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Avaliação de embriogênese somática em cultivares de aveia (Avena saliva L.)

Somatic embryogenesis evaluation in oat (Avena saliva L.) genotypes

Resumos

Nove genótipos de aveia foram cultivados in vitro com o objetivo de formação de calos e posterior avaliação de embriogênese somática. Os calos foram testados em três protocolos (meio MS- MURASHIGE & SKOOG (1962) com diferentes dosagens de hormônios). Após um mês em meio de subcultivo, os calos foram avaliados quanto à porcentagem de embriogênese somática. Os protocolos testados revelaram respostas diferentes na indução de embrióides, proporcionando a escolha do que fosse mais adequado para esta função. No primeiro experimento não foi obtida diferença entre os genótipos, por outro lado, no experimento 2, a UFRGS 7 e UFRGS 8 possuíram médias significativamente maiores. A análise de covariância realizada com o objetivo de verificar se o tamanho de embrião estava envolvido na indução de embriogênese evidenciou que para alguns genótipos esta medida é importante.

embrião imaturo; indução de calos; cultura de tecidos; aveia hexaplóide


Nine oat genotypes were cultivated in vitro to evaluate callus initiaton and subsequent somatic embryogenesis. The immature embryo were submited to different protocola (MURASHIGE & SKOOG (1962) médium with differents hormones dosages). The protocols tested caused differences in somatic embryogenesis, and the best of them was selected to continue the research. After a month in subculture médium the cali were evaluated concerning embryoid porcentage, and showed differences according to genotype in experiment 2, UFRGS 7 and UFRGS 8 presented superior means. The covariance analysis revealed that in some genotypes this parameter is important.

immature embryo; callus induction; tissue culture; hexaploid oat


AVALIAÇÃO DE EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA EM CULTIVARES DE AVEIA (Avena sativa L.)

SOMATIC EMBRYOGENESIS EVALUATION IN OAT (Avena sativa L.) GENOTYPES

Fernanda Bered1 1 Bióloga, aluna de Doutorado, Curso de Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Bolsista do CNPq, Departamento de Plantas de Lavoura, Faculdade de Agronomia, Caixa Postal 776, 95001-970, Porto Alegre, RS. (Autor para correspondência). Maria Jane Cruz de Melo Sereno2 1 Bióloga, aluna de Doutorado, Curso de Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Bolsista do CNPq, Departamento de Plantas de Lavoura, Faculdade de Agronomia, Caixa Postal 776, 95001-970, Porto Alegre, RS. (Autor para correspondência). Fernando Irajá Félix de Carvalho3 1 Bióloga, aluna de Doutorado, Curso de Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Bolsista do CNPq, Departamento de Plantas de Lavoura, Faculdade de Agronomia, Caixa Postal 776, 95001-970, Porto Alegre, RS. (Autor para correspondência). Luiz Carlos Federizzi3 1 Bióloga, aluna de Doutorado, Curso de Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Bolsista do CNPq, Departamento de Plantas de Lavoura, Faculdade de Agronomia, Caixa Postal 776, 95001-970, Porto Alegre, RS. (Autor para correspondência). Ana Lúcia Cunha Dornelles4 1 Bióloga, aluna de Doutorado, Curso de Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Bolsista do CNPq, Departamento de Plantas de Lavoura, Faculdade de Agronomia, Caixa Postal 776, 95001-970, Porto Alegre, RS. (Autor para correspondência). Cláudia Erna Lange5 1 Bióloga, aluna de Doutorado, Curso de Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Bolsista do CNPq, Departamento de Plantas de Lavoura, Faculdade de Agronomia, Caixa Postal 776, 95001-970, Porto Alegre, RS. (Autor para correspondência). Cristine Luise Handel6 1 Bióloga, aluna de Doutorado, Curso de Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Bolsista do CNPq, Departamento de Plantas de Lavoura, Faculdade de Agronomia, Caixa Postal 776, 95001-970, Porto Alegre, RS. (Autor para correspondência).

RESUMO

Nove genótipos de aveia foram cultivados in vitro com o objetivo de formação de calos e posterior avaliação de embriogênese somática. Os calos foram testados em três protocolos (meio MS- MURASHIGE & SKOOG (1962) com diferentes dosagens de hormônios). Após um mês em meio de subcultivo, os calos foram avaliados quanto à porcentagem de embriogênese somática. Os protocolos testados revelaram respostas diferentes na indução de embrióides, proporcionando a escolha do que fosse mais adequado para esta função. No primeiro experimento não foi obtida diferença entre os genótipos, por outro lado, no experimento 2, a UFRGS 7 e UFRGS 8 possuíram médias significativamente maiores. A análise de covariância realizada com o objetivo de verificar se o tamanho de embrião estava envolvido na indução de embriogênese evidenciou que para alguns genótipos esta medida é importante.

Palavras-chave: embrião imaturo, indução de calos, cultura de tecidos, aveia hexaplóide.

SUMMARY

Nine oat genotypes were cultivated in vitro to evaluate callus initiaton and subsequent somatic embryogenesis. The immature embryo were submited to different protocola (MURASHIGE & SKOOG (1962) médium with differents hormones dosages). The protocols tested caused differences in somatic embryogenesis, and the best of them was selected to continue the research. After a month in subculture médium the cali were evaluated concerning embryoid porcentage, and showed differences according to genotype in experiment 2, UFRGS 7 and UFRGS 8 presented superior means. The covariance analysis revealed that in some genotypes this parameter is important.

Key words: immature embryo, callus induction, tissue culture, hexaploid oat.

INTRODUÇÃO

A produção de grãos de cereais tem aumentado de forma intensa no último século. Além da otimização visível do manejo das culturas, a utilização de cultivares superiores obtidas através de melhoramento genético é um dos fatores que tem contribuído em grande parte para o progresso obtido (FEIL, 1992). Por outro lado, os melhoristas buscam continuamente novas técnicas que venham a incrementar a variabilidade existente nas espécies cultivadas, ou que possam auxiliar como ferramenta no melhoramento de plantas, permitindo seleção de classes genotípicas desejadas. Nas últimas décadas a cultura de tecidos tem sido empregada com diferentes propósitos, proporcionando a manipulação de grande número de plantas a nível celular. A regeneração de plantas a partir de células em cultura é o elo essencial entre a manipulação in vitro e o melhoramento a campo. Desta forma, é necessário regenerar grande número de plantas férteis para que as mesmas possam ser selecionadas e utilizadas em testes a campo (CUMMINGS et al., 1976).

Tecidos em cultura podem regenerar plantas de duas formas: via organogênese ou embriogênese somática. A embriogênese somática, ou produção de estruturas bipolares a partir de células somáticas em cultura, é desejável por exibir rápida taxa de crescimento, friabilidade e altos níveis de regeneração de plantas (BREGITZER et al, 1995). Devido a estas características desejáveis, esforços têm sido feitos no sentido de maximizar a embriogênese somática no cultivo in vitro de diversos cereais.

EAPEN & RAO (1985) estudando regeneração de trigo, centeio e triticale concluíram que em cereais os calos podem ser parcialmente embriogênicos, sendo que os embrióides somáticos geralmente são escassos. Por outro lado, resultados diferentes tem sido obtidos no cultivo in vitro de trigo e triticale no Laboratório de Cultura de Tecidos e Citogenética (LCTC) do Departamento de Plantas de Lavoura da Faculdade de Agronomia na UFRGS (DORNELLES et al., 1996; LANGE et aí, 1995; MILACH et al., 1991). HEYSER & NABORS (1982) detectaram em média 20% de regiões embriogênicas nos calos de aveia analisados e, segundo BREGITZER et al. (1989), o calo embriogênico de aveia é estabelecido em duas etapas: em seu estádio inicial consiste de células vacuoladas não regeneráveis e, em uma segunda oportunidade os setores embriogênicos são selecionados e subcultivados, a fim de obter embriogênese integral. A inicialização da embriogênese ocorre a partir de estruturas globulares chamadas pré-embrióides, os quais, após subcultivo são transformados em embrióides somáticos.

A avaliação de embriogênese somática pode ser feita de diferentes formas. A mais usual delas é a determinação de embriogênese a partir de uma escala subjetiva, onde escores são atribuídos aos diferentes calos. BREGITZER et al. (1989) utilizaram a escala de 1 a 5 onde "1" correspondia a calos não friáveis e não embriogênicos e "5" a calos agregados e embriogênicos. IMMONEN (1992) avaliando embriogênese em triticale considerou a escala linear de 1 a 10 adequada para avaliação. O número "1" correspondia a um embrióide e o "10" a mais de 45 embrióides.

Por outro lado, a capacidade de produzir embrióides somáticos a partir de cultivo in vitro varia expressivamente com o genótipo, meio de cultura e tipo de explante, o que toma necessária a adequação do cultivo às necessidades da instituição de trabalho. IMMONEN (1992), testou diferentes genótipos de triticale em dois meios de cultura, verificando que o MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) promoveu um significante aumento na embriogênese somática. Por outro lado, TOMES & SMITH (1985) verificaram respostas diferenciadas de produção de calos embriogênicos em diferentes germoplasmas elite de milho. LANGE et aí (1995) investigaram o controle genético da embriogênese in vitro de trigo, após verificarem diferentes respostas entre genótipos brasileiros para este caráter. Além disto, o embrião imaturo parece ser um consenso como o explante mais adequado para a promoção de calogênese e embriogênese somática de cereais (BREGITZER et al, 1989; MILACH et al., 1991; CUMMINGS et al., 1976; LANGE et al., 1995; IMMONEN, 1992).

Os objetivos deste trabalho foram: testar nove genótipos de aveia quanto a sua capacidade de formação de embrióides somáticos; verificar qual o protocolo de cultura mais adequado para indução de embriogênese somática; verificar se o tamanho de embrião imaturo (explante) está relacionado com a embriogênese.

MATERIAIS E MÉTODOS

Nove genótipos de aveia (Avena sativa L.) foram cultivados in vitro. UFRGS 7, UFRGS 8, UFRGS 9, UFRGS 10, UFRGS 11 e UFRGS 12 (programa de melhoramento genético de aveia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul); UPF 7 e UPF 12 (Universidade de Passo Fundo) e GAF/PARK (Universidade de Minessota - U.S.A). O trabalho de cultivo e manutenção de calos foi realizado no LCTC utilizando embriões imaturos como explante.Três protocolos (A, B e C) foram empregados em todos os genótipos, cada um com dois meios contendo diferentes dosagens de reguladores de crescimento (Tabela 1). O meio básico utilizado foi o MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) suplementado com 30g/l de sacarose, 7g/l de ágar e 0,1 g/l de mio-inositol.

Para cada protocolo foram empregadas dez placas de cada genótipo, cada uma com dez embriões. As condições de cultura foram de luz difusa e 25°C de temperatura. Após um mês em cultivo no meio indutor de embriogênese (subcultivo), os calos foram avalidados quanto à embriogênese somática.

Com a obtenção dos resultados, os mesmos genótipos foram testados no protocolo eleito como melhor indutor de embriogênese para confirmação da ordenação das variedades (experimento 2). Foram utilizadas vinte placas como repetições de cada genótipo, cada uma contendo dez embriões.

Os calos foram avaliados conforme a sua porcentagem de embriogênese. Na primeira etapa do trabalho (experimento 1) escores de 0 a 9 foram atribuídos aos calos e no experimento 2 escores de 1 a 10. A nota mínima indicava 0% de embriogênese e a máxima 100%. Para fms de análise foram utilizadas as médias de embriogênese por placa.

No experimento 2 os embriões imaturos foram medidos em comprimento com o auxílio de uma ocular graduada. A graduação seguia a proporção de 20 unidades = 1mm.

Foi utilizado o delineamento completamente casualizado. Os fatores utilizados na Análise de Variância foram genótipo, protocolo e sua interação. A análise foi realizada segundo o procedimento de modelo linear generalizado (GLM do SÃS), devido ao desbalanceamento das repetições (placas) causado por contaminação e consequente eliminação das mesmas. As médias foram comparadas pelo teste de Duncan a 5%. Foi feita uma análise de covariância utilizando tamanho de embrião como covariável da embriogênese.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Ao passarem por subcultivo os calos com potencial para embriogênese foram gradativamente formando pequenas estruturas globulares identificadas como pré-embrióides. A grande maioria dos calos era mista, com partes embriogênicas e outras organogênicas. Os pedaços do calo que continham embrióides somáticos eram de cor amarela e friável, enquanto que os organogênicos possuíam aspecto esbranquiçado.

Os protocolos testados para indução de embriogênese somática revelaram efeitos distintos entre si (Tabela 2). Os protocolos A e B não foram diferentes estatisticamente, apresentando médias gerais de 0,47 e 0,69 respectivamente, entretanto mostraram superioridade ao protocolo C no qual foi obtida média geral de 0,008. BREGITZER et al. (1995) relataram que o meio MS com 2mg/l de 2,4D (ácido 2,4 diclorofenoxiacético) tem sido o mais utilizado na indução de calos em aveia. Além disto, diversos trabalhos de cultura de tecidos em cereais utilizam como protocolo básico a redução gradual da dosagem de 2,4 D até a regeneração de plantas (BREGITZER et al, 1995, CUMMINGS et al. 1976, IMMONEN, 1992, LANGE et aí, 1995, MILACH et al., 1991). A necessidade de escolha de um dos protocolos para continuação do trabalho fez com que o protocolo B fosse selecionado por proporcionar médias mas elevadas apesar de não diferir do A.

Os genótipos não foram estatisticamente distintos para este caráter no experimento 1 (Tabela 2 e 3). A ocorrência de variações ao acaso e constante tentativa de adequação dos métodos de trabalho foram os responsáveis pêlos elevados coeficientes de variação.

Por outro lado, foi obtida diferença para os genótipos quanto a capacidade de embriogênese somática no experimento 2 (Tabela 2). O genótipo UFRGS 7 e UFRGS 8 possuíram médias maiores (Tabela 3) para este caráter, o que é de. extrema importância já que são variedades que nunca foram testadas com este objetivo. Da mesma forma TOMES & SMITH (1985) verificaram que a capacidade de iniciação de calos embriogênicos está intimamente relacionada ao tipo de germoplasma utilizado em milho. IMMONEN (1992), testando o efeito do cariótipo de triticale na embriogênese somática, concluiu que um determinado cariótipo daquela espécie produzia significativamente mais calos embriogênicos. Genótipos superiores quanto à formação de embrióides somáticos podem ser utilizados para técnicas avançadas de biotecnologia como a biolística, por exemplo.

A diferença entre a ordenação dos genótipos de um experimento para outro, provavelmente tenha como causa a adequação da técnica de avaliação de embriogênese. No 2° experimento ocorreu uma diminuição drástica no coeficiente de variação e foi detectada diferença entre os genótipos quanto à sua capacidade de formação de embrióides somáticos.

A análise de covariância, realizada com o objetivo de verificar se o tamanho de embrião estava diretamente envolvido na indução de embriogênese, evidenciou que em alguns genótipos esta medida era importante. Os genótipos UFRGS 7, UFRGS 8, UFRGS 10 e GAF/PARK parecem depender do estádio fisiológico do explante para que ocorra o aumento de embriogênese (Tabela 4). IMMONEN (1992), de outra forma, não encontrou diferenças nas frequências de indução de calos e embriogênese nos diferentes tamanhos de embriões imaturos de triticale testados.

CONCLUSÕES

Tanto protocolos de cultivo distintos como as diferenças genéticas provocam alterações do caráter embriogênese somática, sendo que o melhor protocolo para cultivo in vitro e indução de embriogênese em aveia é aquele que envolve a redução gradual de 2,4 D. Também o tamanho de embrião está relacionado com o caráter, acentuando a embriogênese em alguns genótipos.

2 Bióloga, Dr., Professora Pesquisadora do CNPq. Departamento de Plantas de Lavoura, Faculdade de Agronomia, UFRGS.

3 Engenheiro Agrônomo, PhD., Professor Pesquisador do CNPq. Departamento de Plantas de Lavoura, Faculdade de Agronomia, UFRGS.

4 Engenheiro Agrônomo, Dr., Professor Adjunto, Departamento de Horticultura, Faculdade de Agronomia, UFRGS.

5 engenheiro Agrônomo, MsC, Pesquisador da FUNDACEP, Cruz Alta, RS.

6 engenheiro Agrônomo, aluna de mestrado do Curso de Fitotecnia, Departamento de Plantas de Lavoura, Faculdade de Agronomia, UFRGS.

Recebido para publicação em 22.02.96. Aprovado em 15.05.96

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    Bióloga, aluna de Doutorado, Curso de Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Bolsista do CNPq, Departamento de Plantas de Lavoura, Faculdade de Agronomia, Caixa Postal 776, 95001-970, Porto Alegre, RS. (Autor para correspondência).
  • Datas de Publicação

    • Publicação nesta coleção
      24 Set 2008
    • Data do Fascículo
      Dez 1996

    Histórico

    • Aceito
      15 Maio 1996
    • Recebido
      22 Fev 1996
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