Produção e caracterização de anticorpos monoclonais contra o vírus da bronquite infecciosa das galinhas

Production and characterization of monoclonal antibodies specific to infectious bronchitis virus

R.M. Cardozo N.R.S. Martins J.S. Resende M. Resende A.A.P. Teixeira M.A. Jorge M.B. Souza E.O.B. Epiphanio Sobre os autores

Resumos

Um painel de anticorpos monoclonais (AcM) específicos contra o vírus da bronquite infecciosa das galinhas (VBIG) amostra Massachusetts M41 foi desenvolvido com a finalidade de possibilitar ferramentas para futuros estudos de amostras locais de VBIG. Os clones produtores de AcM foram detectados e caracterizados por ELISA, e para a determinação quanto à especificidade ao componente de VBIG foi utilizado western blotting (WB). Os híbridos produtivos foram clonados por diluição limitante, expandidos in vitro e mantidos em nitrogênio líquido. As bandas protéicas reconhecidas em WB pelos AcM apresentaram pesos moleculares que variaram de 180 a 30 kDa. Oito AcM reconheceram apenas um polipeptídeo e quatro ligaram-se ao polipeptídeo S (3, 18, 52 e 57) inteiro, com a banda de peso molecular aproximado de 180 kDa. Cinco AcM (5, 12, 41, 70 e 72) ligaram-se em mais de uma banda de VBIG. Outros sete AcM não se ligaram a nenhum polipeptídeo de VBIG. Entre os AcM que apresentam perspectivas de utilização em pesquisa e diagnóstico de VBIG incluem-se os produzidos pelo clone 42, dirigido contra S1, os produzidos pelos clones 34, 43 e 71, dirigidos contra S2, pelos clones 7 e 22, dirigidos contra M e pelos clones 15 e 50, cujos AcM reagiram contra a nucleoproteína N.

Galinha; anticorpo monoclonal; vírus da bronquite infecciosa; proteína estrutural


Monoclonal antibodies (Mab) specific to IBV Massachusetts M41 were produced aiming to the development of assays for IBV diagnosis and research, such as for rapidly detecting or typing IBV isolates. Mabs were detected by ELISA and characterized based on the isotype (ELISA) or IBV structural specificity (western blotting) respectively as IgA, IgG1, IgG2a, IgG2b or IgM or as specific to S1 (42), S2 (34, 43 and 71), M (7 and 22), N (15 and 50) and S whole molecule (3, 18, 52 and 57), the major IBV structural proteins

Chicken; monoclonal antibody; infectious bronchitis virus; structural protein


Produção e caracterização de anticorpos monoclonais contra o vírus da bronquite infecciosa das galinhas

[Production and characterization of monoclonal antibodies specific to infectious bronchitis virus]

R.M. Cardozo1, N.R.S. Martins2* * Autor para correspondência E-mail: rodrigo@vet.ufmg.br , J.S. Resende2, M. Resende3, A.A.P. Teixeira4, M.A. Jorge5, M.B. Souza6, E.O.B. Epiphanio4

1Universidade Estadual de Maringá

2Escola de Veterinária da UFMG

Caixa Postal 567

30123-970 – Belo Horizonte, MG

3Instituto de Ciências Biológicas da UFMG

4Medica Veterinária

5EMBRAPA/EPAMIG

6Sadia (Granja Resende), Uberlândia, MG

Recebido para publicação, após modificações, em 15 de fevereiro de 2001.

  • *
    Autor para correspondência
    E-mail:
  • RESUMO

    Um painel de anticorpos monoclonais (AcM) específicos contra o vírus da bronquite infecciosa das galinhas (VBIG) amostra Massachusetts M41 foi desenvolvido com a finalidade de possibilitar ferramentas para futuros estudos de amostras locais de VBIG. Os clones produtores de AcM foram detectados e caracterizados por ELISA, e para a determinação quanto à especificidade ao componente de VBIG foi utilizado western blotting (WB). Os híbridos produtivos foram clonados por diluição limitante, expandidos in vitro e mantidos em nitrogênio líquido. As bandas protéicas reconhecidas em WB pelos AcM apresentaram pesos moleculares que variaram de 180 a 30 kDa. Oito AcM reconheceram apenas um polipeptídeo e quatro ligaram-se ao polipeptídeo S (3, 18, 52 e 57) inteiro, com a banda de peso molecular aproximado de 180 kDa. Cinco AcM (5, 12, 41, 70 e 72) ligaram-se em mais de uma banda de VBIG. Outros sete AcM não se ligaram a nenhum polipeptídeo de VBIG. Entre os AcM que apresentam perspectivas de utilização em pesquisa e diagnóstico de VBIG incluem-se os produzidos pelo clone 42, dirigido contra S1, os produzidos pelos clones 34, 43 e 71, dirigidos contra S2, pelos clones 7 e 22, dirigidos contra M e pelos clones 15 e 50, cujos AcM reagiram contra a nucleoproteína N.

    Palavras-chave: Galinha, anticorpo monoclonal, vírus da bronquite infecciosa, proteína estrutural.

    ABSTRACT

    Monoclonal antibodies (Mab) specific to IBV Massachusetts M41 were produced aiming to the development of assays for IBV diagnosis and research, such as for rapidly detecting or typing IBV isolates. Mabs were detected by ELISA and characterized based on the isotype (ELISA) or IBV structural specificity (western blotting) respectively as IgA, IgG1, IgG2a, IgG2b or IgM or as specific to S1 (42), S2 (34, 43 and 71), M (7 and 22), N (15 and 50) and S whole molecule (3, 18, 52 and 57), the major IBV structural proteins.

    Keywords: Chicken, monoclonal antibody, infectious bronchitis virus, structural protein

    INTRODUÇÃO

    A bronquite infecciosa das galinhas (BIG) é uma doença viral, aguda, altamente contagiosa, que ocorre em Gallus gallus domesticus e causada pelo vírus da bronquite infecciosa das galinhas (VBIG), integrante de Coronaviridae. As grandes projeções superficiais do envelope de VBIG são formadas pelo glicopolipeptídeo S (spike) que é constituido por duas subunidades S1 e S2. A subunidade S1 está envolvida na adsorção do vírus à célula, sendo indutora de anticorpos neutralizantes e liga-se a S2 que prende-se no envelope fixando o conjunto (Cavanagh, 1981). Variantes virais desenvolvem-se por mutações em regiões do gene de S1 e por recombinação genética, especialmente sob pressão de seleção da imunidade (Cavanagh & Naqi, 1997). A proteção cruzada contra o desafio com diferentes sorotipos não é eficiente (Koch et al., 1991; Cook, 1997). Outros componentes estruturais de VBIG incluem a glicoproteína M, 90% embebida na camada lipídica do envelope e a fosfoproteína N, que constitui o capsídeo, revestindo o genoma.

    Os AcM oferecem vantagens sobre os anticorpos policlonais em diagnóstico, como a maior especificidade e padronização, podendo ser continuamente produzidos in vitro, dispensando a necessidade de manutenção de animais doadores. AcM dirigidos para proteínas estruturais podem ter aplicações em ensaios de detecção de VBIG, quando específicos contra estruturas ou seqüências pouco variáveis entre amostras ou em ensaios de tipificação, se dirigidos para estruturas variáveis e que diferenciam amostras (Naqi et al., 1993). Souza (1999) empregou AcM para a caracterização das afinidades antigênicas de isolados de campo em Minas Gerais e amostras de referência de VBIG, detectando apenas três isolados, entre os 14 examinados, relacionados com M41.

    Os objetivos deste trabalho foram produzir e caracterizar AcM contra a amostra M41 do sorotipo Massachusetts de VBIG, para permitir o desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico e pesquisa, bem como para estabelecer as condições laboratoriais pioneiras no Brasil de produção e pesquisa com AcM específico para VBIG.

    MATERIAL E MÉTODOS

    Os trabalhos foram realizados no laboratório de doenças de aves do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva da Escola de Veterinária e no laboratório de virologia comparada do Instituto de Ciências Biológicas, ambos da Universidade Federal de Minas Gerais.

    A amostra M41 de referência do sorotipo Massachusetts de VBIG foi obtida da ATCC (American Type Culture Collection, EUA) sob permissão do Ministério da Agricultura. A amostra La Sota do vírus da doença de Newcastle (VDN), obtida de vacina comercial, foi preparada de forma semelhante e utilizada como antígeno negativo. Os cultivos de vírus foram feitos em ovos embrionados de galinha livres de patógenos especificados (OEG/SPF) via cavidade cório-alantóide com 102DIE50 (dose infectante embrionária 50%) em 0,2ml e incubados por 72 horas a 37°C. Os líquidos alantóides (LA) foram coletados em pool, clarificados a 5.000xg/30min e concentrados com solução saturada tamponada de sulfato de amônia (4ºC) até atingir 36% (v/v). O concentrado viral insolubilizado foi sedimentado (10.000' g/30min), o sedimento reconstituído em água destilada estéril, dialisado em membranas de diálise (Thomas, EUA) contra PBS pH 7,2, concentrado adicionalmente em membranas de diálise contra PVP 6000 (polivinil pirrolidona) (Sigma, EUA) e acrescido de 0,2M de inibidor de proteases (PMSF) (Sigma, EUA). A purificação do concentrado viral em NET (NaCl 100 mM, EDTA 1mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,4) foi feita em gradiente contínuo de sacarose de 25 a 55% por centrifugação a 40.000' g por 16 horas. As alíquotas foram avaliadas em espectrofotômetro (Shimatzu, Japão) com filtro de 280nm e em ELISA, empregando AcM específico contra M41 (A38) (Institute for Animal Health, Reino Unido). A concentração de proteínas do VBIG purificado foi determinada pelo método de Lowry (Hudson & Hay, 1989) em leitor de ELISA.

    Os ELISA para a detecção de VBIG purificado, detecção de anticorpo dos camundongos ou detecção dos AcM seguiram protocolos descritos por Hudson & Hay (1989), Mockett & Cook (1986) e Martins et al. (1990). O AcM A38 contra a glicoproteína S1 de M41 foi utilizado como controle positivo em todas as microplacas (Hemobag, Brasil). Como controle de antígeno negativo em todas as microplacas foi utilizada a amostra La Sota de VDN. Microplacas para ELISA com 96 orifícios foram sensibilizadas com as alíquotas obtidas do gradiente de sacarose na diluição 1:100 (concentração 3,43mg/ml de proteína viral) em carbonato-bicarbonato pH 9,6, conforme titulação prévia em ELISA. Foram sensibilizados cinco orifícios em cada microplaca com a amostra La Sota de VDN (Merial, Brasil) (concentração de proteína viral de 4,10 mg/ml) como controle de antígeno negativo. A leitura foi obtida em leitor de ELISA (Microplate Reader, Sigma, EUA). A produção dos AcM foi realizada conforme descrito por Köhler & Milstein (1975) e Hudson & Hay (1989). Foram utilizados camundongos fêmeas Balb/C obtidos do biotério do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG com quatro a seis semanas de idade. As inoculações de antígeno (Ag) foram feitas via intraperitoneal com Ag emulsificado em adjuvante oleoso. A primeira inoculação foi feita com inóculo composto de 250m l de adjuvante completo de Freund (Sigma, EUA) e 250ml de proteína de VBIG purificado (85,75mg). Aos 14, 21 e 42 dias após a primeira inoculação, foram realizadas a segunda, a terceira e a quarta inoculações, utilizando os mesmos volume e concentração protéica, variando o adjuvante para incompleto de Freund (Sigma, EUA). Dez dias após a terceira imunização foi feita coleta de sangue na veia da cauda dos camundongos para avaliação da resposta imune em ELISA. Três dias após a última imunização os camundongos foram sacrificados para retirada do baço.

    Os mielomas da série plasmocitária (plasmacitomas) SP2/0-Ag14 foram gentilmente cedidos pelo Institute for Animal Health, Compton, Inglaterra. As células foram trabalhadas em cabine de fluxo laminar (Trox, Brasil) e cultivadas em meio Hyclone (HYQCCMTM, HycloneTM, EUA) a 37°C em estufa com atmosfera de 5% de CO2 (Napco 5100, Oregon, EUA) e observadas em microscópio de luz invertida (Olympus IX50, Japão). Monocamadas de macrófagos peritoniais em meio Hyclone foram estabelecidas nas microplacas (Corning, EUA) a serem utilizadas para cultivo pós-fusão e expansão, e mantidas em estufa com 5% de CO2 a 37°C. Os camundongos pré-testados com excelente resposta imune humoral (ELISA) foram sacrificados e transferidos para a cabine de fluxo laminar. Os esplenócitos (108) foram misturados com as células SP2/0-Ag14 (107) em meio RPMI 1640 (Sigma, EUA) e centrifugadas a 400xg/5 min. O meio sobrenadante foi desprezado e adicionado durante um minuto 1ml de polietilenoglicol (Sigma, EUA) em solução 50% (v/v) em meio de cultivo Hyclone sem soro a 37°C sob agitação suave. À mistura de células foi adicionado 1ml de meio Hyclone sem soro durante um minuto e 20ml do mesmo meio durante cinco minutos. As células foram centrifugadas (400xg/10min) em temperatura ambiente e o sobrenadante foi desprezado, sendo o precipitado ressuspendido em meio Hyclone contendo 20% de soro fetal bovino (Sigma, EUA) e 10% de suplemento para hibridoma (Sigma, EUA). As células foram distribuídas (50ml) em microplacas de cultivo celular com cultivos de macrófagos prévios (24-48 horas) e mantidas em estufa com atmosfera de 5% CO2 a 37°C. Com a evidência de crescimento de células híbridas e morte das SP2/0-Ag14 utilizou-se inicialmente o meio HT (hipoxantina e timidina) com 20% de soro fetal bovino (SFB) e posteriormente RPMI 1640 (Sigma, EUA) ou Hyclone contendo 10% de SFB. A detecção dos hibridomas positivos foi realizada em ELISA sensibilizados com VBIG purificado (3,43mg/ml) e AcM detectado por conjugado fosfatase alcalina anti-molécula inteira de IgG de camundongo (Sigma, EUA). Controles de AcM negativo (meio sobrenadante de SP2-0) e antígeno negativo (amostra La Sota do vírus da doença de Newcastle: 4,10 mg/ml) foram empregados em todas as microplacas. A detecção e identificação das classes e subclasses dos AcM foi realizada com o kit de isotipagem (Sigma, EUA) com leitura sob filtro de 405nm7. A determinação do ponto de corte (absorvância discriminante) foi feita a partir da média dos controles negativos (meio sobrenadante de SP2-0) adicionada de três vezes o valor do desvio-padrão.

    Para a clonagem, as células híbridas produtoras de anticorpo contra VBIG, detectadas em ELISA, foram diluídas para originar clones derivados de apenas uma célula (clonagem por diluição limitante) e cultivadas sobre monocamada de macrófagos alimentadores. Colônias de células originárias de um único clone foram testadas em ELISA para avaliação da produção de AcM. Os hibridomas clonados foram cultivados para expansão e examinados em microscópio de luz invertida.

    Western blotting (WB; Laemli, 1970; Towbin et al., 1979) para a identificação da especificidade dos AcM contra proteínas estruturais de VBIG foi desenvolvido com os diferentes componentes do vírus separados em eletroforese em gel de poliacrilamida (gel de aplicação 4% e separação 10%; 500 mg de proteína de VBIG; 60V para a corrida no gel de aplicação e 100V durante o gel de corrida) e transferidos para membrana de nitrocelulose a 25V/25min em sistema Semi-Dry (BioRad, EUA). O WB foi desenvolvido com tiras da transferência (nitrocelulose) em reação individual com os diferentes AcM. A revelação dos AcM especificamente aderidos foi obtida com conjugado fosfatase alcalina anti-IgG de camundongo (Sigma, EUA) e substrato r-nitrofenil fosfato (Sigma, EUA) 1mg/ml em dietanolamina-cloreto de magnésio pH 9,8.

    RESULTADOS E DISCUSSÃO

    Este é o primeiro relato da produção de AcM específicos contra VBIG no Brasil. A preparação das condições de trabalho, incluindo métodos, equipamentos e material de consumo permitiram o estabelecimento do laboratório de AcM no setor de doenças das aves da Escola de Veterinária da UFMG.

    Foram detectados pelo ELISA 85 híbridos positivos, sendo selecionados para clonagem 22 com maior reatividade (ELISA). Após a diluição limitante e clonagem dos 22 híbridos foram selecionados 39 clones estáveis que apresentaram reação mais forte no ELISA. Dos 39 clones foram selecionados 29, que foram expandidos (Tab. 1). Dos 29 clones escolhidos para expansão, apenas 12 foram selecionados por melhor se adequarem aos objetivos do projeto (Tab. 2), com especificidade exclusiva a componentes individualizados. A maioria dos clones (24 AcM) foi produtora da classe IgG. Entretanto, os AcM 7 e 55 foram identificados como da classe de IgA e os AcM 15, 52 e 71 da classe IgM. Considerando que para o ELISA de detecção de anticorpo produzido pelos híbridos empregou-se conjugado específico contra toda a molécula de IgG, e reconhecendo as cadeias pesada e leve, considerou-se natural que houvesse detecção cruzada de outras classes de imunoglobulinas, permitindo a preservação e o não descarte de clones com síntese de outra classe de imunoglobulina por detecção das cadeias leves. A predominância da classe IgG é também esperada por outro motivo, considerando-se que a metodologia de inoculação dos camundongos, que expande clones de linfócitos mais específicos e subseqüentes na ontogenia da síntese de anticorpos (Paul et al., 1967), privilegia essa classe.

    A interpretação dos resultados do western blotting (Fig. 1) permitiu considerar a especificidade dos AcM para os componentes estruturais de VBIG, tendo como base os pesos moleculares respectivos, relacionados na Tab. 2.


    Os AcM que reagiram frente a mais de uma proteína estrutural de M41 foram produzidos pelos clones 5, 12, 41, 70 e 72 (resultados não tabulados). Estes necessitam nova clonagem por diluição limitante para efetiva individualização de clones monoespecíficos. Entre estes, os AcM 41 e 72 reagiram contra três componentes estruturais, S1, S2 e N, podendo conter três diferentes clones, assim como os AcM 5, 12 e 70, que reagiram contra quatro componentes estruturais, S1, S2, N e M, que podem incluir os produtos de mais de um hibridoma. A clonagem por diluição limitante, que visa a obtenção de clone puro originado de uma única célula, foi antecipada e facilitada pela alta diluição das células pós-fusão cultivadas em grande número de microplacas após a fusão. Alguns meios sobrenadantes com reatividade mais fraca nessa fase inicial de cultivo foram deixados para clonagem posterior. Alguns desses foram incluídos no western blotting como triagem, evidenciando a necessidade de trabalho adicional de individualização das células produtoras (clonagem).

    Os resultados da caracterização dos AcM por WB evidenciaram o AcM 42 como específico contra o glicopolipeptídeo S1 (Fig. 1), o qual está relacionado à resposta imune protetora. A caracterização quanto à capacidade neutralizante desse AcM in vitro não foi realizada. AcM específicos contra S1 podem ser ferramentas úteis para o estudo das relações antigênicas entre amostras de VBIG. O AcM poderá ser utilizado para a detecção de M41 e amostras relacionadas antigenicamente. Considerando que Mockett et al. (1984) caracterizaram AcM específicos contra S1, produzidos pelos clones A13 e A38, evidenciando serem estes amostra-específicos, ou seja, com capacidade neutralizante específica apenas contra M41, acredita-se, de forma semelhante, que o AcM 42 seja de especificidade restrita para M41 e pode, assim, expressar exclusivamente contra esse, atividade neutralizante e inibidora da hemaglutinação, as quais são atividades biológicas relacionadas com S1. Dessa forma, ensaios poderão ser desenvolvidos utilizando o AcM 42 com a finalidade de detecção e estudo de amostras antigenicamente relacionadas com M41 em tecidos e material experimentalmente ou naturalmente infectados, assim como a discriminação das relações antigênicas entre as amostras de campo com a amostra M41, conforme descrito por Souza (1999).

    De acordo com a especificidade, a caracterização por western blotting indicou que o AcM 3 apresentou reatividade contra S, 43 contra S2, 34 contra S2, 71 contra S2, 50 contra N, 22 contra M, 42 contra S1 e, apesar da detecção de especificidade por ELISA, os AcM 4, 6, 63 e o CPN não apresentaram reatividade em western blotting. O controle policlonal positivo (CPP) reconheceu todas as bandas protéicas estruturais de VBIG.

    As bandas protéicas reconhecidas pelos AcM apresentaram pesos moleculares que variavam entre 180 e 30 KDa, sendo que alguns AcM (5; 12; 41; 70; 72) reconheceram mais de um componente do vírus (resultados não apresentados), necessitando subclonagem por diluição limitante para individualização de clones puros. Os clones cujos anticorpos foram detectados em ELISA (4; 6; 48; 55; 63; 65; 73) e não reativos em immunobloting, não reconheceram nenhuma estrutura do VBIG, o que sugere serem específicos para determinante(s) antigênico(s) que podem ter sofrido modificação da conformação tridimensional nas condições e durante o teste de western blotting.

    Os AcM 34, 43 e 71, dirigidos contra o glicopolipeptídeo da subunidade S2 da proteína S, podem também ser usados em estudos antigênicos de amostras de VBIG, considerando que, segundo Cavanagh et al. (1992), a subunidade S2 é de estrutura fenotípica mais conservada de VBIG, por estar mais interiorizada, não sendo submetida à pressão de seleção dos anticorpos. Outros autores (Koch et al., 1986) descreveram AcM específicos contra S2 que apresentaram reações cruzadas com muitas amostras de VBIG, incluindo americanas e holandesas, embora alguns tenham reagido apenas a dois sorotipos, Massachusetts (americano) e D212-D1466 (holandesa). Embora haja reatividade cruzada, os autores puderam agrupar as amostras de VBIG holandesas em grupos distintos utilizando um painel de quatro AcM anti-S2. Entre os AcM anti-S2 produzidos neste trabalho (34, 43, 71) espera-se, também, a possibilidade de reatividade cruzada destes contra diferentes amostras e sorotipos de VBIG, tendo em vista o caráter mais conservado da glicoproteína S2 e, assim, possibilitar classificação de amostras de campo em grupos quanto ao aspecto antigênico de S2. Ao se avaliar os AcM anti-S2 para a reatividade a amostras de referência de diferentes sorotipos, caracterizadas por outros ensaios de referência (soroneutralização), poder-se-á obter subsídios de discriminação para o uso dos AcM nos estudos das afinidades antigênicas das amostras de VBIG de campo. Para fins de diagnóstico, em ensaios de detecção de VBIG, dever-se-á selecionar o AcM com reatividade cruzada mais abrangente entra as amostras disponíveis.

    Os AcM que se ligaram às subunidades S1+S2 juntas (3, 18, 52 e 57) e não somente a uma ou outra, podem estar relacionados ao reconhecimento de sítios que se tornam evidentes para o sistema imune quando S1+S2 estão conjugadas. Estes sítios podem ser de conformação, que se alteram em certas condições, por exemplo, iônicas, de pH, hidrofóbicas ou hidrofílicas, a qual pode ter sido perdida com a separação desses componentes estruturais. Mockett et al. (1984) inocularam os camundongos separadamente com as proteínas estruturais do envelope S1, S2 e M purificadas e não encontrou reatividade dos AcM contra S íntegra em western blotting. Os resultados descritos podem estar de acordo com os dos autores citados, considerando a possível ausência da estrutura tridimensional, dependente da associação de S1 e S2, nas preparações de glicoproteína purificada utilizadas. Considerando a especificidade desses AcM, eles podem ter alguma aplicação experimental em estudos da interação entre as subunidades S1 e S2 que, segundo Cavanagh (1983a,b), formam as grandes projeções do envelope pela associação de duas cópias de cada subunidade.

    Os AcM (15 e 50) com especificidade ao polipeptídeo N do VBIG, que possui peso molecular correspondente a 54 kDa, podem ser utilizados na detecção de VBIG, independente do sorotipo, já que esse polipeptídeo forma estrutura de composição mais conservada, com a seqüência de aminoácidos pouco variável (Koch et al., 1991).

    Naqi (1990) descreveu um ensaio de imunoperoxidase baseado em AcM para o diagnóstico de infecção por VBIG em tecidos infectados por M41, concluindo ser o ensaio de alta sensibilidade, conveniente e econômico. Outras vantagens citadas pelo autor incluiram a possibilidade de avaliação da morfologia do tecido e da disponibilização de registro permanente para futuros estudos. Pode-se especular que ao utilizar os AcM 15 e 50 poder-se-á detectar quaisquer amostras de VBIG. Com esse objetivo, pode-se desenvolver ensaio, por exemplo ELISA de captura ou detecção in situ de VBIG, utilizando os AcM específicos contra N. Estes, devido à especificidade ao VBIG dirigida a uma estrutura quimicamente conservada, deverão produzir menor índice de resultados falsos negativos que ocorreriam com o uso de AcM contra estruturas com regiões hipervariáveis, como as glicoproteínas do envelope, especialmente S1. AcM contra S2 foram utilizados para a classificação de amostras (Koch et al., 1986). Entretanto, objetiva-se com os AcM específicos para componentes do envelope, especialmente S1 (AcM 42), desenvolver ensaios capazes de determinar o sorotipo, diagnóstico que tem o objetivo de poder orientar adequadamente as estratégias de escolha de amostras vacinais e programas de vacinação.

    Os AcM 7 e 22, que reagiram contra a glicoproteína da membrana (M), de 30 kDa, podem ser utilizados em estudos de amostras de campo para caracterização antigênica e estudos evolutivos das amostras. A dinâmica da infecção por VBIG nos plantéis comerciais pode estar permitindo além de altos níveis de mutação, usualmente encontráveis em vírus RNA (Holmes, 1990), recombinação genética resultante da estratégia de replicação com vários RNAm, uma vez que M foi destacada como importante indicação de recombinação de amostras de VBIG (Cavanagh & Davis, 1988). Acredita-se que a recombinação também seja importante forma de geração de novas amostras geneticamente distintas no ambiente avícola nacional, como conseqüência, talvez e principalmente, da vacinação em múltiplas datas e de modo não uniforme em lotes próximos, em granjas ou áreas de alta densidade avícola. A utilização de AcM anti-M da amostra M41 pode ajudar a esclarecer, por exemplo entre amostras de campo brasileiras que possuam genes de S1 de uma origem e genes de M de outra, a existência local de recombinação, permitindo sugerir alterações nos programas de vacinação para minimizar essa ocorrência, uniformizando os programas em locais com idades múltiplas, como núcleos e granjas próximas (comunicação pessoal: J.S. Resende e N.R.S. Martins).

    Os AcM não reativos, que não reconheceram nenhuma estrutura da amostra M41 do VBIG, podem ser específicos para determinante antigênico de conformação, considerando que reagiram no ELISA de triagem ao VBIG íntegro. Os determinantes antigênicos podem ter sofrido modificação de configuração ou de aspecto tridimensional da molécula protéica estrutural durante a execução do western blotting (Promega..., 1996), na qual pode ocorrer desnaturação de proteínas, com modificação de determinantes antigênicos de conformação e alteração de sensibilidade frente a testes que dependam da forma de apresentação molecular.

    Até o momento desta publicação não se tem notícia de trabalho prévio no desenvolvimento de anticorpos monoclonais específicos contra o vírus da bronquite infecciosa das galinhas no Brasil, significando que se trata de descrição inédita no país.

    CONCLUSÕES

    Este é o primeiro relato da produção de AcM específicos contra o vírus da bronquite infecciosa das galinhas no Brasil. Os ELISA padronizados e utilizados, empregando VBIG concentrado por sulfato de amônia, foram eficientes para testar a resposta imune humoral dos camundongos e detectar hibridomas produtores de AcM. O western blotting com VBIG concentrado por sulfato de amônia permitiu a caracterização da especificidade dos AcM quanto ao componente estrutural de VBIG. Foi produzido e caracterizado um painel de 12 clones produtores de AcM para as estruturas S1, S2, N e M do VBIG amostra M41. Quatro clones são produtores de AcM contra a glicoproteína S íntegra. Foram gerados também clones produtores de AcM detectados em ELISA mas não em western blotting que podem estar reconhecendo estruturas terciárias da proteína.

    AGRADECIMENTOS

    Os autores agradecem o apoio financeiro concedido pela FAPEMIG, CNPq e FEPMVZ-Coordenação Preventiva. A prestativa assistência laboratorial de Tânia Mara Gomes de Pinho (ICB) e apoio técnico de Elizabeth Dias Bontempo (MSc) são creditadas.

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    * Autor para correspondência E-mail: rodrigo@vet.ufmg.br

    Datas de Publicação

    • Publicação nesta coleção
      07 Jun 2002
    • Data do Fascículo
      Jun 2001

    Histórico

    • Recebido
      15 Fev 2001
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