Variabilidad de Puccinia sorghi en la zona maicera núcleo Argentina

Variability of Puccinia sorghi in the core corn-growing region of Argentina

SHORT COMMUNICATION COMUNICAÇÃO

Mirian del Pilar Gonzalez^I; Guillermo Eyherabide^II; Irma Graciela Laguna^{II I}

^IFacultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Rosario, CC14, 2125 Zavalla, Argentina

^IIInstituto Nacional de Tecnología Agropecuaria - INTA, CC 17, 2700 Pergamino, Argentina

^IIIInstituto de Fitopatología y Fisiología Vegetal, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria - INTA, Córdoba, Argentina

RESUMEN

La roya común causada por Puccinia sorghi es una de de las enfermedades endémicas de maíz (Zea mays) en Argentina. Se presenta cada año con diferentes niveles de severidad dependiendo del genotipo del hospedante, el biotipo del patógeno y las condiciones ambientales. Se estima una pérdida en el peso del grano entre 3 y 8% por cada 10% del total de área afectada. P. sorghi es un hongo heteroico que completa su ciclo en un hospedante alternativo: Oxalis spp. El ciclo completo se produce en las regiones con inviernos favorables. El objetivo de este estudio fue describir los factores involucrados en la virulencia del patógeno en la interacción Zea mays-Puccinia sorghi. Usando isolíneas Rp se identificaron 10 patotipos de P. sorghi, a partir de 16 aislamientos de diferentes localidades de la Provincia de Santa Fe (Oliveros, Venado Tuerto and Zavalla) y Buenos Aires (Pergamino). Se detectaron polimorfismos en el ADN por la metodología de RAPD en los diferentes aislamientos de P. sorghi. Estos experimentos muestran la heterogeneidad genética del patógeno en esta zona. Se determinó un alto consenso (81,4%) entre los resultados obtenidos a través de las isolíneas Rp y RAPD.

Palabras-clave:Zea mays, Oxalis spp., RAPD, roya común, Rp lines.

ABSTRACT

Common rust caused by Puccinia sorghi is one of the endemic diseases of corn in Argentina. It appears every year with different levels of severity depending on the genotype of the host, the biotypes of the pathogen, and the environmental conditions. Estimates of grain weight losses ranged from about 3 to 8% for 10% of the total leaf area affected. P. sorghi is a heteroic fungus that completes its cycle on an alternative host, Oxalis spp. Its complete cycle is feasible in mild winter regions around the world. The objective of this study was to describe the factors involved in the virulence of the pathogen in the interaction Zea mays-Puccinia sorghi. Using Rp isolines, 10 pathotypes of P. sorghi were identified from 16 isolates obtained from different locations in the provinces of Santa Fe (Oliveros, Venado Tuerto and Zavalla) and Buenos Aires (Pergamino). Polymorphisms in the DNA of the different isolates of P. sorghi from this core corn-growing region of Argentina were detected by RAPD methodology. These experiments showed the genetic heterogeneity of the pathogen in this area. A high consensus rate was determined (81.4 %) between the results obtained from the virulence biotypes and the results obtained by RAPD.

Key words:Zea mays, Oxalis spp., common rust, RAPD, Rp lines.

La "roya común" causada por Puccinia sorghi Schwein., se presenta todos los años en la región productora núcleo de maíz, en Argentina, con diferentes niveles de severidad (Gonzalez et al., 2009); la cual depende del genotipo del hospedante, la virulencia del patógeno y las condiciones ambientales. Los síntomas de la enfermedad se manifiestan por la presencia de urediniosoros con urediniosporas. Es un patógeno policíclico, cada ciclo tarda aproximadamente 10 días Al final del cultivo del maíz aparecen los teliosoros con teliosporas. Esta enfermedad se puede presentar en las primeras hojas nacidas, alcanzando su máxima expresión en las 4 semanas posteriores a la antesis. Sobre Oxalis spp. se producen los estadíos picnico y aescidico. Se estimaron reducciones de peso del grano entre 3 a 8% por cada 10% del total de área foliar afectada (White, 1999). En estados Unidos de Norte América se determinó la existencia de varias razas de Puccinia sorghi utilizando líneas isogénicas con genes Rp para monitorear la virulencia en las poblaciones del patógeno (Hulbert et al., 1991; Groth et al., 1992, Hu et al., 1997). Una nueva raza de P. sorghi quebró la resistencia del gen Rp1D (Pataky & Pate, 2001; Pataky & Campana, 2007). En Brasil, Von Bülow (1967) determinó la existencia de 13 razas del patógeno usando isolíneas Rp. En Argentina desde los trabajos de virulencia de Vallega (año?) con líneas experimentales de maíz (Gonzalez, 2007), no se reportaron nuevos trabajos hasta el año 1998 en el que se realizaron experimentos de campo utilizando por primera vez en el país líneas con genes Rp (Gonzalez, 2000). Pataky et al. (2001) evaluaron en campo la severidad de este patógeno en cultivares de maíz dulce con genes Rp1D en Argentina, México, Sudáfrica y Hawai. La profundización en el conocimiento de las razas, sus frecuencias y la evolución de de la virulencia de éstas podría ser útil para el desarrollo de nuevos cultivares resistentes.

Para Puccinia sorghi no se encontró ningún reporte de estudio de patotipos a nivel molecular. Villaréal et al. (2002) evaluaron la variabilidad genética por AFLP en la población de Puccinia striiformis f. sp. tritici en Francia. Steele et al. (2001) combinaron técnicas de RAPD y AFLP para determinar la variación a nivel molecular de diferentes aislamientos de Australia, Nueva Zelandia, Reino Unido, Dinamarca y Colombia. El objetivo de este trabajo fue determinar la variabilidad para la virulencia de la población de Puccinia sorghi en Argentina sobre isolíneas Rp, caracterizar la variabilidad a nivel molecular y analizar la semejanza entre los patotipos y los fenotipos moleculares.

Para determinar la variabilidad en la virulencia de P. sorghi en líneas Rp se recolectaron hojas de maíz con urediniosoros en lotes comerciales de las localidades de Oliveros, Pergamino, Zavalla y Venado Tuerto. De las hojas obtenidas de cada localidad, en forma individual se recortaron trozos con urediniosoros, se tomaron 20 trozos y se colocaron en un asperjador con 100 cc de agua bidestilada y 2 gotas de tween 20. En invernadero, en macetas de 14 cm se colocó una mezcla de tierra y perlita de lava volcánica, se sembraron semillas de un híbrido comercial de maíz de alta susceptibilidad. Las plantas fueron periódicamente fertilizadas con el agua de riego, utilizándo fertilizante triple 15 (N: 15, P: 15 y K: 15). Cuando estas plantas tuvieron 2 a 4 hojas se inocularon y fueron colocadas en cámara húmeda por 24 hs, la temperatura varió entre 16 y 25°C. A los 10 días se seleccionaron 4 urediniosoros de cada una de las plantas y se inocularon con el auxilio de un pincel mojado en agua y tween 20. La inoculación se realizó en 5 plantas por maceta para cada urediniosoro. Así se obtuvo un aislamiento a partir de un solo soro. Los aislamientos obtenidos fueron: Oliveros (O1 a O4), Pergamino (P1 a P4), Zavalla (Z1 a Z4) y Venado Tuerto (V1 aV4). Se realizaron inoculaciones posteriores para multiplicar las urediniosporas. Con cada uno de los 16 aislamientos se inocularon de 5 a 10 plantas de cada isolínea con los genes Rp (rp1, Rp1D, Rp1E, Rp1G, Rp1H, Rp1N, Rp3, Rp4A y Rp1GFJ). Las isolíneas fueron proporcionadas por el Dr. Jerald Pataky (Dep. Crop Sc. Unersity of Illinois) y por el Dr Scott Hullbert (Univ. of Kansas, US). Todas las isolíneas tienen un gen mayor. En algunas de ellas intervino como progenitora la línea R 168 o H 95. Las plantas se inocularon luego de 10 días de la siembra, manteniendo las mismas condiciones en la siembra e invernadero. Se utilizo un DCA. Se repitió este experimento 2 veces. En la evaluación realizada a los 10 días de la inoculación se determinó como positiva la reacción de aquellas plantas que mostraron susceptibilidad con urediniosoros bien desarrollados y como negativa, las plantas que presentaban resistencia manifestada con pequeños puntos cloróticos o no presentaban síntomas. Se elaboró una tabla de contrastes colocando 0 cuando no se presentaba infección y 1 cuando aparecieron urediniosoros. Los resultados se colocaron en una matriz básica de datos que fue procesada en el programa PC-Ord para el análisis multivariado. (McCune & Mefford, 1990). Se realizó el análisis de componentes principales (PCA) usando matriz de variancia-covariancia, con el objeto de establecer la estructura general de los datos para visualizar si se ubican al azar en el plano determinado por los primeros ejes o si es observable alguna tendencia; y el agrupamiento Cluster Analysis, mediante el método de Ward y la distancia euclídea como medida de disimilitud, para establecer si las muestras se agrupan en función de algún patrón.

En el estudio de la variabilidad a nivel molecular, se utilizaron los mismos aislamientos con los que se determinaron los biotipos del patógeno. La recolección de las urediniosporas se realizó con una bomba de vacío. La extracción del ADN se realizó a través del método utilizado por Chen et al. (1993) modificado por Gonzalez (2007), colocando en un mortero entre 20 y 30 mg de urediniosporas que se mezclaron con igual cantidad de arena y se molieron suavemente hasta convertirlas en un polvo fino. Luego, cada muestra se trasvasó a entubo de 2 µL agregándole 800? µL de buffer de extracción 1 X (0.1 mL de TrisCl pH 7.5 (1 M), 0.14 mL de NaCl 5 M, 0.1 mL de EDTA pH 8 0.5 M y 0.46 mL de agua UP) y se agitó en un vortex. Se incubó durante 10 minutos en un baño a 65ºC. Posteriormente se agregaron 100? µL de CTAB 10%, se homogeneizó en el vortex y se adicionaron 100 µL. de SDS 20%, se mezcló la suspensión por suave inversión manteniéndose a 65ºC en baño de inmersión con agitación durante 45 minutos. Después se agregaron 950? µL de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) mezclándose por suave inversión del tubo durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se centrifugó por 25 minutos a 14.000 rpm. El sobrenadante se trasvasó a un nuevo tubo, se colocaron 10 µL de ARNasa 10% y se dejó a 37ºC durante 90 minutos aproximadamente. Posteriormente, se adicionó igual volumen de cloroformo- alcohol isoamílico. Se mezcló por inversión del tubo durante 10 minutos y se centrifugó 20 minutos a 14.000 rpm. Al sobrenadante se agregó el 60% del volumen de isopropanol frío dejándolo reposar por 10 minutos y luego se centrifugó por 10 minutos a 14.000 rpm. Luego de descartar el sobrenadante, el pellet se lavó con 1 mL de alcohol 70%. Se volvió a centrifugar, se descartó el alcohol y se dejó secar el pellet resuspendiéndolo en 50 µL de agua HPLC. La concentración de ADN obtenido de cada muestra se determinó por medición espectrofotométrica de la absorbancia (Abs) a 260 nm y la pureza se evaluó mediante el índice de Abs 260 nm / Abs 280 nm (121). La integridad del ADN genómico se evaluó por la presencia de una banda de alto peso molecular mediante electroforesis en gel de agarosa a 0,7% en 1X de buffer TAE (40 mM Tris, 5 mM acetato de sodio y 0,77 mM EDTA) a 40 mA, en sistema sumergido y teñidos con bromuro de etidio (Stambrook et al., 1989). Una vez cuantificados todos los ADN, fueron llevados a una concentración stock de 300 ng/µL. Se utilizaron soluciones de trabajo a una concentración de 5 ng/µL. El análisis de RAPD fue desarrollado a partir de 16 cebadores arbitrarios decaméricos (Operon Technologies, USA), los cuales fueron seleccionados por su repetibilidad y polimorfismo a partir de un total de 115. Las secuencias de los 16 cebadores fueron: OPA-18(AGGTGACCGT), OPP-13(GGAGTGCCTC), OPL-12(GGGCGGTACT), OPN-04(GACCGACCCA), OPN-11(TCGCCGCAAA), OPI-14(TGACGGCGGT), OPI-16(TCTCCGCCCT), OPI-17(GGTGGTGATG), OPK-04(CCGCCCAAAC), OPK-19(CACAGGCGGA), OPI-06(AAGGCGGCAG), OPI-20(AAAGTGCGGG), OPI-07 (CAGCGACAAG), OPI-07(CAGCGACAAG), OPI-09(TGGAGAGCAG), OPF-09(CCAAGCTTCC) y OPH-03(AGACGTCCAC). Cada reacción de amplificación fue realizada en un volumen de 20 µL, constituido por 10X PCR Buffer (Invitrogen) + BSA, 2,5 µM de cada uno de los dATP, dCTP, dGTP y dTTP (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); 15 ng/µL de primer, 50 mM Cl₂Mg, 5u/µL de Taq DNA Polymerasa (Promega, Madison, WI) y agua HPLC. La PCR fue llevada a cabo en un termociclador marca Eppendorf, modelo Mastercycler gradient con el siguiente programa de ciclado: Desnaturalización a 94ºC por 1 minuto, 30 ciclos de desnaturalización a 93ºC 15 segundos, hibridación a 36ºC 30 segundos, extensión a 72ºC 1 minuto y 30 segundos y extensión final a 72ºC 10 minutos. Después de la amplificación 5 µL de cada muestra fue sometida a electroforesis en gel de agarosa a 1,6% en una solución buffer TBE (0,089 M Tris-borato, 0,089M de ácido bórico y 0,002 M de EDTA) a 0,5%. Se usó marcador de peso molecular de 1- Kb (0,15 µg) (Invitrogen) para estimar el tamaño de cada fragmento de ADN amplificado. La electroforesis se realizó a 50 V durante 90 minutos. El gel fue teñido con bromuro de etidio (0,5 µg / mL) durante 15 minutos y fotografiado con luz ultravioleta. Cada banda se registró como presente o ausente para obtener una matriz binaria básica de datos que incluyó los aislamientos fúngicos estudiados. Este experimento se repitió 2 veces. El análisis de variación molecular se realizó utilizando el coeficiente de similitud Simple Matching Coefficient. Los datos se analizaron a través de análisis de agrupamiento con el método UPGMA, utilizando el programa NTSYS 2.0 (Exeter Software, Setauket, NY). Con el fin de determinar la asociación de los tipos de virulencia con los patrones de RAPD se comparó la similitud o correspondencia entre la matriz obtenida por medio de las isolíneas Rp y aquella conseguida por medio de la técnica de RAPD. Se utilizó el programa Procrustes Generalizado del paquete estadístico Info -Gen, Software para el análisis estadístico de datos genéticos (Balzarini & Di Rienzo, 2003)

De la evaluación de las isolíneas se identificaron 10 patrones de virulencia (patotipos) a partir de 16 aislamientos, considerando el 100% de similaridad. No hubo diferencia entre patrones de virulencia por localidad. El análisis de componentes principales no reveló ninguna tendencia y los aislamientos aparecieron distribuidos al azar en las localidades. Los resultados del análisis y las pruebas de virulencia se muestran en la Figura 1. Con los 16 cebadores seleccionados por su repetibilidad y grado de polimorfismo entre los 115 evaluados, fueron analizadas 38 bandas polimórficas. Se obtuvo el dendrograma de la Figura 2, donde se observan 15 fenotipos moleculares a partir de 16 aislamientos del patógeno. Al comparar la concordancia entre fenotipos moleculares y tipos de virulencia se observó una alta correlación entre ambas matrices (81,4%).

Los resultados obtenidos en este trabajo establecen la presencia de 10 patotipos de Puccinia sorghi a partir de 16 aislamientos de este hongo, obtenidos en la zona núcleo maicera en Argentina. Estos resultados confirman la hipótesis planteada en trabajos de campo realizados previamente con líneas poseedoras de los genes Rp, en los que solo 5 isolíneas (Rp 1J, M, N; Rp3 A y C) de 23 eran resistentes a la poblacion de P. sorghi. (Gonzalez, 2000). Todos los patotipos presentes fueron virulentos a Rp 1D. Esto también ocurrió en Estados Unidos, en donde, trabajos hechos hasta 1998 encontraron pocos patotipos en la población local de P. sorghi y ninguno afectaba a Rp 1 D (Hulbert et al., 1991; Groth et al., 1992, Hu et al., 1997). Al pasar los años hay mayor cantidad de líneas Rp susceptibles a la población patógena. Es decir que la variación de las poblaciones se encuentra en constante progreso. Una nueva raza de P. sorghi apareció en 1999 y quebró la resistencia del gen Rp1D (Pataky & Pate, 2001; Pataky & Campana, 2007). Así, a partir del año 2000, con la idea de probar la resistencia de los híbridos de maíz dulce con genes Rp1D, Pataky et al. (2001) evaluaron la severidad de este patógeno frente a los patotipos presentes en Argentina, México, Sudáfrica y Hawai. Para el sur de Brasil, Von Bülow (1967), determinó 13 biotipos partiendo de 6 localidades con 6 líneas diferenciales de genes Rp, utilizando igualmente aislamientos monosóricos, lo que confirma la existencia de alta variabilidad también para Brasil. Según Hu et al., 1997, la combinación de alelos tales como Rp 1 DJ confieren resistencia parcial, o sea que dejarían de comportarse como genes que otorgan resistencia vertical y son más eficientes frente a las razas. En este trabajo al probarse líneas con varios genes, también se encontró mayor efectividad y esta combinación sería eficiente contra varios biotipos. La situación epidemiológica varía entre Estados Unidos y el hemisferio sur donde encontramos Oxalis spp. en invierno, por lo tanto, se produce el ciclo completo y se encuentra una alta variabilidad del hongo en general y también de la virulencia. En el cinturón maicero de Estados Unidos, la aparición de nuevas razas es mucho más lenta y las nuevas razas llegan del sur, desde la zona maicera de México

Los marcadores de tipo RAPD (Random Amplified polymorphic DNA) son especialmente útiles para el análisis de parásitos obligados por la escasa cantidad de ADN requerido para la amplificación: 200 ng de ADN (Chen et al., 1993). Esta cantidad de ADN se puede obtener a partir de 20 y 30 mg de urediniosporas. No se registra bibliografía relacionada a estudios de la variabilidad de P. sorghi por ninguna de estas técnicas moleculares propuestas para otras especies del mismo género. En el presente trabajo, utilizando el método de RAPD fueron detectados una gran cantidad de polimorfismos en el ADN de los diferentes aislados de Puccinia sorghi provenientes de la zona maicera núcleo, mostrando la gran heterogeneidad genética del patógeno entre los aislamientos de las cuatro localidades analizadas. Se obtuvieron 15 fenotipos moleculares a partir de los 16 aislamientos utilizados. Wingfield et al. (2004) evaluaron los géneros más antiguos de royas en relación con los más evolucionados. Utilizando técnicas como el AFLP, Villaréal et al. (2002) evaluaron la variabilidad genética en la población de Puccinia striiformis f. sp. tritici en Francia. Steele et al. (2001) determinaron gran variación molecular en Australia y Nueva Zelanda. En nuestro trabajo encontramos un alto consenso (81,4%) entre la matriz obtenida a partir de isolíneas Rp y la obtenida por RAPD. Otros investigadores como Chen et al. (1993), con Puccinia striiformis encontraron una correlación de 20,6%. En general la baja asociación entre patrones de virulencia y RAPD para la mayoría de los casos citados en la bibliografía, indicaría que los polimorfismos de ADN registrados podrían ser independientes de la virulencia y que la selección por virulencia sobre hospedantes con resistencia raza-específica juega un rol importante en la determinación de las estructuras de raza del patógeno. La profundización en el conocimiento de los patotipos, sus frecuencias y la evolución de éstos podría ser útil para el desarrollo de nuevos cultivares resistentes. Estas consideraciones que refuerzan la importancia del uso de resistencia parcial, deberían ser tenidas en cuenta por los fitomejoradores, sobre todo en el momento de realizar la evaluación de líneas ya que los biotipos presentes varían con la región y en el tiempo.

Recebido 16 Noviembre 2009

Acceptado 20 Junio 2011

Autor para correspondencia: Mirian del Pilar Gonzalez, e-mail: [e-mail]

TPP 48

Editor de Sección: Carlos R. Casela

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Variabilidad de Puccinia sorghi en la zona maicera núcleo Argentina

Variability of Puccinia sorghi in the core corn-growing region of Argentina

Fechas de Publicación

• Publicación en esta colección
  24 Ago 2011
• Fecha del número
  Jun 2011

Histórico

• Recibido
  16 Nov 2009
• Acepto
  20 Jun 2011