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Rastreamento gênico da neoplasia endócrina múltipla tipo 2: experiência da Unidade de Endocrinologia Genética da USP

Genetic screening of multiple endocrine neoplasia type 2: experience of the USP Endocrine Genetics Unit

Resumos

A neoplasia endócrina múltipla tipo 2 (NEM-2) é uma síndrome tumoral hereditária que compreende: carcinoma medular de tireóide, hiperparatiroidismo primário, feocromocitoma e outras doenças não-endócrinas. Desde a identificação das primeiras mutações missense no RET associadas ao NEM-2, a detecção de mutações no RET adquiriu grande impacto no tratamento clínico da NEM-2, tais como o pronto diagnóstico e tratamento do CMT. Atualmente a tireoidectomia total possibilita real cura dos casos de CMT nos quais os diagnósticos moleculares foram efetuados precocemente. Depois de identificadas as mutações no RET, os demais familiares devem ser rastreados para esta mutação utilizando-se métodos como DGGE, SSCP, enzima de restrição, seqüenciamento e mini-seqüenciamento gênico. Apresentamos uma breve revisão da nossa experiência com seqüenciamento gênico direto do RET e DGGE. Em 50 pacientes com NEM-2 analisados por ambas as técnicas, não encontramos falsos resultados, sugerindo que o DGGE é uma metodologia de rastreamento adequada para mutações no proto-oncogene RET.

Rastreamento gênico; DGGE; Seqüenciamento gênico; NEM-2; Proto-oncogene RET; Carcinoma medular de tireóide


Multiple endocrine neoplasia type 2 (MEN-2) is an inherited tumor syndrome that includes medullary thyroid carcinoma (MTC), primary hyperparathyroidism, pheochromocytoma and other non-endocrine diseases. Since the first RET missense mutations in association with MEN-2 were identified, RET mutation analysis had a great impact in the clinical management of MEN-2, such as in early diagnosis and treatment of MTC. Presently, early total thyroidectomy provides real cure of MTC for cases in which molecular diagnosis has been performed at early ages. After RET mutation identification, family members should be screened for this mutation by using methods as DGGE, SSCP, restriction enzyme, genetic sequencing or mini-sequencing. In this paper, we briefly review our experience with the direct RET gene sequencing and DGGE approaches. In 50 typical MEN-2 patients analyzed using both methods, we found no false results suggesting that DGGE is a reliable screening method for RET proto-oncogene mutation analysis.

Genetic screening; DGGE; Genetic sequencing; MEN-2; RET proto-oncogene; Medullary thyroid carcinoma


REVISÃO

Rastreamento gênico da neoplasia endócrina múltipla tipo 2: experiência da Unidade de Endocrinologia Genética da USP

Genetic screening of multiple endocrine neoplasia type 2: experience of the USP Endocrine Genetics Unit

Marcelo A.C.G. dos Santos; Adriana Bezerra Nunes; Neusa Abelin; Marilza C.L. Ezabella; Rodrigo de Almeida Toledo; Delmar Lourenço Júnior; Cesar Yoiti Hayashida; Ivone Izabel M. da Fonseca; Sergio P. de Almeida Toledo

Unidade de Endocrinologia Genética, Endocrinologia, Clínica Médica, Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, SP

Endereço para correspondência Endereço para correspondência: Marcelo Augusto Cortina Gonçalves dos Santos Unidade de Endocrinologia Genética, Disciplina de Endocrinologia, Clínica Médica Av. Dr. Arnaldo 455, 5º andar 01246-903 São Paulo, SP Fax: (11) 3066-7252

RESUMO

A neoplasia endócrina múltipla tipo 2 (NEM-2) é uma síndrome tumoral hereditária que compreende: carcinoma medular de tireóide, hiperparatiroidismo primário, feocromocitoma e outras doenças não-endócrinas. Desde a identificação das primeiras mutações missense no RET associadas ao NEM-2, a detecção de mutações no RET adquiriu grande impacto no tratamento clínico da NEM-2, tais como o pronto diagnóstico e tratamento do CMT. Atualmente a tireoidectomia total possibilita real cura dos casos de CMT nos quais os diagnósticos moleculares foram efetuados precocemente. Depois de identificadas as mutações no RET, os demais familiares devem ser rastreados para esta mutação utilizando-se métodos como DGGE, SSCP, enzima de restrição, seqüenciamento e mini-seqüenciamento gênico. Apresentamos uma breve revisão da nossa experiência com seqüenciamento gênico direto do RET e DGGE. Em 50 pacientes com NEM-2 analisados por ambas as técnicas, não encontramos falsos resultados, sugerindo que o DGGE é uma metodologia de rastreamento adequada para mutações no proto-oncogene RET.

Descritores: Rastreamento gênico; DGGE; Seqüenciamento gênico; NEM-2; Proto-oncogene RET; Carcinoma medular de tireóide

ABSTRACT

Multiple endocrine neoplasia type 2 (MEN-2) is an inherited tumor syndrome that includes medullary thyroid carcinoma (MTC), primary hyperparathyroidism, pheochromocytoma and other non-endocrine diseases. Since the first RET missense mutations in association with MEN-2 were identified, RET mutation analysis had a great impact in the clinical management of MEN-2, such as in early diagnosis and treatment of MTC. Presently, early total thyroidectomy provides real cure of MTC for cases in which molecular diagnosis has been performed at early ages. After RET mutation identification, family members should be screened for this mutation by using methods as DGGE, SSCP, restriction enzyme, genetic sequencing or mini-sequencing. In this paper, we briefly review our experience with the direct RET gene sequencing and DGGE approaches. In 50 typical MEN-2 patients analyzed using both methods, we found no false results suggesting that DGGE is a reliable screening method for RET proto-oncogene mutation analysis.

Keywords: Genetic screening; DGGE; Genetic sequencing; MEN-2; RET proto-oncogene; Medullary thyroid carcinoma

A NEOPLASIA ENDÓCRINA MÚLTIPLA tipo-2 (NEM-2) é herdada por genes autossômicos dominantes e compreende um grupo de doenças, tais como carcinoma medular de tireóide familiar (CMT-F), neoplasia endócrina múltipla tipo-2A (NEM-2A), que apresenta CMT associado a feocromocitoma (FEO) e hiperparatireoidismo primário (HPT), e NEM, tipo-2B (NEM-2B), onde ocorrem CMT, FEO e gânglio-neuromatose de mucosas. Estas neoplasias neuroendócrinas são oriundas de células da crista neural: células C da tireóide, células cromafins da medula da adrenal; células principais e oxifílicas das paratireóides; gânglios simpáticos, parassimpáticos e entéricos, além do trato urogenital. A NEM-2 apresenta elevada expressão de várias substâncias hormonais e não-hormonais produzidas pelas glândulas afetadas (1-6). As diferentes classificações da NEM-2 encontram-se sumarizadas na tabela 1.

O carcinoma medular de tireóide (CMT) associado à NEM-2 possui incidência de 1:30.000 indivíduos, ocorrendo expressão de doença em mais de 90% dos portadores de mutações no proto-oncogene RET (2,7,8). O CMT corresponde a cerca de 10% de todas as patologias malignas que acometem a tireóide, sendo 75% esporádicos e 25% hereditários. Na sua forma hereditária é evento clonal, aleatório, multicêntrico e bilateral (9). Dentre as várias substâncias bioativas secretadas pelas células C, a calcitonina é a mais importante e considerada o seu melhor marcador tumoral (3,10). A hiperplasia de células C corresponde à fase pré-maligna da forma herdada de CMT, ocorrendo a seguinte seqüência de eventos nas células C: hiperplasias focais, nodulares e difusas que progridem até CMT. Cerca de 50­70% dos pacientes com CMT diagnosticados por meio de hipercalcitoninemia e nódulos tireoidianos palpáveis já possuem metástases locais em linfonodos cervicais ou, mais raramente, a distância (pulmões, fígado e ossos) (11).

O feocromocitoma (FEO) associado à NEM-2 representa cerca de 10% do total de FEOs; é benigno em 90% dos casos, localiza-se majoritariamente nas adrenais, sendo bilateral em 50­80% dos pacientes. O diagnóstico de FEO pode preceder, ser sincrônico ao do CMT, ou ser posterior (40­50%) ao achado do CMT (3-17).

O hiperparatireoidismo (HPT) associado à NEM-2 é representado por hiperplasia glandular (85%) ou adenoma (15%); é usualmente subclínico, afeta todas as quatro glândulas. Calculose renal e osteoporose podem ocorrer juntamente à hipercalcemia e níveis elevados de PTH (3,18).

O megacólon congênito ou doença de Hirschsprung (HSCR) é entidade não-endócrina associada à NEM-2. Caracteriza-se por desordem do desenvolvimento do sistema nervoso entérico (SNE) nos plexos mioentéricos de Auerbach, submucoso de Meissner e submucoso profundo de Henle, e incide ao longo de variável porção do intestino distal. Os indivíduos afetados geralmente apresentam obstrução intestinal ou constipações severas (19).

Aspectos moleculares. Em 1985, estudos de transfecção com DNA de linfoma humano em células NIH-3T3 revelaram foco de proliferação tumoral com presença de diferentes seqüências genéticas de DNA. Entre estas seqüências, uma apresentava-se em comum e foi denominada RET ­ "rearranged during transfection". O RET foi localizado na sub-banda do cromossomo 10q11.2 em 1987 (1,20). Em 1993, verificou-se que o proto-oncogene RET (RET) possui aproximadamente 60 Kilobases (Kb), sendo composto por 21 éxons com tamanhos variando entre 60 e 287 pares de bases (pb) cada. A proteína RET é receptora de membrana do tipo tirosina-quinase, tem 1.100 aminoácidos e apresenta porções extracelular, transmembrana e intracelular. A porção extracelular possui região rica em resíduos cisteínas que exercem importante função na dimerização deste receptor. Mutações missense nesta região englobam cerca de 90% de todas as mutações encontradas na NEM-2 (1,2,21,22).

Sinalização molecular. As cisteínas extracelulares influem importantemente na dimerização molecular do receptor. Há pelo menos 10 isoformas de proteínas RET resultantes de sítios de splicing alternativos 5' e 3' do éxon 21, com significados funcionais ainda não bem definidos (1,2). O RET tem importante função na migração e desenvolvimento das células derivadas da crista neural: células C da tireóide; células cromafins das medulas adrenais; gânglios simpáticos, parassimpáticos e entéricos; trato urogenital; e paratireóides (oriundas dos arcos branquiais). Outros receptores e seus respectivos ligantes (GFRa-1/GDNF, GFRa-2/nerturina GFRa-3/artemina, GFRa-4/persepina) são proteínas que interagem com a porção extracelular do receptor RET (23). Estes fatores auxiliam a sobrevivência e desenvolvimento celular destes tecidos (1). Uma vez acoplados, os ligantes e seus receptores formam um complexo que promove a dimerização dos monômeros do receptor RET, fosforilam os resíduos internos da porção intracelular dos monômeros e iniciam longa cascata de sinalização através de vasta rede de proteína-quinases ativadoras de mitoses (MAPKs) (1,23-25). Estes sinais amplificados promovem diferenciação neuronal, mobilidade e sobrevivência celular. Dimerização constitutiva (independente da ação do ligante) dos monômeros ocorre na presença de mutações germinativas ativadoras da porção extracelular de RET, favorecendo o fenótipo neoplásico. Mutações germinativas do RET na região intracelular promovem alterações na afinidade entre substrato e sítio catalítico da proteína, também favorecendo o fenótipo neoplásico (1,24-26). Estudos bioquímicos e de transfecção da proteína tirosina-quinase mostraram diferenças nas quantidades de expressão dos receptores celulares ao nível da membrana celular. Os resíduos de cisteínas extracelulares do receptor RET derivados de códons mutantes 609 e 611 (próximos à região 5'), usualmente associados ao CMT-F, apresentam menor expressão quantitativa destes receptores em relação aos mutantes no códon 634 (próximo à porção transmembrana) relacionados ao fenótipo NEM-2A. A diferença de potencial neoplásico entre estes dois fenótipos pode ser justificada pela variação da sensibilidade quantitativa de expressão de receptores maduros ao nível da membrana celular, a maior sensibilidade de expressão concorrendo para o acometimento das glândulas tireóide, adrenais e paratireóides (2,24).

A NEM-2A compreende 75% das NEM-2, sendo o CMT presente em virtualmente 100%, FEO em 50% e o HPT entre 20 e 30% dos casos, com a média de idade ao diagnóstico entre 20 e 40 anos (2). As mutações no RET estão presentes em 98% dos casos, sendo que as do tipo missense ocorrem mais comumente nos éxons 10 e 11, envolvendo os códons 609, 611, 618, 620, 630 e 634. Pequenas inserções de nucleotídeos nos códons 635 e 637 são mais raras. O códon 634 corresponde a 85% das mutações encontradas, das quais 52% correspondem à mutação Cys634Arg e 26% à mutação Cys634Tyr. Portadores da mutação Cys634Arg podem desenvolver metástases em linfonodos regionais do pescoço aos 15 anos de idade, enquanto que metástases a distância são freqüentes em portadores da mutação Cys634Tyr, aos 30 anos de idade (1,2,27). Em familiares com elevada incidência de HPT e ausência de FEO, foram descritas duplicações de 12 pb entre os códons 634 e 635, co-segregadas com a mutação Cys634Arg (1,2). Em nosso laboratório descrevemos dupla mutação Cys634Arg/Val648Ile em uma família portadora de NEM-2A (6,14). Dois irmãos com a mutação Val648Ile não apresentavam sintomas associados à NEM-2. Dois outros irmãos com mutação Cys634Arg expressavam somente o CMT, enquanto que o pai era portador da mutação Cys634Arg e a nova mutação Val648Ile. A evolução do CMT foi relativamente branda, mas ocorreu FEO secretor ectópico de calcitonina, fenótipo extremamente raro (6,14). Mutações no domínio intracelular do receptor RET envolvendo os códons 790 e 804 são raramente associadas à NEM-2A (1,2).

O CMT-F compreende 20% do total de casos com NEM-2. Sua caracterização se dá por vários membros de uma família apresentarem CMT, na ausência de FEO e de HPT. O prognóstico tende a ser melhor que o do CMT associado à NEM-2A ou NEM-2B (1,28). Dos pacientes, 85% apresentam mutações no RET, sendo as mais comuns relacionadas aos éxons 10 e 11 (2). Um terço (33%) dos casos de CMT-F apresentam a mutação Cys618Ser e 30%, a Cys634Tyr. A mutação Cys634Arg é rara neste fenótipo (8). Mutações nos códons 609, 611 e 620, assim como no domínio tirosina-quinase Glu768Asp, Val804Leu e Val804Met, estão associadas ao CMT-F, apesar de também ocorrerem na NEM-2A. Mutações no domínio tirosina-quinase também foram relatadas nos códons 790, 791, e 891 (1,2,27). Mutações nos códons 630, 790, 791, 891 e a duplicação de 12 pb entre os códons 634 e 635 foram descritas em famílias com CMT-F e relacionadas a curso clínico menos agressivo (2). Família com CMT-F possivelmente associado ao HSCR foi descrita portando duplicação de 9 pares de bases no éxon 8 do RET, levando à criação de novo resíduo de cisteína na porção extracelular do receptor. O portador desta inserção não apresentava outras mutações germinativas ou somáticas, confirmando sua patogenicidade (28). Mais recentemente foi descrita mutação Gly533Cys no éxon 8, presente em 76 casos de CMT-F pertencentes a uma família de origem espanhola com 229 indivíduos sob-risco de apresentarem esta mutação (29).

A NEM-2B compreende a forma mais distinta e agressiva de CMT hereditário e representa 5% das NEM-2. O aparecimento ultraprecoce do CMT ocorre usualmente antes de 1 ano de idade (2,8). A mutação Met918Thr ocorre em 95% dos casos, e a mutação Ala883Phe, em cerca de 4% dos pacientes com NEM-2B (1,2). Mutações menos freqüentes como Ser922Tyr e as associações entre mutações no códon 804 com Tyr806Cys no mesmo alelo foram relatadas (1).

Abordagem terapêutica na NEM-2 na era pós-genômica. O impacto na clínica do diagnóstico molecular do RET tem sido enorme, uma vez que este permite discriminar em fases precoces portadores de não-portadores de mutações neste gene. Após caracterização de não-portadores, estes são liberados do seguimento médico, enquanto que os portadores da mutação são direcionados para tireoidectomia total. Desde 1997 consensualmente decidiu-se que a indicação de tireoidectomia total deve ter como base a identificação de mutações no RET. Esta conduta alterou profundamente o curso clínico do CMT, levando à cura nos casos em que a cirurgia foi realizada precocemente (usualmente abaixo dos 5 anos de idade). A boa tolerância das crianças afetadas à cirurgia e ausência de resultados RET falso-positivos foram pontos importantes para estas recomendações (8,30). O consenso internacional sobre NEM (2001) postula haver três grupos de risco baseados nos tipos de mutações no RET.

O nível de risco-3 corresponde ao risco máximo para desenvolvimento de forma agressiva de CMT. Crianças com NEM-2B ou portadoras de mutações nos códons 883, 918 ou 922 devem ser encaminhadas à tireoidectomia total durante os seis primeiros meses de vida; preferencialmente no primeiro mês, pois é comum o desenvolvimento de metástases durante o primeiro ano de vida. Deve ser realizada limpeza dos linfonodos centrais do pescoço, sendo de maior extensão quando comprovada a existência de metástases (8).

O nível de risco-2 compreende risco elevado para o desenvolvimento de forma agressiva de CMT. Crianças portadoras de mutações nos códons 611, 618, 620 ou 634 devem ser encaminhadas à tireoidectomia total antes dos cinco anos de idade. A cirurgia deve ser associada à remoção da cápsula posterior e dissecção dos linfonodos centrais (8).

O nível de risco-1 compreende risco moderado para desenvolvimento de forma agressiva de CMT. Crianças portadoras de mutações nos códons 609, 768, 790, 791 804 e 891 devem ser encaminhadas para tireoidectomia total. A idade para indicação de cirurgia permanece controversa, podendo ser anterior aos cinco ou 10 anos de idade ou somente após a elevação dos níveis de calcitonina. O comportamento biológico dos tumores relacionados às mutações deste grupo é bastante variável. O CMT associado a estas mutações usualmente apresenta desenvolvimento lento e tardio, entretanto metástases e mortes por CMT já foram associadas às mutações nos códons 609, 768, 804 e 891 (8,31,32).

Quanto aos familiares de afetados, a escolha de metodologia de rastreamento de mutações genéticas no RET deve considerar a praticidade, custo-benefício, sensibilidade e especificidade do método, em comparação ao seqüenciamento genético direto (padrão-ouro). O método de rastreamento deve ainda considerar sua fácil execução e reprodutibilidade. Por exemplo, técnicas como SSCP, além de usarem produtos radioativos, podem eventualmente apresentar baixa sensibilidade para amplificados maiores que 200 pb (2,33). A tabela 2 apresenta um algoritmo para análise genética do RET.

Rastreamento de mutações no RET

Como em toda pesquisa clínica, devemos seguir a resolução do Conselho Nacional de Saúde n° 196, de 10 de outubro de 1996, dispondo sobre diretrizes e normas regulamentadoras de pesquisas envolvendo seres humanos. Assim, rastreamentos devem ser aprovados pela Comissão de Ética da instituição competente. Após aceitação e assinatura de consentimento livre e esclarecido por parte dos indivíduos envolvidos, coleta-se amostras de sangue periférico mediante punção venosa, em dois tubos de coleta com 5 ml cada, em anticoagulante EDTA. A seguir citamos os métodos envolvidos no rastreamento de mutações do RET.

A extração do DNA genômico é realizada em nosso serviço pelo "método do sal" (salting out), por ser um procedimento rápido e de baixo custo (34). Sua quantificação é realizada com auxílio de espectrofotômetro.

A amplificação do DNA genômico de interesse é realizada por reação em cadeia da polimerase (PCR) (35). Os oligonucleotídeos iniciadores (primers) devem conter seqüências flanqueadoras da região íntron-éxon para o estudo do RET, e a um deles deve ser acoplada cauda guanina-citosina de aproximadamente 50 pb (31-38). As seqüências dos primers e suas respectivas temperaturas de ciclagem, realizadas por PCR, encontram-se na tabela 3.

A eletroforese em gel com gradiente de desnaturação (DGGE) é realizada após a reação de PCR com primers especiais, os quais se acoplaram caudas guanina-citosina de aproximadamente 50 pb (31-38). O objetivo é criar domínio com maior temperatura de desnaturação, quando comparada à temperatura de desnaturação da seqüência de DNA em estudo, prevenindo a total desnaturação da dupla fita de DNA, o que acarretaria prejuízo e perda da análise eletroforética. Nesta técnica, os fragmentos de DNA de mesmo tamanho são separados mediante transformação das duplas fitas de DNA em fitas simples, por ação de diferentes concentrações de substâncias químicas desnaturantes e calor (44). Nucleotídeos mutados nas seqüências dos DNAs promoverão alterações na temperatura de desnaturação da região de mutação, em contraste com a fita de DNA controle, alterando também sua mobilidade através da matriz do gel (44,45).

O polimorfismo conformacional de cadeia simples (SSCP) é usado por alguns laboratórios de pesquisas para rastrear indivíduos "sob-risco" para mutações do RET. Uma fita de DNA simples contendo determinada mutação assume estrutura terciária diferenciada da fita simples não-mutante, induzindo a diferença de mobilidade ao longo do gel não-desnaturante. A detecção pode ser realizada por auto-radiograma (detecção radioativa), coloração com prata ou uso de primers fluorescentes detectáveis em seqüenciador automático (não radioativos). Este método apresenta sensibilidade ao real de 80% para fragmentos menores de 300 pb, significando que a ausência de bandas mutantes em ensaio de SSCP não exclui a possibilidade do indivíduo carregar mutações, o que pode gerar casos de falso-negativos (46-49).

Na reação de seqüenciamento gênico, os segmentos de DNA de interesse são analisados por metodologia enzimática ou de terminação de cadeia, descrita por Sanger (50). Como a maioria das mutações no RET são do tipo missense, é imprescindível analisar-se separadamente as fitas sense e anti-sense em estudo, evitando falsos resultados.

O mini-seqüenciamento gênico baseia-se na adaptação de kit comercial, onde a reação depende de três primers com tamanhos específicos. Cada primer deve ter um par de base a menos que o nucleotídeo correspondente ao códon de interesse em pesquisa de mutação. A extensão da reação ocorre mediante incorporação de dideoxinucleotídeo (ddNTP), cuja incorporação depende do genótipo em estudo. Após a incorporação deste nucleotídeo marcado a reação não mais ocorrerá, sendo possível a análise e diferenciação do códon mutado mediante uso de programa de computação (51).

A técnica de enzimas de restrição baseia-se na criação ou destruição dos sítios de reconhecimento para endonucleases provocadas por mutações no RET. Isto torna possível a utilização deste método como confirmação de resultados do seqüenciamento gênico direto, DGGE ou SSCP. O produto da digestão deve ser visualizado em gel de agarose a 3% corado com brometo de etídio para posterior visualização em transluminador ultravioleta (14,52,53).

Experiência da Unidade de Endocrinologia Genética

Em nossa Unidade, os pacientes com NEM-2 eram inicialmente diagnosticados por procedimentos clínicos e bioquímicos clássicos, tais como dosagens basais e pós-estímulo por cálcio, pentagastrina ou omeprazol da secreção de calcitonina; dosagens de epinefrina e norepinefrina séricas e urinárias; dosagens de PTH e cálcio; imunocitoquímica e histoquímica para calcitonina; além de exames de imagem (4-16,26,54-56). Neste mesmo período nosso grupo avaliou, originalmente no país, a sensibilidade da dosagem de calcitonina em portadores de nódulos tireoidianos por CMT (16). Atualmente, para os casos-índices realizamos o seqüenciamento gênico direto, enquanto que seus parentes sob-risco são submetidos ao rastreamento por DGGE. Estes dados são usualmente confirmados por restrição enzimática.

Recentemente realizamos seqüenciamento gênico direto para os éxons hot-spots do RET (ABI 310 DNA Sequencer, Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), em 50 amostras de DNA previamente analisadas por DGGE em nosso grupo (6,14). Assim, estudamos cinco famílias portadoras de NEM-2 (50 indivíduos), que sumariamente apresentaram os seguintes achados: 28 portadores de mutação no RET e 22 não-portadores de mutação. Dentre os 28 indivíduos mutados, encontramos as seguintes correlações genótipo-fenótipo: a) éxon 11 do RET, Cys634Arg (TGC-CGC) em casos com NEM-2A; b) éxon 10 do RET, Cys620Arg (TGC-CGC) em casos com NEM-2A associadas à HSCR; c) éxon 14 do RET, Val804Met (GTG-ATG) em pacientes com CMT-F; d) éxon 16 do RET, Met918Thr (ATG-ACG) em pacientes com NEM-2B; e) em uma família com fenótipo NEM-2A, ocorreu a dupla mutação Cys634Arg (TGC-CGC) / Val648Ile (GTC-ATC) (6).

Para todos os indivíduos, os nossos dados do seqüenciamento gênico direto do RET foram totalmente (100%) compatíveis com os achados anteriores do DGGE. Não foram detectados falso-positivos ou falso-negativos ao utilizarmos o seqüenciamento gênico e o DGGE como método de rastreamento gênico para o RET. Estes dados permitem afirmar que a estratégia de rastreamento genético do RET usando um dos dois métodos é adequada, por não ter ocorrido falso resultado.

A tireoidectomia total foi indicada nos 28 portadores de mutações no RET, seguindo critérios do consenso internacional para estudos do RET (8). Outros 22 parentes dos pacientes que não eram portadores de mutação no RET foram dispensados do acompanhamento médico. A figura 1 mostra as mutações encontradas na análise por seqüenciamento gênico em nosso estudo (ABI 310 DNA Sequencer, Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).


CONCLUSÕES

Na fase pré-genômica, parentes de primeiro grau de pacientes com NEM-2, os quais possuem 50% de chance de apresentarem mutações no RET, eram rastreados anualmente para CMT, FEO e HPT, por meio de marcadores tumorais. Nesta fase, o diagnóstico do CMT era usualmente tardio, sendo freqüentes as apresentações mais avançadas da doença. Com o diagnóstico gênico da NEM-2, a indicação da tireoidectomia total tornou-se precoce e específica aos portadores de mutação no RET, tendo esta cirurgia adquirido grande valor curativo para o CMT (2,22,31).

O sucesso do diagnóstico do RET na NEM-2 se deve ao fato de a doença ter elevada penetrância em familiares de afetados (22,31). O diagnóstico molecular torna-se, então, importante não só para a confirmação diagnóstica de indivíduos sabidamente afetados, como fundamental na conduta médica-cirúrgica de indivíduos assintomáticos portadores de mutações, uma vez que estes deverão ser submetidos à tireoidectomia total profilática, seguindo critérios do consórcio internacional (8).

Neste estudo, apresentamos como métodos de rastreamento o seqüenciamento gênico, DGGE, SSCP, enzima de restrição além do mini-seqüenciamento. O seqüenciamento gênico é considerado o "padrão-ouro" da análise molecular, podendo ser de alto custo financeiro ao se rastrear famílias extensas. O mini-seqüenciamento apresenta-se como metodologia de rastreamento segura, de menor custo e mais rápida realização (12 minutos), quando comparado ao seqüenciamento genético tradicional. Como desvantagem, necessita de prévio conhecimento das mutações a serem pesquisadas para a confecção dos três primers específicos na análise (51). Tanto o seqüenciamento direto como o mini-seqüenciamento necessitam de treinamento específico, e ainda poucos centros no Brasil estão aptos a realizá-los rotineiramente. O custo envolvido na aquisição e manutenção do seqüenciador gênico deve ser também levado em conta. O uso de enzimas de restrição limita-se à confirmação da mutação rastreada, uma vez que sua reprodutibilidade nem sempre é segura, devido a possíveis interferentes, tais como não reconhecimento do sítio de restrição do produto amplificado e conseqüente não visualização destes fragmentos em gel de agarose, e separação incompleta ou não separação de fragmentos com tamanhos aproximados.

O DGGE tem se mostrado o método de rastreamento adequado e apresenta excelente correlação com o seqüenciamento gênico do RET (100%). Além disto, é altamente sensível, não-radioativo e de pouca manipulação, fornecendo resultados rápidos e precisos. Permite rastreamento de grande número de pacientes, uma vez que 6 éxons hot-spots do RET podem ser analisados em um único gel. Além disto, não necessita de prévio conhecimento da mutação específica que segrega na família, é mais sensível que outras metodologias como o SSCP e não depende da existência de sítios de restrições. Como desvantagens, o DGGE necessita de análise computacional da temperatura de desnaturação de cada seguimento; envolve investimento inicial para aquisição do sistema de eletroforese específico; maiores custos para confecção dos primers especiais (que necessitam da cauda guanina-citosina); difícil padronização da técnica para genes ricos em guaninas e citosinas e uso de formamida (tóxica) no protocolo laboratorial (6,14). No presente trabalho, estudamos 50 casos com NEM-2 por meio do seqüenciamento gênico direto, os quais já haviam sido anteriormente analisados por DGGE. Não houve casos de falsos resultados quando comparados os métodos.

AGRADECIMENTOS

Agradecemos ao Grupo PAPAIZ pelo apoio financeiro e por acreditar em nosso trabalho de pesquisa, visando trazer para a sociedade maior rapidez e segurança no diagnóstico de Neoplasia Múltipla do tipo-2. Ao Prof. Dr. Alberto José da Silva Duarte, responsável pelo Laboratório de Investigações Médicas em Dermatologia e Imunodeficiências (LIM-56), Departamento de Dermatologia, HC-FMUSP, pela colaboração e integração científica disponibilizando a estrutura de softwares para análises das seqüências gênicas do nosso estudo. Agradecemos a todos os profissionais da Unidade de Endocrinologia Genética (LIM-25), Endocrinologia, Departamento de Clínica Médica, HC-FMUSP, por tornarem direta ou indiretamente possível a realização deste trabalho.

Recebido em 18/04/05

Revisado em 17/08/05

Aceito em 28/10/05

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  • Endereço para correspondência:

    Marcelo Augusto Cortina Gonçalves dos Santos
    Unidade de Endocrinologia Genética,
    Disciplina de Endocrinologia, Clínica Médica
    Av. Dr. Arnaldo 455, 5º andar
    01246-903 São Paulo, SP
    Fax: (11) 3066-7252
  • Datas de Publicação

    • Publicação nesta coleção
      17 Abr 2006
    • Data do Fascículo
      Fev 2006

    Histórico

    • Recebido
      18 Abr 2005
    • Revisado
      17 Ago 2005
    • Aceito
      28 Out 2005
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