SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.54 issue6Influence of the whey protein concentrate on the composition of low fat hard requeijãoCharacteristics of the ovaries of zebu cows (Bos taurus indicus) collected in slaughterhouses author indexsubject indexarticles search
Home Pagealphabetic serial listing  

Services on Demand

Article

Indicators

Related links

Share


Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia

Print version ISSN 0102-0935

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. vol.54 no.6 Belo Horizonte Dec. 2002

http://dx.doi.org/10.1590/S0102-09352002000600015 

COMUNICAÇÃO

[Communication]

 

Fator necrosante citotóxico em Escherichia coli isolada de mastite clínica bovina

 

[Cytotoxic necrotizing factor in Escherichia coli strain isolated from clinical bovine mastitis]

 

 

M.G. RibeiroI, E.O. CostaII, D.S. LeiteIII, A.J.P. FerreiraIV, A.S. SilvaIII, H.H.M. Della ColletaIII

IDepartamento de Higiene Veterinária e Saúde Publica-FMVZ-UNESP
IINúcleo de Apoio à Pesquisa em Glândula Mamária e Produção Leiteira-NAPGAMA-FMVZ-USP
IIIDepartamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biologia, UNICAMP, Campinas, SP
IVDepartamento de Patologia-FMVZ-USP

Endereço para correspondência

 

 


Recentemente os microrganismos envolvidos na gênese da mastite bovina foram convencionalmente agrupados de acordo com as fontes de infecção e vias de transmissão, e classificados como contagiosos ou ambientais (Costa, 1998). E. coli é considerado um dos principais agentes de mastite bovina de origem ambiental. As infecções por E. coli na glândula mamária estão relacionadas ao comportamento oportunista do agente, veiculado das fezes dos animais, pela via ascendente, para o canal galactóforo (Radostits et al., 2000).

Nos últimos anos observa-se grande preocupação na investigação de fatores de virulência em E. coli isoladas de mastite bovina. Dentre estes fatores assume destaque a produção do fator necrosante citotóxico-CNF (Lipman et al., 1995; Kaipainen et al., 2000). O CNF tem sido associado a uma grande variedade de infecções no homem e nos animais. Este fator é subdividido em CNF1 e CNF2, e é considerado importante mecanismo de virulência de E. coli (Sussman, 1997). Em geral, a ocorrência de CNF em E. coli de origem animal e/ou humana está relacionada à produção de alfa-hemolisina. Em células Vero, o CNF induz a formação de células gigantes, multi-nucleadas e morte celular (Gyles, 1992).

A primeira descrição de E. coli produtora de CNF no homem foi realizada em distúrbio entérico em criança e, subseqüentemente, em diferentes afecções extra-intestinais, incluindo processos septicêmicos e infecções do trato urinário (Sussman, 1997).

Nos animais, tem-se investigado a produção de CNF em linhagens de E. coli isoladas de mastite (Kaipainen et al.,2000). Pohl et al. (1993) detectaram a produção de CNF em sete (24,1%) de 29 estirpes de E. coli hemolíticas isoladas de mastite bovina. Lipman et al.(1995) notificaram CNF em uma entre 20 estirpes de E. coli isoladas de mastite clínica bovina. Mainil et al. (1999) assinalaram mais de 90% e 40% de E. coli alfa-hemolíticas produtoras, respectivamente, de CNF1 e CNF2 em estirpes isoladas de afecções no homem e em animais. Ressaltaram também a multiplicação em meio com restrição de ferro (aerobactina) e produção de alfa-hemolisina, postulando o risco de infecção cruzada entre linhagens de E. coli de origem animal e humana, especialmente para pessoas que residem em propriedades rurais.

Em virtude da escassez de estudos do envolvimento de fatores de virulência de E. coli isoladas de mastite no Brasil, objetivou-se relatar a produção de CNF a partir de linhagem desse microrganismo isolada de caso de mastite clínica. Foi encaminhada à FMVZ-UNESP/Botucatu, SP, uma vaca mestiça da raça Holandesa, sete anos de idade, com sinais de mastite clínica na segunda semana da lactação. Ao exame clínico o animal apresentava-se em decúbito lateral, com taquicardia, taquipnéia, febre e sinais de mastite clínica (quatro quartos mamários edemaciados e congestos), com 24 horas de evolução dos sintomas. Procedeu-se a colheita asséptica de leite para exames microbiológicos. O leite colhido apresentava aspecto amarelado, contendo pequenos flocos. O animal morreu logo após a avaliação clínica. Na necropsia observaram-se lesões restritas à glândula mamária, com sinais de edema, hemorragia e áreas de necrose no parênquima glandular nos quartos afetados.

O leite e os fragmentos colhidos do parênquima mamário foram semeados em ágar sangue ovino (5%) desfibrinado e ágar MacConkey (Difco). Após 24h de incubação em aerobiose, à 37oC, isolaram-se microrganismos em cultura pura, em ágar MacConkey, e alfa-hemolíticos, em ágar sangue. A partir das características morfo-tintoriais, de cultivo e bioquímicas (Krieg & Holt, 1994) o agente foi identificado como Escherichia coli.

Colônias isoladas do agente foram submetidas à extração de citotoxinas visando a detecção de CNF no caldo tríptico de soja-TSB (Difco) acrescido de mitomicina C. Os sobrenadantes da cultura do agente em TSB foram inoculados em células Vero, com o efeito citopático avaliado entre 24 e 72h (Della Colleta, 1997). Como controle positivo foram utilizadas as linhagens de E. coli MR48 e B26a produtoras, respectivamente, de CNF1 e CNF2, cedidas pelo laboratório de antígenos bacterianos da UNICAMP. Entre 24 e 48h de incubação, em atmosfera de CO2 a 37oC, observou-se formação de células gigantes, multinucleadas, seguida da perda da viabilidade celular (destruição da monocamada celular) ao final de 72h, compatível com o efeito citopático do CNF (Gyles, 1992; Sussman, 1997).

Colônias isoladas de E. coli obtidas no meio de MacConkey foram cultivadas em ágar nutriente contendo 200mM de Dipiridila, incubadas à 37oC por 24h (Ferreira & Bottino, 1998), visando investigar a multiplicação em meio com restrição de ferro. O mesmo procedimento foi repetido mediante três semeaduras consecutivas, com intervalos de 24h. Ao final da terceira passagem foram ainda observadas colônias de E. coli, caracterizando a capacidade de multiplicação dessa linhagem em meio com restrição de ferro.

Autores têm mencionado aumento da concentração de lactoferrina na glândula mamária em animais com mastite (Radostitis et al., 2000; Zecconi & Smith, 2000). A capacidade de ligação dessa glicoproteína ao íon ferro é reconhecida como mecanismo inato de defesa na glândula mamária, em virtude de restringir a disponibilidade de ferro, elemento considerado necessário ao metabolismo bacteriano. A presença de fatores de virulência ligados à captação do íon ferro (multiplicação em meio com restrição de ferro e produção de alfa-hemolisina) na linhagem de E. coli isolada do animal com mastite provavelmente favorecem a infecção da glândula mamária pelo agente.

Pohl et al. (1993), Lipman et al. (1995) e Kaipainen et al. (2000) relataram produção de CNF em bovinos com mastite clínica. Mainil et al. (1999) ressaltaram a associação entre linhagens de E. coli necrotoxigênicas e produção de alfa-hemolisina, principalmente em infecções extra-intestinais no homem e em animais. Pohl et al. (1993) e Kaipainen et al. (2000) também descreveram a produção simultânea de CNF, alfa-hemolisina e sideróforos em linhagens de E. coli isoladas de bovinos com mastite clínica. Esses achados apontam que linhagens de E. coli produtoras de CNF, hemolisinas e sideróforos deteriam mecanismos adicionais de patogenicidade na glândula mamária, e estariam ligadas a casos severos de mastite clínica, com tendência à evolução hiperaguda e ocasionalmente fatal, como a observada no presente caso. Adicionalmente, a presença de E. coli produtora de CNF isolada de vaca com mastite alerta para o risco na saúde pública, representado pela transmissão da linhagem necrotoxigênica do agente pelo leite.

Palavras-chave: Mastite bovina, Escherichia coli, fatores de virulência, fator necrosante citotóxico


ABSTRACT

This report describes the production of cytotoxic necrotizing factor (CNF) by an Escherichia coli strain isolated from clinical bovine mastitis with clinical signs of toxemia The animal had hemorrhages and necrosis of the mammary glands, and died within 24 hours after the onset of clinical signs. In addition to CNF identification, alpha-haemolysin and siderophores production were also characterized in this strain. This report reinforce the association of CNF and alpha-haemolysin production in E. coli virulence associated with clinical cases of severe bovine mastitis.

Keywords: Bovine mastitis, Escherichia coli, virulence factors, cytotoxic necrotizing factor


 

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

COSTA, E. O. Importância da mastite na produção leiteira do país. Rev. Educ. Cont. CRMV-SP, v.1, p.3-9, 1998.        [ Links ]

DELLA COLLETA, H.H.M. Purificação e caracterização do fator necrosante citotóxico do tipo 2 (CNF 2) produzido por Escherichia coli. 1997. 103f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas). Instituto de Biologia, Universidade de Campinas, Campinas, SP.        [ Links ]

FERREIRA, A.J.P.; BOTTINO, J.A. Patogenia da colibacilose aviária. São Paulo: Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP, 1998. 31p.        [ Links ]

GYLES, C.L. Escherichia coli cytotoxins and enterotoxins. Can. J. Microbiol., v.38, p.734-746, 1992.        [ Links ]

KAIPAINEN, T.; POHJANVIRTA, T.; SHPIGEL, N.Y. et al. Virulence factors of Escherichia coli isolated from bovine clinical mastitis. In: INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON IMMUNOLOGY OF RUMINANT MAMMARY GLAND, 1, 2000, Stressa. Proceedings... Stressa: International Dairy Federation, 2000. p.314-318.        [ Links ]

KRIEG, N.R.; HOLT, J.C. Bergey`s manual of sistematic bacteriology. 9.ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1994. 984p.        [ Links ]

LIPMAN, L.J.A.; NIJS, A.; GAASTRA, W. Isolation and identification of fimbriae and toxin production by Escherichia coli strains from cows with clinical mastitis. Vet. Microbiol.,v.47, p.1-7, 1995.        [ Links ]

MAINIL, J.G.; JACQUEMIN, E.; POHL, P. et al. Comparison of necrotoxigenic Escherichia coli isolates from farm animals and from humans. Vet. Microbiol.,v.70, p.123-135, 1999.        [ Links ]

POHL, P.; OSWALD, E.; MUYLEM, K.V. et al. Escherichia coli producing CNF1 and CNF2 cytotoxins in animals with different disorders. Vet. Res., v.24, p.311-315, 1993.        [ Links ]

RADOSTITS, O. M.; GAY, C.C.; BLOOD, D.C. et al. Veterinary medicine. A textbook of the diseases of cattle, sheep, pigs, goats and horses. 9.ed. London: W. B. Saunders, 2000. p.603-700.        [ Links ]

SUSSMAN, M. Escherichia coli: mechanisms of virulence. United Kingdom: Cambridge University, 1997. 639p.        [ Links ]

ZECCONI, A.; SMITH, K.L. Mammary gland immunological components. In: INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON RUMINANT MAMMARY GLAND IMMUNITY, 1, 2000. Stressa. Proceedings… Stressa: International Dairy Federation, 2000. p.7-47.        [ Links ]

 

 

Endereço para correspondência
M.G. Ribeiro
Caixa Postal 560
18618-000 - Botucatu, SP
E-mail: mgribeiro@fmvz.unesp.br

Recebido para publicação em 1 de novembro de 2001
Recebido para publicação, após modificações, em 6 de agosto de 2002