta que faz parte da fisiopatogenia dos tumores mistos mamários. Neste estudo observou-se a perda de expressão das pancitoqueratinas e da a-actina nessa transformação e acredita-se que isso seja devido à mudanças na morfologia dos filamentos citoplasmáticos dessas células quando elas sofrem a metaplasia, conforme estudos histoquímicos de Pulley (1973).

Em todas as figuras: Método ABC; contracoloração pela hematoxilina de Mayer.

As células mioepiteliais demonstraram positividade para a vimentina que se intensificou nas metaplasias condróide e óssea dos tumores mistos.

Desse modo e de acordo com a literatura consultada, conclui-se que as citoqueratinas AE1/AE3 podem ser consideradas marcadores do componente epitelial das neoplasias mamárias em cadelas independente do seu diagnóstico ou grau de malignidade. A expressão das citoqueratinas CAM 5.2 está diminuída nos tumores menos diferenciados e indiferenciados. A a-actina e a vimentina que mostraram ter marcação inversa do componente mesenquimal do tecido neoplásico, podem caracterizar o grau de metaplasia das células mioepiteliais dos tumores mistos mamários em cadelas.

O estudo imunoistoquímico constituiu-se procedimento sofisticado e exigiu cuidados desde a preparação e acondicionamento dos anticorpos e reagentes até o desenvolvimento da técnica e a interpretação dos resultados, demonstrando nem sempre ser de fácil utilização. Mesmo assim seu valor é indiscutível, já que proporciona condições para melhor avaliar a histogênese e o comportamento biológico dos tumores mamários em cadelas, estudo diretamente ligado à mesma patologia em mulheres e de extrema importância na medicina atual. Acredita-se que a utilização de um número cada vez maior de marcadores imunoistoquímicos permitirá melhor entendimento das neoplasias mamárias.

 

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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DESTEXHE, E.; LESPAGNARD, L.; DEGEUTER, M. et al. Immunohistochemical identification of myoepithelial, epithelial, and connective tissue cells in canine mammary tumors. Vet. Pathol., v.30, p.146-154, 1993.        [ Links ]

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ZUCCARI, D.A.P.C. Contribuição ao estudo imunoistoquímico dos tumores mamários em cadelas. 1999. 122f. Dissertação (Mestrado em Patologia Animal) - Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, SP.        [ Links ]

 

 

Endereço para correspondência
D.A.P.C. Zuccari
BR 153, km 69, 15100-000 – São José do Rio Preto, SP

E-mail: debora.zuccari@zaz.com.br

Recebido para publicação em 30 de agosto de 2000
Recebido para publicação, após modificações, em 10 de julho de 2002

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