Open-access Avaliação da suscetibilidade do LDL de pacientes com diabetes mellitus tipo 1 à oxidação in vitro e sua relação com o controle glicêmico

Evaluation of LDL susceptibility of patients with type 1 diabetes to in vitro oxidation and its relation to glycemic control

Resumos

Avaliamos em 38 pacientes com diabetes tipo 1 (DM1) e 24 não diabéticos, a suscetibilidade do LDL à oxidação in vitro. Foram avaliados glicemias de jejum e pós-prandial (GPP), hemoglobina glicosilada (HbA1c), perfil lipídico e análise espectrofotométrica da oxidação do LDL antes e 1, 3, 6 e 24 horas após adição de substância oxidante - sulfato de cobre (CuSO4). O coeficiente de oxidação do LDL foi semelhante nos dois grupos antes da adição do CuSO4. Entretanto, 3 horas após, o LDL se mostrou mais suscetível à oxidação in vitro nos pacientes com DM1. Houve correlação negativa com a GPP (r= -0,2511; p<0,05) e com a HbA1c (r= -0,2541; p<0,05). Concluímos que, em nossa amostra, o LDL dos pacientes com DM1 foi oxidado mais precocemente que o dos não diabéticos, e que o controle glicêmico apresentou importância neste evento.

Diabetes tipo 1; LDL oxidado; Suscetibilidade; Controle glicêmico


In 38 patients with type 1 diabetes (DM 1) and 24 non-diabetics we investigated LDL susceptibility to in vitro oxidation. Fast and post-prandial glycaemia (PPG), glycated hemoglobin (HbA1c) and lipid profile were determined, together with an spectrophotometric analysis of LDL oxidation before and 1, 3, 6 and 24 hours after addition of the oxidant substance - copper sulphate (CuSO4). The LDL oxidation coefficient in the two groups presented similar basal values; however 3 hours after CuSO4, LDL was more oxidized in patients with DM1. There was a negative correlation with PPG (r= -0.2511; p<0.05) and HbA1c (r= -0.2541; p<0.05). We conclude that in our sample of DM patients LDL was oxidized earlier than in the non-diabetics and that the glycemic control is important in this event.

Type 1 diabetes; Oxidized LDL; Susceptibility; Glycemic control


ARTIGO ORIGINAL

Avaliação da suscetibilidade do LDL de pacientes com diabetes mellitus tipo 1 à oxidação in vitro e sua relação com o controle glicêmico

Evaluation of LDL susceptibility of patients with type 1 diabetes to in vitro oxidation and its relation to glycemic control

Simone H. de Castro; Hugo C. Castro-Faria-Neto; Eliete L.S. Clemente; Marília B. Gomes

Disciplina de Diabetes e Metabologia do Hospital Universitário Pedro Ernesto, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ

Endereço para correspondência Endereço para correspondência Simone H. de Castro Rua Maestro Vila Lobos 01, apto. 202 20260-220 Rio de Janeiro, RJ E-mail: simone_hc@ig.com.br

RESUMO

Avaliamos em 38 pacientes com diabetes tipo 1 (DM1) e 24 não diabéticos, a suscetibilidade do LDL à oxidação in vitro. Foram avaliados glicemias de jejum e pós-prandial (GPP), hemoglobina glicosilada (HbA1c), perfil lipídico e análise espectrofotométrica da oxidação do LDL antes e 1, 3, 6 e 24 horas após adição de substância oxidante – sulfato de cobre (CuSO4). O coeficiente de oxidação do LDL foi semelhante nos dois grupos antes da adição do CuSO4. Entretanto, 3 horas após, o LDL se mostrou mais suscetível à oxidação in vitro nos pacientes com DM1. Houve correlação negativa com a GPP (r= -0,2511; p<0,05) e com a HbA1c (r= -0,2541; p<0,05). Concluímos que, em nossa amostra, o LDL dos pacientes com DM1 foi oxidado mais precocemente que o dos não diabéticos, e que o controle glicêmico apresentou importância neste evento.

Descritores: Diabetes tipo 1; LDL oxidado; Suscetibilidade; Controle glicêmico

ABSTRACT

In 38 patients with type 1 diabetes (DM 1) and 24 non-diabetics we investigated LDL susceptibility to in vitro oxidation. Fast and post-prandial glycaemia (PPG), glycated hemoglobin (HbA1c) and lipid profile were determined, together with an spectrophotometric analysis of LDL oxidation before and 1, 3, 6 and 24 hours after addition of the oxidant substance – copper sulphate (CuSO4). The LDL oxidation coefficient in the two groups presented similar basal values; however 3 hours after CuSO4, LDL was more oxidized in patients with DM1. There was a negative correlation with PPG (r= -0.2511; p<0.05) and HbA1c (r= -0.2541; p<0.05). We conclude that in our sample of DM patients LDL was oxidized earlier than in the non-diabetics and that the glycemic control is important in this event.

Keywords: Type 1 diabetes; Oxidized LDL; Susceptibility; Glycemic control

O DIABETES MELLITUS (DM) é a doença metabólica mais comum e apresenta sérias implicações na qualidade de vida dos pacientes em decorrência das suas complicações microvasculares e macrovasculares. Atualmente, esta enfermidade é a principal causa de cegueira e responsável por um considerável percentual de doença renal terminal nos Estados Unidos da América (1).

Um dos fatores determinantes de evolução para as complicações crônicas microvasculares é o controle glicêmico, conforme demonstrado pelo Diabetes Complications Control Trial (2). Neste estudo, entretanto, não foi observada redução do risco de complicações macrovasculares com a terapia intensiva do diabetes. Esta avaliação possivelmente foi limitada pelo reduzido número de eventos cardiovasculares ocorridos durante o período do estudo.

A doença cardiovascular é a principal causa de morte em ambos os tipos de DM, perfazendo 44% do total de casos de morte nos pacientes com DM tipo 1 (DM1), seguida pela doença renal (21%) (3). Droga e cols. (4) mostraram que estes pacientes apresentam disfunção endotelial mesmo com níveis glicêmicos próximos da normalidade e taxa de excreção urinária de albumina normal, sugerindo que este fenômeno precede a microalbuminúria como um marcador de risco precoce para a doença cardiovascular. Em adição a estes dados, Järvisalo e cols. (5) demonstraram que mesmo crianças com DM1 já estão sujeitas às complicações cardiovasculares da doença e apresentam espessamento do complexo íntima-média. Estes achados levantam a hipótese da existência de outros fatores envolvidos na fisiopatologia da aterosclerose no DM1, além da hiperglicemia.

O LDL oxidado tem sido caracterizado como um fator crítico no processo aterosclerótico tanto em modelos animais como em humanos (6). A modificação oxidativa do LDL confere propriedades específicas pró-aterogênicas a esta molécula, a qual tem ação na célula endotelial, nos macrófagos e células musculares lisas.

O presente trabalho tem como objetivo avaliar a suscetibilidade à oxidação in vitro do LDL de pacientes com DM1 acompanhados regularmente no ambulatório de Diabetes do Hospital Universitário Pedro Ernesto.

PACIENTES E MÉTODOS

Foram recrutados 38 pacientes com DM1 acompanhados regularmente no ambulatório de Diabetes do Hospital Universitário Pedro Ernesto (HUPE) – UERJ, e 24 não diabéticos, pareados por sexo, idade e índice de massa corporal (IMC), após assinatura do termo de consentimento previamente aprovado pelo comitê de ética do HUPE. As características das duas amostras no momento da coleta dos exames estão na tabela 1.

Os critérios de exclusão para aqueles com DM foram tabagismo, etilismo, presença de nefropatia diabética, infecção sistêmica e/ou uso de medicamentos que pudessem alterar os resultados da determinação da suscetibilidade do LDL à oxidação, como os inibidores da ECA, sulfato ferroso e complexos vitamínicos e de sais minerais contendo vitaminas C e E e Zn, Se, Fe e Cu. No grupo sem DM, estes critérios incluíam, também, a presença de familiares diretos portadores de DM.

Os participantes foram submetidos à coleta de sangue após 12 horas de jejum e 2 horas após café da manhã habitual. Os exames realizados foram glicemia de jeum (GJ) e pós-prandial (GPP) (glicose oxidase); colesterol total, HDL e triglicerídeos através de reações colorimétricas com leitura pelo aparelho Cobas-Mira (Roche); hemoglobina glicosilada (HbA1c – HPLC com leitura pelo aparelho Merck Hitachi 9100 – VR 2,6 a 6,2%). O LDL foi calculado pela fórmula de Friedwald (7).

Os pacientes tiveram seu controle glicêmico classificado de acordo com os critérios descritos por Chase (divisão do valor da HbA1c do paciente pelo valor do limite superior da normalidade do método) da seguinte forma: bom controle (índice <1,33), controle regular (índice >1,33 e <1,5) e péssimo controle (índice >1,55) (8).

Para a análise da suscetibilidade do LDL à oxidação in vitro, foram coletados 20mL de sangue a vácuo em tubos com EDTA, os quais foram centrifugados a 4ºC por 20 minutos a 800xg. Após a separação do plasma, o mesmo foi imediatamente processado para o isolamento do LDL seguindo as etapas descritas: ajuste da densidade para 1,3g/mL pela adição de brometo de potássio (4,5g de KBr a cada 9mL de plasma) com posterior preparo dos tubos de ultracentrifugação com 20mL de solução salina a 0,9% e os 9mL de plasma anteriormente preparados. Estes tubos foram, então, centrifugados a 4ºC por 3 horas a 150.00xg. Após a ultracentrifugação, a banda de lipoproteínas com densidade entre 1,019 e 1,063g/mL, compatível com a do LDL, foi coletada (9,10). Este material teve sua concentração protéica dosada pelo método do Biureto (11) e ajustada para 0,2mg/mL. Ao material obtido foi adicionado sulfato de cobre (CuSO4) 20mM na proporção de 1mL para cada 1mL de LDL, e esta solução foi colocada em banho a 37ºC por 24 horas.

A avaliação do LDL oxidado foi feita de forma indireta através do cálculo do coeficiente de oxidação desta partícula (12,13), o qual utiliza em sua fórmua a absorvância em 3 comprimentos de onda da luz UV, a saber: 205nm, 232nm e 280nm.

Foram realizadas leituras no espectrofotômetro Schimadzu nos comprimentos de onda acima mencionados nos momentos pré adição e 1, 3, 6 e 24h após a adição do CuSO4, para avaliar a suscetibilidade do LDL ao processo oxidativo. O coeficiente de oxidação foi calculado através da seguinte fórmula: Abs 205 – Abs 280 / Abs 232 – Abs 280, onde Abs 205= leitura das duplas ligações dos ácidos graxos poli-insaturados dos fosfolipídeos do LDL; Abs 232= leitura dos dieno conjugados; e Abs 280= leitura da fração protéica do LDL.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados de todas as variáveis analisadas foram apresentados como média e desvio padrão. Foi utilizado o teste t Student não pareado para comparação das médias entre os dois grupos analisados. Para testar as correlações entre as variáveis de controle metabólico e a suscetibilidade do LDL à oxidação in vitro, utilizamos a correlação de Pearson.

RESULTADOS

Os resultados do controle glicêmico e do perfil lipídico estão na tabela 2. Observamos que o controle glicêmico dos pacientes estudados era regular e que não houve diferença estatisticamente significativa no perfil lipídico dos dois grupos avaliados.

Os pacientes com DM1 apresentaram média de coeficiente de oxidação basal semelhante à dos sem DM. Entretanto, após a adição de sulfato de cobre, houve oxidação mais precoce nos pacientes com DM do que nos sem DM (tabela 3) (figura 1).


Houve diferença significativa na resposta do LDL dos sem DM e dos pacientes com DM1 ao estímulo oxidativo 3 horas após a adição do sulfato de cobre. Ao analisarmos a interferência das variáveis de controle metabólico na suscetibilidade desta molécula à oxidação, encontramos correlação importante entre o Cox3h e a GPP e a HbA1c (r= -0,2511; p<0,05 e r= -0,2541; p<0,05, respectivamente) (figuras 2 e 3).



DISCUSSÃO

O presente estudo avaliou a suscetibilidade do LDL à oxidação in vitro em pacientes com DM1 e indivíduos saudáveis pareados por sexo, idade e IMC. Houve análise também da interferência das variáveis de controle metabólico neste parâmetro.

Os dados na literatura são controversos no que diz respeito ao comportamento do LDL de pacientes com DM1 frente ao stress oxidativo (14-16). Este conflito pode refletir diferença nas populações estudadas no que diz respeito ao grau de hiperglicemia, presença e severidade de complicações do DM, conteúdo de vitaminas na dieta e, possivelmente, raça (17). Os resultados obtidos na nossa amostra estão de acordo com os dados de Tsai e cols. (14), que também identificaram maior suscetibilidade do LDL à oxidação e correlação significativa com o controle glicêmico. Nosso trabalho traz, entretanto, um dado novo, que é a importância da glicemia pós-prandial neste fator também no DM1, o que havia sido descrito apenas no DM2.

Em nossa amostra, não houve diferença entre os dois grupos no momento pré-adição do agente oxidante, mostrando que, em estado pré-estímulo, não há diferença neste componente pró-aterogênico. Entretanto, 3 horas após a sua adição, o LDL dos pacientes com DM1 apresentou-se mais oxidado. A partir de 6 horas após o início do estímulo oxidativo, ambos os grupos voltaram a ter a mesma resposta oxidativa.

Esta maior suscetibilidade nos pacientes com DM1 não pode ser justificada pela presença de dislipidemia (18), então outros fatores são os determinantes desta situação.

No grupo estudado, encontramos correlação negativa do Cox3h com a GPP e a HbA1c, ou seja, quanto maiores os níveis destas variáveis menor o Cox3h. Isto pode ter relação com o fato do LDL glicosilado ser mais suscetível à oxidação (19), ou ainda com a capacidade que o estado hiperglicêmico tem de estimular a formação de radicais livres, o que causaria um maior consumo dos antioxidantes endógenos e permitiria que o LDL se tornasse mais suscetível à oxidação pelo sulfato de cobre. Existem dados que falam contra esta última possibilidade, como o conteúdo normal ou mesmo elevado de vitamina E encontrado em pacientes com DM1 (20). Por outro lado, Hoeldtke (21) mostrou em seu estudo que os pacientes portadores de DM1 têm níveis séricos diminuídos de ácido úrico, um anti-oxidante endógeno.

Uma vez que a resposta do LDL ao sulfato de cobre é semelhante àquela determinada pela presença de macrófagos ativados, é possível que o comportamento desta molécula frente ao estímulo oxidativo in vitro reproduza as alterações por ela sofridas in vivo (13). Assumindo esta hipótese como verdadeira, a maior suscetibilidade do LDL ao processo oxidativo pode ser um dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos na maior prevalência de doenças ateroscleróticas em pacientes com DM1 que na população em geral (22).

Em conclusão, nossos dados mostram que, durante a dinâmica de oxidação, o LDL de pacientes com DM1 foi mais precocemente oxidado in vitro que o dos sem DM, e que este comportamento teve correlação significativa com a glicemia pós-prandial e a hemoglobina glicosilada. São necessários estudos prospectivos a fim de estabelecer todos os fatores preditores deste comportamento do LDL durante a exposição a substâncias ou situações com características oxidantes.

Recebido em 27/01/03

Revisado em 05/06/03, 13/01/04 e 25/04/04

Aceito em 15/05/04

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  • Endereço para correspondência
    Simone H. de Castro
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  • Datas de Publicação

    • Publicação nesta coleção
      07 Mar 2005
    • Data do Fascículo
      Ago 2004

    Histórico

    • Revisado
      05 Jun 2003
    • Recebido
      27 Jan 2003
    • Aceito
      15 Maio 2004
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