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Anais Brasileiros de Dermatologia

On-line version ISSN 1806-4841

An. Bras. Dermatol. vol.78 no.3 Rio de Janeiro May/June 2003

http://dx.doi.org/10.1590/S0365-05962003000300011 

ARTIGO DE REVISÃO

 

Imunoprofilaxia anti-herpética utilizando vírus geneticamente modificado: vacina DISC*

 

Antiherpetic immunoprophylaxy with genetically modified virus: DISC vaccine*

 

 

Omar Lupi

Pós-Doutorado em Imunodermatologia e Biologia Molecular pela University of Texas. Mestre e Doutor em Dermatologia pela UFRJ. Licenciado da UFRJ e UNIG

Endereço para correspondência

 

 


RESUMO

As vacinas anti-herpéticas podem atuar de forma profilática ou terapêutica contra a infecção pelo herpes simples. Diversos tipos de vacinas foram avaliados no passado com resultados pouco efetivos, tais como aquelas que utilizaram vírus vivos, porém atenuados, e as que utilizaram subunidades glicoprotéicas. As novas vacinas do tipo DISC, com partículas infectivas incapacitadas para mais de um ciclo replicativo, são desenhadas para combinar a segurança e as vantagens das vacinas que utilizam vírus atenuados com a imunogenicidade das que usam vírus vivos. Nas vacinas DISC utiliza-se um vírus cujo gene para a glicoproteína H foi removido. Torna-se, assim, capaz de infectar células humanas, exatamente como o vírus natural, mas sua progênie não pode mais completar o ciclo replicativo. São partículas virais não patogênicas, capazes de induzir ampla resposta de linfócitos T citotóxicos e da imunidade humoral contra antígenos herpéticos.

Palavras-chave: herpes simples; glicoproteínas; vacinas; vacinas virais; terapia de genes.


SUMMARY

Antiherpetic vaccines are administered to either act as a prophylactic or therapeutic against herpes simplex infection. Several kinds of vaccines have been evaluated but with little result, such as live-attenuated viral vaccines and subunit glycoprotein vaccines. The new disabled infectious single cycle (DISC) vaccines are designed to combine the safety and advantages of inactivated vaccines with the immunogenic activity of live viral vaccines. The gene for glycoprotein H was removed to disable the virus that can infect human cells much the same as native virus and viral progeny are produced but are defective and can no longer replicate. These viral particles are nonpathogenic and are capable of inducing broad cytotoxic T-cell and humoral response against herpetic antigens.

Keywords: herpes simplex; glycoprotein; vaccines; viral vaccines; gene therapy.


 

 

INTRODUÇÃO

As relações desenvolvidas entre os diversos vírus e seus hospedeiros naturais são bastante complexas. Os vírus têm que resolver um curioso paradoxo evolutivo, pois, para subsistir, dependem dos hospedeiros, por cujo sistema imunológico são, entretanto, constantemente agredidos. A solução para muitos dos vírus é a chamada coevolução. O vírus do herpes simplex (HSV) é, talvez, o exemplo mais claro desse processo coevolutivo, causando eventuais recorrências que permitem sua disseminação, porém de forma branda o suficiente para conviver com o hospedeiro humano durante toda a vida.1

O HSV é um DNA-vírus de grandes dimensões (150-250nm) que apresenta quatro componentes básicos; a estrutura helicoidal de DNA em dupla hélice, envolvida por capsídeo icosaédrico e circundada por substância amorfa (tegumento) e membrana lipídica mais externa (envelope). Apresenta duas cepas distintas, o HSV-1 e o HSV-2 responsáveis pelos quadros extragenitais e perigenitais, respectivamente, do herpes simples.1,2

A transmissão do HSV ocorre ao longo das superfícies mucosas ou das soluções de continuidade na pele. Sítios susceptíveis incluem a mucosa oral, ocular, genital e anal. O HSV-2 tem como via preponderante de contágio a relação sexual ou o canal do parto, nas gestantes infectadas. Os herpes-vírus não penetram com eficiência o epitélio queratinizado. Seu ciclo de replicação é curto, provocando efeito citopático em queratinócitos e fibroblastos em período que varia de 48 a 72 horas. Pode, no entanto, estabelecer infecção latente nos gânglios sensitivos durante décadas.2

O envelope viral permite a expressão integral das sete glicoproteínas de superfície importantes na infectividade dos herpes-vírus: gB, gC, gD, gE, gG, gH e gI (Tabela 1). Cada uma delas congrega, na verdade, um complexo glicoprotéico específico, com diferentes pesos moleculares e sítios de glicosilação próprios, capaz de conferir identidade antigênica e biológica ao vírus.1,2,3

Algumas glicoproteínas apresentam importância crítica quanto à resposta imunológica anti-HSV. As glicoproteínas gE e gI codificam receptores para a fração Fc da IgG, enquanto a gH atua como receptor para o fragmento C3b do complemento.3 Quando atuam em conjunto, protegem a célula infectada da citólise mediada por anticorpos, ajudando a entender por que a presença de anticorpos anti-HSV não se correlaciona, necessariamente, com proteção contra a moléstia.

As glicoproteínas gB, gC e gD parecem ser, no entanto, indispensáveis para a replicação viral nas células infectadas, participando da adsorção às moléculas de heparan sulfato e penetração na membrana celular, além da liberação de vírions.3,4 Mutações virais, com translocação no gene codificador da gB, produzem vírions não infecciosos. Quando a translocação afeta a gB e gD conjuntamente, o vírion efetua a adsorção, mas não penetra a célula.4 Assim sendo, essas três glicoproteínas são o alvo das vacinas anti-herpéticas que pretendem ser imunogênicas e efetivas.4,5,6

Vacinação anti-herpética em perspectiva

As vacinas são um importante aliado da moderna medicina contra as moléstias infecciosas. Diversas doenças foram controladas, ou mesmo erradicadas, graças à introdução da imunização ativa há 200 anos. É notória a erradicação obtida com relação à varíola, além do relativo controle de sarampo, hepatite e coqueluche. Muitas infecções permanecem, no entanto, resistentes às tentativas de controle pela imunização, tais como o herpes simples, tuberculose, hanseníase, esquistossomose e a meningite bacteriana.7

As primeiras tentativas de vacinação anti-herpética utilizavam o vírus morto ou atenuado, após sucessivas passagens em cultura de células. Eram as chamadas "vacinas de primeira geração" e predominaram até o fim da década de 1970. Seguiram-se as "vacinas de segunda geração", valendo-se da observação de que as glicoproteínas de superfície apresentavam potencial imunogênico e grande especificidade biológica.

Existem duas concepções diferentes quanto ao real valor da vacinação anti-herpética. A primeira sugere que a vacinação teria que se concentrar nos indivíduos ainda não infectados, de preferência na população infantil. A outra perspectiva envolve a vacinação dos indivíduos infectados visando transformá-los em portadores sãos da infecção pelo HSV.7 É possível que a primeira estratégia viabilize o controle da moléstia em algumas décadas, bloqueando o ciclo de transmissão a novos hospedeiros, mas é na segunda abordagem que se localizam quase todos os esforços atuais no controle da infecção herpética.

Os componentes da subfamília Alphaherpesviridae, em que se inclui o HSV-1 (herpes extragenital), HSV-2 (herpes genital) e o VZV, representam, no entanto, um problema especial no desenvolvimento de vacinas específicas, pois permanecem latentes no tecido nervoso, que tem mínima capacidade de expressão antigênica.2,7 A proteção física e imunológica que o sistema nervoso proporciona segrega a parcela da população viral que não se ativa no momento de uma recorrência clínica. Admite-se que algumas poucas PFUs (plaque form units) sejam suficientes para deflagrar o herpes recidivante enquanto o potencial infectivo da população neuronal latente é de alguns milhões de PFUs.4 Qualquer pessoa infectada pelos herpes-vírus, virtualmente 95% da população humana, seria facilmente morta por uma reativação maciça de todo seu estoque viral, mas esse fato raramente acontece. A coevolução vírus/hospedeiro cria um binômio indissolúvel para o HSV, pois a morte do hospedeiro exterminaria também o próprio vírus.

Além disso, o HSV é capaz de impedir a ação da IgG anti-HSV e da ativação em cascata do complemento por meio de suas glicoproteínas de superfície, especificamente a gE, gI e gH3. Essa capacidade biológica fez com que muitos pesquisadores do passado não acreditassem na viabilidade de uma vacina anti-herpética, pois, mesmo que anticorpos específicos fossem gerados, não conseguiriam lisar a célula infectada.

Mesmo assim uma vacina profilática efetiva seria extremamente útil antes da introdução de imunossupressores e corticoesteróides, bem como nas fases iniciais de doenças imunodepressoras, como câncer, colagenoses e Aids. Esses pacientes, soronegativos para o HSV e ainda com um sistema imunológico operante, seriam imunizados profilaticamente contra o vírus. Linfócitos circulantes de memória providenciariam a produção de anticorpos específicos para o HSV mesmo em fases avançadas dessas condições mórbidas. O surgimento da Aids, o uso generalizado de corticoesteróides e imunossupressores, além do número cada vez maior de receptores de transplantes, ajudaram a estimular a procura de uma vacina anti-herpética específica.

As primeiras vacinas

Frank8 tentou, já em 1938, efetuar a imunização com o HSV inativado em formalina, observando resultados discretos. Outros estudos similares foram efetuados posteriormente, mas os critérios de melhora clínica foram mal definidos e faltavam os grupos controle utilizando um placebo. O primeiro estudo caso controle sério, envolvendo o acompanhamento da coorte em estudo por até 36 meses, foi efetuado por Kern & Schiff.9 Eles observaram que a melhora no grupo que recebeu o HSV inativado foi de 70%, sendo menor do que a melhora clínica relatada entre os que receberam apenas o placebo (76%). A concepção na época da publicação desse material era de que vacinas anti-herpéticas não funcionariam porque as gEs e gIs impediriam a atuação dos anticorpos anti-HSV. A gH também atuaria bloqueando a ação citotóxica do sistema complemento contra as células doentes (Tabela 1).

Muita discussão acompanhou as avaliações epidemiológicas envolvendo a vacina anti-HSV-1 com vírus inativado pelo calor, a chamada vacina Lupidon. Dundarov e cols.10 descreveram um intervalo maior entre as recorrências, nos indivíduos vacinados, mas essas avaliações foram criticadas por não ter padronizado as vias de administração da vacina, além de haver diversidade muito grande na população estudada.

A primeira evolução real na imunoprofilaxia contra o HSV ocorreu, curiosamente, por razões erradas. Durante a década de 1970, acreditava-se que o HSV-2 poderia ser a causa ou um co-fator importante para o desenvolvimento do carcinoma do colo do útero. Sabe-se hoje que essa função cabe às cepas oncogênicas do HPV, mas, considerando as dúvidas existentes na época, procurou-se sintetizar uma nova vacina anti-herpética que congregasse apenas porções virais importantes na imunogenicidade, evitando, porém, o uso de todo o vírus. Skinner11 sintetizou uma vacina que leva seu nome, em que misturou diversas dessas glicoproteínas, mas não obteve os resultados esperados. Ainda faltavam modelos animais que se assemelhassem ao herpes simples humano e maiores conhecimentos sobre a função da cada glicoproteína de superfície do HSV. Estavam lançadas, no entanto, as bases para as vacinas glicoprotéicas de "segunda geração".

As vacinas de segunda geração

As vacinas glicoprotéicas só se tornaram realidade depois que Stanberry e cols.12 descobriram, em 1991, que os porcos-da-guiné apresentavam sintomatologia clínica e recorrências ao HSV-2 que mimetizavam o quadro do herpes genital em humanos. De forma concomitante, os avanços na biologia molecular permitiram sintetizar, in vitro, glicoproteínas virais. O seqüenciamento completo do genoma do HSV permitiu a clonagem de suas porções extracelulares, deixando-se para trás as porções transmembrana e citoplasmática, que não são imunogênicas.

As glicoproteínas gB e gD do HSV são fundamentais na estimulação da imunidade celular específica, ativando a população de linfócitos citotóxicos.5 Vacinação em cobaias soronegativas para o HSV-1, com um concentrado de glicoproteínas do vírus, sensibilizou linfócitos T a reconhecer a gB e gD, e apresentou ação profilática contra a infecção herpética.13,14 Corey e cols.15 desenvolveram o primeiro estudo multicêntrico com uma vacina baseada nessas duas glicoproteínas e observaram altos títulos de anticorpos neutralizantes específicos para o HSV-2, mas não uma redução significativa da freqüência das recorrências. É provável que a falha parcial se deva à via de inoculação intramuscular utilizada, que pouca ou nenhuma correlação guarda com as vias naturais de infecção do HSV.16 Outra possibilidade é a de que a glicoproteína gerada in vitro fosse uma variante estruturalmente diversa da gB e gD, em que as cadeias alfa e beta se distribuíam de forma diversa do observado na versão in vivo. Sabe-se hoje, após o reconhecimento dos príons, que muitas das propriedades fisiológicas e imunogênicas de uma proteína dependem não só de sua seqüência de aminoácidos, mas de sua conformação espacial.

Outra concepção diferente da vacinação anti-herpética é a terapêutica, com imunização direcionada aos indivíduos já infectados, permitindo imaginar o uso de anticorpos bloqueadores das glicoproteínas envolvidas na adsorção do HSV à membrana celular (gB e gD).17 Seriam úteis, também, anticorpos contra as glicoproteínas associadas com a liberação dos vírions pela célula infectada (gB e gH), transformando o hospedeiro em um portador são da moléstia. Straus e cols.18,19 avaliaram 98 doentes, que experimentavam a média de 10 recorrências/ano, submetendo-os à vacina com gD recombinante. As crises tornaram-se muito menos freqüentes (média de quatro recorrências/ano) no grupo imunizado. Dados semelhantes foram observados por Skinner e cols.,11 Stanberry20,21 e Whitley22 quanto à redução do número de recorrências e sua gravidade, em acompanhamento clínico de até 12 anos. Erturk e cols.23 destacam a proteção cruzada para o HSV-2 obtida após imunização com gD HSV-1, fato explicado pela semelhança antigênica de ambas as cepas. Lupi não conseguiu detectar essa proteção vacinal entre os sorotipos do HSV em estudo epidemiológico na população brasileira.1

Os modelos animais observados por Stanberry12 nos porcos-da-guiné revelaram que fatores exógenos influenciam a eficácia das vacinas glicoprotéicas, incluindo a diluição, a freqüência da vacinação e a glicoproteína utilizada. Um fator importante parece ser o adjuvante escolhido. Trata-se de imunógenos potentes, tais como o muramil-tripeptídeo e o adjuvante de Freund, e ajudam a reforçar a capacidade imunogênica das vacinas. O hidróxido de alumínio, adjuvante barato e de fácil obtenção, é ineficaz contra o HSV.5

É mais comum a existência de portadoras assintomáticas genitais do HSV-2 do que do sorotipo HSV-1, havendo também preponderância do HSV-2 nas recidivas sintomáticas e nos casos de herpes neonatal.22 Esses fatos sugerem maior virulência do HSV-2 na localização perigenital, fato que também trará conseqüências em relação a uma vacina específica. As vacinas de "segunda geração" já passaram pelos ensaios das fases I e II, com cobaias, e já se encontram em fase avançada de estudo clínico em voluntários com herpes genital recorrente.15,24,25 Apesar dos resultados encorajadores, apresentam algumas restrições, como potência imunogênica reduzida e durabilidade curta. Seu custo e eficácia ainda não se comparam aos da terapêutica supressiva utilizando os análogos dos nucleosídeos.

As vacinas gênicas

As vacinas gênicas ou de DNA, ainda em fase de padronização, vêm-se tornando extremamente úteis no combate à infecção pelo HSV.26 A vacina DISC (disabled infectious single cycle) foi desenvolvida com partículas infectivas incapacitadas para mais de um ciclo replicativo.27 Uma cepa do HSV foi modificada, por meio de enzimas de restrição Bam H1 e Not I, de forma a deletar a seqüência genômica codificadora da gH.28 Esse HSV defectivo é cultivado em células Vero, derivadas de células renais de macacos verdes africanos, previamente modificadas para expressar em sua superfície a gH.29,20 A posterior liberação dos vírions DISC pela célula símia produz progênie estruturalmente similar à de um vírion normal do HSV, mas incapaz de produzir todo o ciclo da doença no paciente vacinado.30 Em suma, é um vírus não patogênico, mas capaz de induzir resposta imunológica celular e humoral exatamente como o vírus selvagem sem os riscos incluídos neste último.

A vacina DISC apresenta diversas vantagens interessantes no processo de imunização. Os vírions são incapazes de produzir doença devido à deleção de um gene essencial e podem, portanto, ser inoculados em grande quantidade utilizando-se as mucosas como via de administração,31,32 reproduzindo a via normal de infecção do HSV. Após a inoculação, os vírus DISC induzirão resposta imunológica contra todas as diversas glicoproteínas do envelope do HSV, exceto o gH, e não para algumas poucas pré-selecionadas, como no caso das "vacinas de segunda geração". A opção pela gH deve-se ao fato de essa glicoproteína ser fundamental na estratégia viral de proteçào à célula infectada (Tabela 1); mediante a inibição da cascata de complemento o HSV consegue impedir a citólise imediata do queratinócito infectado, ganhando tempo para promover todo o seu ciclo de replicação parasitário.

Após a imunização, o material genético do HSV é incorporado às células apresentadoras de antígenos, tais como macrófagos e células dendríticas. As partículas do DNA endocitadas, complexadas as moléculas de classe II, do HLA, migram para a superfície celular.31,33 Esses peptídeos de membrana são reconhecidos e ativam a subpopulação de linfócitos T CD4+, cuja principal função é a liberação do g-interferon, molécula dotada de ação antiviral e capaz de recrutar novos linfócitos e macrófagos. Outra parte dos antígenos produzidos não será processada na membrana celular, sendo secretada para fora da célula e estimulando linfócitos B na produção de anticorpos específicos.33 Assim sendo, as vacinas gênicas têm o potencial de estimulação da imunidade celular e humoral, sem os riscos associados às vacinas com organismos vivos.

Animais vacinados com o HSV-1 DISC mostraram proteção estatisticamente significativa contra primoinfecção herpética e quadros recorrentes. Resultados semelhantes foram observados no modelo animal utilizando o HSV-2 DISC (107 PFU), com redução de 98,6% na moléstia recorrente (p<0.0001).30-32 Os porcos-da-guiné demonstraram proteção total contra a primoinfecção pelo HSV. A proteção contra os sintomas da moléstia chegaram 100% após o segundo e terceiro reforços (p< 0.0001 em ambos os casos).32,33

Uma segunda variante do HSV DISC também vem sendo testada nas situações em que os genes virais ICP-27 e ICP-28 são deletados.34 As proteínas codificadas por ambos são fundamentais nas fases mais tardias do ciclo de replicação do HSV. Vacinas gênicas DISC utilizando essa variante permitem a replicação do vírus até uma certa etapa; as proteínas virais que chegam a ser codificadas são suficientes para estimular uma resposta imune específica.

 

CONCLUSÃO

As vacinas anti-herpéticas ainda não são uma realidade disponível para o uso clínico rotineiro, mas seu estudo tem contribuído de forma decisiva para o surgimento de novas tecnologias em imunoprofilaxia. As correlações entre o HSV e o hospedeiro humano também são muito mais bem entendidas atualmente, abrindo caminho para novas formas de tratamento das moléstias virais.

 

AGRADECIMENTOS

Este trabalho foi desenvolvido com o auxílio de bolsa de pós-doutorado no exterior (PDE) concedida pelo CNPq (processo 200868/00-4), bem como de licença remunerada concedida pela UFRJ e UNIG.

 

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Endereço para correspondência
Omar Lupi
University of Texas Medical Branch (UTMB) - Sealy Center for Vaccine Development
301 University Boulevard - Mary Moody Northern Pavilion, Room 3.206 Galveston/TX
Zip Code: 77555-0436 - USA
Tel: +1-409-747-8153 Fax: +1-409-747-8150
E-mail: omrosasa@utmb.edu, lupiomar@hotmail.com

Recebido em 13.08.2001.
Aprovado pelo Conselho Consultivo e aceito para publicação em 17.04.2002.

 

* Trabalho realizado no Sealy Center for Vaccine Development. University of Texas Medical Branch (UTMB) at Galveston/ Texas - USA.