Uso de fluorescência em um método de dissector modificado para estimar o número de miócitos no tecido cardíaco

Resumos

BACKGROUND: Conventional disector methods currently require considerable financial, technical and operational costs to estimate the number of cells, including cardyomyocytes, in a 3D area. OBJECTIVE: To use fluorescence microscopy in a modified disector method to determine the number of myocytes in cardiac tissue in normal and pathological conditions. METHODS: The study employed four-month-old male Wistar rats with weight of 366.25 ± 88.21g randomized in control (CG, n=8) and infected (IG, n=8) groups. IG animals were inoculated with T. cruzi Y strain (300,000 trypomastigotes/50g wt). After eight weeks, the animals were weighted and euthanized. The left ventricles (LV) were removed for stereological analysis of numerical density of cardiomyocytes (Nv[c]) and total number of these cells in the LV (N[c]). These parameters were estimated using a fluorescent disector (FD) and compared with the conventional optical (OD) and physical (PD) disector methods. RESULTS: In both disector methods, IG animals presented significant decrease of Nv[c] and N[c] compared to CG animals (P< 0.05). There was no significant difference in these variables despite the disector method applied in CG and IG animals (P> 0.05). A strong correlation, equal or above 96%, was obtained between FD, OD and PD. CONCLUSION: The FD method seems to be equally reliable to determine Nv[c] and N[c] in normal and pathological conditions and presents some advantages compared to conventional disector methods: reduction of histological slices and images in the stereological analysis, reduction of time to analyze the images, construction of FD in simple microscopes using the epifluorescence mode, distinction of disector planes in lower magnifications.

Cell separation; flow cytometry; myocytes, cardiac

FUNDAMENTO: Métodos convencionales de disector actualmente requieren considerables costos financieros, técnicos y operativos para estimar el número de células, incluyendo cardiomiocitos, en un área de 3D. OBJETIVO: Usar la microscopia de fluorescencia en un método de disector modificado para determinar el número de miocitos en el tejido cardíaco en condiciones normales y patológicas. MÉTODOS: El estudio empleó ratones Wistar machos de cuatro meses de edad y peso de 366,25 ± 88,21 g randomizados en grupos controles (GC, n = 8) e infectados (GI, n = 8). Los animales del GI fueron inoculados con cepa Y de T. cruzi (300.000 tripomastigotas/50 g). Después de ocho semanas, los animales fueron pesados y sacrificados. Los Ventrículos Izquierdos (VI) fueron removidos para análisis estereológico de la densidad numérica de cardiomiocitos (Nv [c]) y el número total de esas células en el VI (N [c]). Esos parámetros fueron estimados usando un disector fluorescente (FD) y comparados con los métodos convencionales de disector óptico (OD) y disector físico (PD). RESULTADOS: En ambos métodos de disector, los animales del GI presentaron caída significativa de Nv[c] y N[c] en comparación con los animales del GC (P > 0,05). Una correlación fuerte, igual o superior a 96%, fue obtenida entre FD, OD y PD. CONCLUSIÓN: El método FD parece ser igualmente confiable para determinar Nv[c] y N[c] en condiciones normales y patológicas, presentando algunas ventajas en relación a los métodos convencionales de disector: reducción de cortes histológicos e imágenes en el análisis estereológico, reducción del tiempo de análisis de las imágenes, la construcción de FD en microscopios simples, utilizando el modo de epifluorescencia, distinción de planos de disector en ampliaciones inferiores.

Cardiomiocitos; corazón; microscopía de fluorescencia; morfología

Uso de fluorescência em um método de dissector modificado para estimar o número de miócitos no tecido cardíaco

Rômulo Dias Novaes^I; Arlete Rita Penitente^I; André Talvani^II; Antônio José Natali^I; Clóvis Andrade Neves^I; Izabel Regina Santos Costa Maldonado^I

^IUniversidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG, Brasil

^IIUniversidade Federal de Ouro Perto, Ouro Preto, MG, Brasil

^{Correspondência}

RESUMO

FUNDAMENTO: Métodos convencionais de dissector atualmente requerem consideráveis custos financeiros, técnicos e operacionais para estimar o número de células, incluindo cardiomiócitos, em uma área de 3D.

OBJETIVO: Usar a microscopia de fluorescência em um método de dissector modificado para determinar o número de miócitos no tecido cardíaco em condições normais e patológicas.

MÉTODOS: O estudo empregou camundongos Wistar machos com quatro meses de idade e peso de 366,25 ± 88,21 g randomizados em grupos controles (GC, n = 8) e infectados (GI, n = 8). Os animais do GI foram inoculados com cepa Y de T. cruzi (300.000 tripomastigotas/50 g). Após oito semanas, os animais foram pesados e sacrificados. Os Ventrículos Esquerdos (VE) foram removidos para análise estereológica da densidade numérica de cardiomiócitos (Nv [c]) e o número total dessas células no VE (N [c]). Esses parâmetros foram estimados usando um dissector fluorescente (DF) e comparados com os métodos convencionais de dissector óptico (DO) e dissector físico (DFi).

RESULTADOS: Em ambos os métodos de dissector, os animais do GI apresentaram queda significativa de Nv[c] e N[c] em comparação com os animais do GC (P > 0,05). Uma correlação forte, igual ou superior a 96%, foi obtida entre DF, DO e DFi.

CONCLUSÃO: O método DF parece ser igualmente confiável para determinar Nv[c] e N[c] em condições normais e patológicas, apresentando algumas vantagens em relação aos métodos convencionais de dissector: redução de cortes histológicos e imagens na análise estereológica, redução do tempo de análise das imagens, a construção de DF em microscópios simples, utilizando o modo de epifluorescência, distinção de planos de dissector em ampliações inferiores.

Palavras-chave: separação de células, citometria de fluxo, miócitos cardíacos.

Introdução

Nos últimos anos, grandes esforços foram envidados para desenvolver um método confiável e reprodutível para estimar o número de partículas em órgãos e tecidos, mas até 1984, todos esses métodos apresentavam vieses intrínsecos^1-3. Em 1984, Sterio descreveu diversas modificações nas abordagens utilizadas para estimar a quantidade de objetos no espaço tridimensional e introduziu o método de dissector⁴. A maioria dos autores atualmente considera o método de dissector imparcial e fundamentos teóricos bem estabelecidos fazem que o método seja amplamente aceito^5-7.

O dissector pode ser obtido por dois métodos diferentes com base nos mesmos princípios teóricos e requisitos básicos para estimar o número de partículas. Esses métodos são o dissector óptico e o dissector físico^4,8-10. Embora ambos os métodos possuam vieses reduzidos quanto à estimativa da quantidade de partículas, eles ainda exigiam a aquisição de um grande número de imagens histológicas e muito tempo para realizar as contagens. Particularmente, o dissector óptico também requer um microscópio de luz de alto custo adaptado com fase móvel do eixo Z¹¹. Além disso, o dissector físico é extremamente trabalhoso, pois requer cortes e imagens histológicas com um perfeito alinhamento em diferentes cortes paralelos^3,10.

Considerando que o objetivo do projeto de amostragem para a estereologia é obter a quantidade máxima de informações estruturais quantitativas a um determinado custo ou esforço, o objetivo deste estudo foi a utilização de microscopia de fluorescência em um método de dissector modificado para determinar o número de miócitos no tecido cardíaco em condições normais e patológicas. Assim, um modelo murino de infecção por T. cruzi, que reconhecidamente leva à ruptura de miócitos cardíacos e modifica o número dessas células no miocárdio, foi utilizado¹². Nossa hipótese é a de que o método proposto reduziria o custo operacional observado em métodos convencionais, mantendo a precisão das medições de quantidade de células.

Métodos

Animais e os grupos experimentais

Camundongos Wistar machos com quatro meses de idade com peso inicial de 366,25 ± 88,21 g receberam ração para roedores e água ad libitum, e foram mantidos em instalações animais em um ambiente controlado (temperatura a 22 ± 3 ºC, umidade a 60% - 70% e ciclos invertidos de luz/escuridão de 12 horas). Os tamanhos das amostras foram determinados considerando a probabilidade p = 1/2 de ocorrer aumento ou diminuição das variáveis de interesse. Assim, considerando o nível de significância α = 0,05, o número mínimo significativo de animais utilizados na análise estatística foi: p = (02/01)^eventos; portanto, se n = 5, p = (1/2)⁵ ou p = 0,03; então, P < 0,05¹⁰. Devido à variabilidade intrínseca do parasitismo em órgãos-alvo e à mortalidade associada à infecção por T. cruzi, um fator de correção de 50% foi incorporado ao cálculo inicial, determinando amostras de oito animais, aleatoriamente alocados nos grupos controle (GC, n = 8) e infectados (GI, n = 8).

Infecção

Animais do GI foram inoculados intraperitonealmente com cepa Y de T. cruzi (300.000 tripomastigotas/peso corporal de 50 g em 1 mL de sangue de camundongos infectados¹³. A infecção foi confirmada quatro dias pós-inoculação pela presença de tripomastigotas no sangue periférico coletado da cauda do camundongo, como descrito por Brener¹⁴. Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com o Colégio Brasileiro de Experimentação Animal, e aprovados pela Comissão de Ética em Pesquisa de Animais do Departamento de Veterinária da Universidade Federal de Viçosa, Brasil (protocolo número 30/2009).

Análise biométrica

Oito semanas após a inoculação, os animais foram sacrificados sob anestesia e os corações foram removidos. Os Ventrículos Esquerdos (VE) foram dissecados e pesados separadamente. Volume do VE foi obtido pelo método de imersão, onde o deslocamento líquido do volume do órgão foi pesado. Como a gravidade específica (Σ) da solução salina isotônica é 1,0048, o volume é obtido por: volume = peso/Σ, ou simplesmente volume (10³ mm³) ≈ peso (g)¹⁵. O peso e volume do VE foram determinados incluindo o septo interventricular.

Processamento de tecidos e determinação de áreas histológicas

Os átrios e ventrículos foram colocados em fixador histológico por 48 horas (preparado na hora com 10% w/v de formaldeído em 0,1 M de tampão fosfato pH 7.2)^16,17. Fragmentos do VE foram obtidos através do método orientador para definir cortes aleatórios isotrópicos e uniformes (IUR) exigidos no estudo estereológico³. Esses fragmentos foram desidratados em etanol, diafanizadas em xilol e fixados em parafina. Os blocos foram cortados em cortes de 3 µm e corados por hematoxilina-eosina (H & E) ou 4',6-diamidino-2-fenilindol em 0,2% (DAPI)¹⁸.

O número representativo de dissectores utilizados na análise estereológica para cada animal foi determinado considerando-se a estabilização do coeficiente de variação (CV) do número de núcleos de miócitos amostras aleatórias crescentes de dissectores (5, 10, 15, 20 e 25). Então, a média aritmética e os respectivos CV para cada tamanho de amostra foram calculados. Quando o aumento de números de dissectores resultou em nenhuma diferença significativa de CV entre três amostras consecutivas, o menor tamanho de amostra foi considerado como o tamanho mínimo representativo¹⁹. Usando esse método, a variação do número de núcleos de miócitos estabilizou-se a partir da amostra de 10 dissectores.

Métodos de dissector ópticos e físicos

Cortes corados com H&E foram montados em lâminas histológicas utilizando o meio de montagem Entelan^® (Merk, Darmstadt, Alemanha) e as imagens foram capturadas usando um microscópio de luz (Olympus BX-60^®, Tóquio, Japão) conectado a uma câmera digital (Olympus QColor-3^®, Tóquio, Japão). A observação foi feita com uma objetiva planacromática de 100× de imersão a óleo (NA= 1,25) para identificar claramente as fronteiras dos núcleos de cardiomiócitos (cmyn)^16,17.

O número de núcleos de cardiomiócitos (cmyn) em uma sonda tridimensional foi estimado utilizando os métodos de dissector óptico (DO) e físico (DFi)³. O dissector consiste de dois planos paralelos destinados a fazer a amostragem dos "pontos superiores" das partículas presentes entre os dois. O volume de amostragem foi criado com dois cortes paralelos separados por 3 µm (h) e 2 planos de referência ambos contendo um suporte de ensaio (A_T). Em ambos os métodos de dissector, um par de fotomicrografias separados pela distância h é usado para formar os dois planos de referência. No DO, as fotomicrografias paralelas são obtidas na mesma área histológica ajustando o plano focal (h= 3 µm), utilizando o parafuso micrométrico. No DFi, dois cortes seriais são obtidos no micrótomo (h = 3 µm) e a mesma área histológica é fotografada em ambos os cortes, fornecendo duas fotomicrografias fisicamente separadas.

Método de dissector fluorescente

No método de dissector fluorescente (DF), os cortes corados com DAPI foram montados em lâminas histológicas utilizando solução de sacarose de 50% em água destilada (w/v). As imagens foram capturadas em um modo de epifluorescência do mesmo microscópio usando uma lâmpada de mercúrio HBO 100 e um filtro para excitação do pigmento a 365 nm e emissão de luz a 460 nm. A observação foi feita com as mesmas lentes planacromáticas de 100× descritas anteriormente. Nesse método, usando os cortes 3 µm (h), os dois planos de referência necessários para delimitar o dissector são obtidos em uma imagem única e pares de fotomicrografias não são necessários como no método convencional. Além disso, o cmyn presente sobre a espessura do corte pode ser observado dentro ou fora do plano focal. Para evitar a contagem repetida de células, os cortes foram obtidos em semisséries utilizando 1 em cada 20 cortes. O DF foi adicionalmente obtido com uma lente objetiva de 40× apenas para demonstrar a possibilidade de aplicar o método usando ampliações menores.

Estimativa da densidade numérica e número total de cardiomiócitos

A densidade numérica do cmyn (Nv[c], cmyn por mm³) foi determinada a partir de 10 pares aleatórios de dissectores para cada animal, definidos como Nv[c] = Q^-[cmyn] / h×AT, onde Q^- representa o número de perfis de cmyn contados na área de teste na seção de referência do dissector (plano look-up)^3,17. No DF, o valor Q^- na fórmula Nv[c] foi multiplicado por um fator de correção de 0,5 para evitar a superestimação das medidas. O número total de cmyn no VE (N[c]) foi estimado como o produto do volume Nv[c] / VE. As contagens foram realizadas em A_T= 2.670 µm². Todas as análises estereológicas foram realizadas utilizando o software Image Pro-Plus 4.5^® (Media Cybernetics, Silver Spring, EUA).

Análise estatística

Todas as análises foram realizadas utilizando a plataforma estatística GraphPad Prism (versão 5.01, GraphPad Software, San Diego, CA). Os dados são expressos como média e desvio padrão (média ± DP). A normalidade da distribuição dos dados foi verificada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Com base nesse teste, os dados de peso e volume foram comparados com o teste t. O teste U de Mann-Whitney foi usado para comparar os dados estereológicos entre os grupos. Os métodos de dissector foram comparados pelo teste de Kruskal-Wallis e correlacionados utilizando o método de Spearman. A significância estatística foi estabelecida em α=0,05.

Resultados

Não houve diferença estatística na massa corporal (GC, 502,17 ± 57,76 g vs. GI, 494,69 ± 87,90 g; p > 0,05) e volume do ventrículo esquerdo (GC, 456,47 ± 26,18 mm³ versus GI, 487,69 ± 34,89 mm³; p > 0,05) entre os grupos.

A análise histopatológica do VE mostrou um infiltrado inflamatório difuso acentuado no GI. Além disso, esse grupo tinha uma desorganização da estrutura histológica com um aumento da área intersticial e maior distância entre os miócitos ventriculares. Essas células também mostraram uma área transversal aumentada e algumas apresentaram estreitamento da região citoplasmática induzida por uma grande quantidade de formas amastigotas de T. cruzi (fig. 1).

O DO convencional é representado na figura 2. Nesse método, o dissector foi obtido na mesma imagem microscópica ajustando-se o eixo Z do microscópio para criar uma separação óptica de 3 µm entre as imagens. No método físico (imagem não mostrada), o dissector foi obtido usando as imagens microscópicas de dois cortes histológicos seriais diferentes fisicamente separados na mesma distância como no DO (3 µm).

O método de dissector proposto, denominado dissector fluorescente (DF), é representado na figura 3. Nesse método, o dissector foi obtido na mesma imagem microscópica através da emissão de fluorescência diferencial pelo cmyn. Enquanto no DO e DFi foram necessárias 160 fotomicrografias (80 pares de dissector) na análise estereológica, no DF, metade das imagens microscópicas (80 dissectores individuais) foi utilizadas.

No DF, um fator de correção de 50% foi incorporado à fórmula utilizada para determinar Nv[c] em DO e DFi. Assim, a fórmula usada para estimar Nv[c] no DF foi Nv[c]= Q^-[cmyn] × 0,5 / h×A_T; onde a constante 0,5 foi criada para evitar a superestimação da contagem de cmyn no DF.

Os resultados de Nv[c] e N[c] obtidos usando os diferentes métodos de dissector são apresentados na tabela 1. Em ambos os métodos de dissector, os animais infectados apresentaram queda significativa de ambas as variáveis em relação aos animais controle. Não houve diferença significativa nos valores dessas variáveis, apesar dos métodos de dissector usados.

A tabela 2 mostra o resultado da análise de correlação de Nv[c] e N[c] obtidos usando os diferentes métodos de dissector. Uma correlação forte, direta e significativa foi obtida em todas as correlações entre os métodos.

Discussão

Por muitos anos, os estudos morfológicos de tecidos biológicos foram baseados em descrições histopatológicas ambíguas. Os símbolos usados para indicar o aumento ou diminuição de uma variável é a melhor maneira de expressar os dados em um contexto semiquantitativo²⁰. À medida que essas abordagens morfológicas foram aperfeiçoadas, um sistema bidimensional (2D) quantitativo foi incorporada à análise histológica e patológica para descrever as características morfométricas de órgãos e tecidos^1,21,22. Esses aperfeiçoamentos introduziram avanços significativos nos estudos histoquantitativos. No entanto, a estimativa de parâmetros microscópicos em um espaço tridimensional (3D) manteve-se como uma questão ainda não bem resolvida, e os métodos convencionais morfométricos apresentavam vieses intrínsecos que reduziam a confiabilidade de medidas morfológicas^2,3,23.

Considerando o viés intrínseco de diversas medidas morfométricas, os cálculos das estatísticas de probabilidade e geometria aplicadas na geologia e outras ciências do solo foram adaptados para o estudo de materiais biológicos^1,24, formando a base da estereologia atual³. O desenvolvimento da estereologia é uma evolução importante nos métodos histoquantitativos, permitindo o desenvolvimento de dados morfológico mais precisos e confiáveis^9,10,25,26.

A estimativa da quantidade de objetos no tecido biológico tem sido uma questão crucial em estudos morfológicos e de patologia diagnósticos, constituindo as medidas mais refinadas na estereologia^3,7. O desenvolvimento de métodos de dissector por Sterio em 1984 levou a uma forma criativa e relativamente simples de estimar o número de partículas em um órgão ou tecido⁴. No entanto, o método de dissector ainda exige uma série de requisitos técnicos que aumentam o tempo e o custo da aquisição de dados^5,8,10. A necessidade de obter e analisar um grande número de imagens microscópicas é uma limitação comum dos métodos DO e DFi, principalmente quando vários grupos e amostras de tecidos são estudados ao mesmo tempo. Além disso, os custos para a aquisição ou adaptação de um microscópio com eixo Z controlado contribuem para limitar a aplicação do DO¹¹. Por outro lado, a obtenção de um DFi é extremamente trabalhosa, pois envolve a qualidade da microtomia, o processamento adequado de cortes seriados e capacidade técnica para determinar um alinhamento perfeito desses cortes⁴. Além disso, um mínimo erro de alinhamento pode levar a um viés na contagem de células caracterizado por uma superestimação ou subestimação dos resultados estereológicos. Assim, esses métodos convencionais de dissector ainda requerem consideráveis custos financeiros, técnicos e operacionais para estimar a quantidade de partículas em um área tridimensional¹¹.

O presente estudo propõe um método alternativo para estimar a quantidade de miócitos no tecido cardíaco usando microscopia de fluorescência em um método de dissector modificado. A construção de um DF baseou-se nos requisitos semelhantes aos usados para a contagem de partículas descritos nos métodos de dissector convencionais. No entanto, uma adaptação da fórmula para determinar N[c] foi necessária no DF. A introdução de um fator de correção foi necessário para reduzir a superestimação das medições. Nos métodos convencionais, os resultados da contagem de partículas excluem aquelas que atingiram o plano proibido (geralmente o plano look-down), contribuindo para reduzir o viés de medição^27,28. Como no DF, a presença ou ausência da mesma partícula não pode ser observada em ambos os planos de dissector, como ocorre no DO e no DFi. O cálculo de probabilidade determina um fator de correção 0,5 para a fórmula N[c], considerando 50% de chance de uma partícula ser observada ou não em ambos os planos.

A aplicação do DF com o método proposto forneceu resultados similares de Nv[c] e N[c] em comparação com os outros métodos de dissector, sem diferenças significativas entre os métodos. Ambos os métodos apresentaram sensibilidade suficiente para determinar a redução do número dos miócitos no ventrículo esquerdo no modelo murino de infecção cardíaca induzida por T. cruzi. Esse modelo foi selecionado para este estudo, devido ao tropismo bem estabelecido para o tecido cardíaco apresentado por esse parasita e sua capacidade de reduzir o número de miócitos devido à diferenciação, replicação e evasão de células do parasita, que se propaga em um processo destrutivo contínuo^12,13. Além disso, as correlações entre o DF com os métodos convencionais eram fortes, indicando que o método DF pode ser igualmente confiável para estimar o número de miócitos no tecido cardíaco. A confiabilidade dessas medidas parece ser mantida tanto em condições de saúde quanto em condições patológicas.

Embora o DF também seja um método óptico, o presente estudo demonstrou que o DF pode também ser obtido utilizando lente objetiva com aumentos menores (40×), em comparação com as lentes convencionais (100×) necessárias no DO. No DO, ampliações menores não são usadas frequentemente porque determinam uma grande profundidade de campo, o que dificulta a aquisição de diferentes planos focais de dissector (look-up e look-down), pois mantém todas as estruturas dos cortes dentro do foco a despeito do ajuste do eixo Z³.

Conclusão

O DF descrito neste estudo ofereceu um método alternativo para estimar o número de miócitos no tecido cardíaco. Esse método parece ser confiável tanto em condições normais quanto em condições patológicas para determinar os mesmos parâmetros de Nv[c] e N[c] obtidos por métodos convencionais de dissector. Embora os resultados tenham sido semelhantes entre os três métodos, o DF mostrou algumas vantagens em relação ao DO e ao DFi, tais como: 1) redução (pela metade) do número de cortes histológicos e imagens necessárias na análise estereológica, 2) redução do tempo de análise das imagens necessárias, 3) construção de DF em microscópios simples, utilizando o modo de epifluorescência, 4) distinção dos planos de dissector de look-up e look-down ampliações menores, 5) confiabilidade dos resultados estereológicos que envolvem custos técnicos e operacionais reduzidos em comparação com os métodos DO e DFi.

Artigo recebido em 08/07/11

Revisado recebido em 18/08/11

Aceito em 26/08/11.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Fev 2012
• Data do Fascículo
  Mar 2012

Histórico

• Recebido
  08 Jul 2011
• Aceito
  26 Ago 2011
• Revisado
  18 Ago 2011