Atividade antimicrobiana e citotoxicidade in vitro do óleo essencial de Tagetes minuta L. visando à aplicação no controle da mastite bovina

In vitro antibacterial and cytotoxicity activities of Tagetes minuta L. essential oil towards bovine mastitis treatment

J. Sperandio B. Veleirinho L.A. Honorato L.H. Campestrini S. Kuhnen Sobre os autores

RESUMO

O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antimicrobiana in vitro do óleo essencial de Tagetes minuta L. contra Staphylococcus aureus e Escherichia coli e a citotoxicidade sobre células epiteliais da glândula mamária bovina (MAC-T), visando a seu uso no tratamento da mastite bovina. A análise qualitativa do óleo revelou cis-tagetona (24,24%), di-hidrotagetona (16,65%), 1,3,6-octatrieno-3,7-dimetil-E (13,61%), trans-ocimenona (13,52%) e cis-ocimenona (10,06%) como compostos majoritários. Nos ensaios da atividade antimicrobiana, a concentração inibitória mínima (CIM) verificada foi de 1 mg/mL para a cepa padrão (ATCC 25923), cinco isolados de S. aureus provenientes de leite de vacas com mastite e a cepa padrão resistente à meticilina (MRSA) (ATCC 33592). Para a cepa padrão de E. coli (ATCC 8739) e dois isolados de leite de vacas com mastite, a CIM foi de 3 mg/mL. Elevado efeito citóxico do óleo sobre as células da linhagem MAC-T foi constatado. Concentrações superiores a 10 (g/mL do óleo resultaram em mais de 90% de morte celular. Tais resultados sugerem que, apesar da atividade antimicrobiana contra agentes causadores da mastite bovina, a utilização intramamária do óleo de T. minuta não seria recomendada. É importante destacar a sensibilidade da cepa MRSA ao óleo essencial, o que evidencia seu potencial como antisséptico e sanitizante.

Palavras-chave:
atividade antimicrobiana; Tagetes minuta; mastite; produtos naturais

ABTRACT

The aim of this study was to evaluate the in vitro antimicrobial activity of Tagetes minuta L. essential oil against Staphylococcus aureus and Escherichia coli, and its cytotoxicity to bovine mammary epithelial cells (MAC-T line), aiming at its use for bovine mastitis treatment. The qualitative analysis of the oil by GC-MS identified cis-tagetone (24.24%), dihydrotagetone (16.65%), 1,3,6-Octatriene 3,7-Dimethyl-E (13.61%); trans-ocimenone (13.52%) and cis-ocimenone (10.06%) as major compounds. Antimicrobial activity was determined by broth microdilution technique and revealed the minimum inhibitory concentration of 1mg/mL for the standard strain of S. aureus (ATCC 25923) and five bacterias isolated from mastitic milk, including a multiresistant strain (ATCC 33592); and 3mg/ml for the standard strain of E. coli (ATCC 8739) and two bacterias isolated from mastitic milk. However, a strong citotoxic effect on MAC-T cells was found. Oil concentrations from 10(g/mL resulted in over 90% of cell death. The results suggest that although the antimicrobial activity was identified against the main agents of bovine mastitis, the intramammary use of T. minuta oil may not be recommended. On the other hand, it is important to highlight the sensibility of the MSRA strain to the essential oil, which evidences its potential as an antiseptic or sanitizer.

Keywords:
antimicrobial activity; Tagetes minuta; mastitis; natural products

INTRODUÇÃO

A mastite é a inflamação do parênquima da glândula mamária, responsável por mudanças físicas e químicas no leite, além de alterações histológicas. Essa infecção é causada comumente por bactérias, além de fungos e algas (Divers e Peek, 2008DIVERS, T.J.; PEEK, S.F. Rebhun's diseases of dairy cattle. 2.ed. Philadelphia: Saunders, 2008. 704p.). Os agentes etiológicos podem ser classificados em organismos contagiosos ou causadores de mastite ambiental. Os agentes contagiosos são transmitidos por vacas que apresentam glândulas mamárias infectadas para vacas sadias. Entre esses, a bactéria Staphylococcus aureus é a de maior ocorrência (Smith, 2009SMITH, B.P. Large animal internal medicine. 4.ed. St. Louis: Mosby, 2009. 1872p.). Os organismos classificados como ambientais são aqueles presentes no ambiente onde está a vaca, como o solo, a água, o esterco, a cama, etc. Nesse grupo, a bactéria mais patogênica é a Escherichia coli (Divers e Peek, 2008).

Por se tratar de uma doença comumente causada por bactérias, a classe medicamentosa mais utilizada para o tratamento da mastite é a dos antimicrobianos (Smith, 2009SMITH, B.P. Large animal internal medicine. 4.ed. St. Louis: Mosby, 2009. 1872p.; Divers e Peek, 2008DIVERS, T.J.; PEEK, S.F. Rebhun's diseases of dairy cattle. 2.ed. Philadelphia: Saunders, 2008. 704p.). No entanto, o uso indiscriminado desses fármacos tem promovido preocupação quanto a sua utilização e ao desenvolvimento da resistência das bactérias aos medicamentos, que pode se perpetuar ao longo da cadeia produtiva do leite até à mesa do consumidor (White e Mcdermott, 2001WHITE, D.G.; MCDERMOTT, P.F. Emergence and transfer of antibiotic resistance. J. Dairy Sci., v.84, Suppl., p.E151-E155, 2001.).

Ao avaliarem a resistência bacteriana diante de antibióticos, Medeiros et al. (2009MEDEIROS, E.S.; MOTA, R.A.; SANTOS, M.V. et al. Perfil de sensibilidade microbiana in vitro de linhagens de Staphylococcus spp. isoladas de vacas com mastite subclínica. Pesqui. Vet. Bras., v.29, p569-574, 2009.) reportaram que dos 291 isolados deStaphylococcusspp., 181 eram multirresistentes aos diferentes fármacos estudados. Já Vieira et al. (2012VIEIRA, T.S.W.J.; RIBEIRO, M.R.; NUNES, M.M. et al. Detecção de resíduos de antibióticos em amostras de leite pasteurizado do Estado do Paraná, Brasil. Semin. Ciênc. Agrár., v.33, p.791-796, 2012.) encontraram resíduos de antibióticos em 19% de 79 amostras de leite pasteurizado tipo B coletadas em estabelecimentos comerciais no estado do Paraná. Portanto, embora haja uma legislação regulamentando a presença desses resíduos, não há rigor, por parte dos produtores, em cumpri-la e, tampouco, uma fiscalização eficiente por parte de órgãos fiscalizadores. Em contraponto a esse cenário, há uma fração crescente da população que se preocupa com a origem do produto que está na sua mesa, impulsionando a produção de alimentos orgânicos em todo o mundo, inclusive no Brasil.

No entanto, um dos grandes entraves à produção orgânica leiteira é o manejo sanitário, sobretudo o da mastite, uma vez que o leite de vacas medicadas deve ser descartado durante duas vezes o período de tempo de carência do medicamento (Brasil, 2011). Sanches e Soares (2012SANCHES, C.R.; SOARES, J.P.G. Certificação da produção orgânica de leite. In: SOARES, J.P.G. (Ed.). Curso cadeia produtiva do leite orgânico. Brasília: Embrapa, 2012.) destacam que alguns estudos têm proposto investigar o uso de plantas medicinais, incluindo seus óleos essenciais, para o tratamento da mastite bovina. Dentre eles, destacam-se o estudo da atividade antibacteriana do óleo de canela-da-china (Cinnamon cassia) e o de capim-limão (Cymbopogon citrates) contra patógenos causadores de mastite (Zhu et al., 2016ZHU, H.; DU, M.; FOX, L.; ZHU, M.J. Bactericidal effects of Cinnamon cassia oil against bovine mastitis bacterial pathogens. Food Control, v.66, p.291-299, 2016.; Aiemsaard et al., 2011AIEMSAARD, J.; AIUMLAMAI, S.; AROMDEE, C. et al. The effect of lemongrass oil and its major components on clinical isolate mastitis pathogens and their mechanisms of action on Staphylococcus aureus DMST 4745. Res. Vet. Sci., v.91, p.31-37, 2011. ).

A planta Tagetes minuta L. é nativa da América do Sul e popularmente conhecida como chinchilho (Holm et al., 1997HOLM, L.D.J. et al. Tagetes minuta L. asteraceae (Compositae) aster family. In: _____. et al. World weeds: natural histories and distribution. New York: John Wiley & Sons, 1997. p.822-827.). É uma planta pouco ramificada, que pode chegar até 2 metros de altura, e se caracteriza pelo forte odor proveniente do óleo produzido por glândulas presentes nas folhas (Lorenzi, 2008LORENZI, H. Plantas medicinais no Brasil - nativas e exóticas. 2.ed. São Paulo: Nova Odessa, 2008. 512p.). Os extratos e o óleo da T. minuta vêm sendo estudados por suas propriedades medicinais (Lorenzi, 2008), bem como por sua atividade inseticida (Cestari et al., 2004CESTARI, I.M.; SARTI, S.J.; WAIB, C.M.; CASTELLO BRANCO JR, A. Evaluation of the potential inseticide activity of Tagetes minuta (Asteraceae) essencial oil against the head lice Pediculus humanus capitis (Phthiraptera: Pediculidae). Neotrop. Entomol., v.33, n.6, 2004.), repelente (Gillij et al., 2008GILLIJ, Y.G.; GLEISER, R.M.; ZYGADLO, J.A. Mosquito repellent activity of essential oils of aromatic plants growing in Argentina. Bioresour. Technol., v.99, p.2507-2515, 2008.), nematicida (Junges et al., 2009JUNGES, E.; MORENO, M.; LIMA, D.; GOMES, C. Efeito do extrato aquoso e do óleo essencial de Tagetes minuta aplicados ao solo sobre a penetração de J2 de Meloidogyne incognita em tomateiros. Rev. Bras. Agroecol., v.4, p.1027-1030, 2009.), antioxidante, anti-inflamatória (Karimian et al., 2014KARIMIAN, P.; KAVOOSI, G.; AMIRGHOFRAN Z. Anti-oxidative and anti-inflammatory effects of Tagetes minuta essential oil in activated macrophages. Asian Pac. J. Trop. Biomed., v.4, p.219-227, 2014.; Holm et al., 1997) e antimicrobiana (Senatore et al., 2004SENATORE, F.; NAPOLITANO, F.; MOHAMED, M.A.H. et al. Antibacterial activity of Tagetes minuta L. (Asteraceae) essential oil with different chemical composition. Flavour Frag. J., v.19, p.574-578, 2004.; Souza et al., 2000SOUZA, C.A.S.; AVANCINI, C.A.M.; WIEST, J.M. Atividade antimicrobiana de Tagetes minuta L.- Compositae (Chinchilho) frente a bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci., v.37, p.1-9, 2000. ). Senatore et al. (2004) avaliaram a atividade antimicrobiana do óleo proveniente de diferentes origens, tendo verificado CIMs que variaram entre 6,25 e 25 μg/mL para bactérias Gram-positivas e entre 25 e 50 μg/mL para as Gram-negativas. A despeito do seu potencial como antimicrobiano, nenhum dos estudos realizados com T. minuta incluiu a avaliação dos possíveis efeitos tóxicos do extrato ou do óleo essencial ao tecido da glândula mamária, visando ao seu uso intramamário. Portanto, o objetivo nesta pequisa foi avaliar, in vitro, a atividade antimicrobiana do óleo essencial de Tagetes minuta L. em relação a duas principais bactérias causadoras de mastite bovina, i.e., S. aureus e E. coli, assim como a citotoxicidade sobre células epiteliais da glândula mamária bovina da linhagem MAC-T.

MATERIAL E MÉTODOS

Sementes de Tagetes minuta L. foram adquiridas comercialmente, e as mudas obtidas foram transferidas para o solo da Fazenda Experimental da Ressacada, da Universidade Federal de Santa Catarina (Florianópolis, SC). As plantas não apresentaram ataques por insetos, tendo sido realizado apenas o manejo preventivo com a pulverização de óleo de neem (três vezes) e a aplicação de biofertilizante (seis vezes) contendo urina de vaca, ao longo da permanência das plantas no campo. A coleta foi realizada em dezembro de 2015, durante a floração das plantas, cerca de oito meses após o transplante das mudas. Logo após a coleta, as plantas foram pesadas e acondicionadas em estufa de ventilação forçada, por um período de 24 h, e depois armazenadas em freezer a -80°C para posterior extração do óleo.

A extração do óleo essencial foi feita por hidrodestilação, em aparelho Clevenger, pelo período de duas horas (Mechkovski e Akerele, 1992MECHKOVSKI, A.; AKERELE, C.O. Quality control methods for medicinal plant materials. Switzerland: World Health Organization, 1992. 122p.). Foram utilizadas cerca de 70 g de matéria seca da parte aérea da planta e 1000 mL de água em um balão volumétrico. O rendimento de óleo foi determinado pela graduação da bureta do aparelho Clevenger, levando em consideração o peso da planta no balão de extração e a quantidade de óleo obtida. O óleo foi armazenado a -20°C até a realização das análises pretendidas.

A determinação da composição química do óleo extraído de T. minuta foi realizada em cromatógrafo gasoso acoplado a espectrômetro de massas (Shimadzu - Japão; modelo GCMS-QP2010), de acordo com a metodologia descrita por EL-Deeb et al. (2004). Para isso, foi utilizada uma coluna capilar de sílica RTX®-5MS (Restek - Japão; 30m x 0,25mm) e hélio como gás de arraste, em um fluxo de 25mL/min. A temperatura utilizada variou de 60 a 200°C, com um aumento de 10°C/min. A injeção foi realizada em modo split: 1:50, contendo 200 μL da amostra (200 μL + 400 μL de hexano). A identificação dos compostos foi realizada considerando-se os resultados obtidos em bibliotecas de massas, por meio do software GCMSSolution (EL-Deeb et al., 2004).

Os testes antimicrobianos foram realizados pela técnica de microdiluição em caldo, conforme a metodologia descrita na Norma M7-A6 do Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (Methods..., 2006), para determinação da concentração inibitória mínima (CIM). Foram utilizadas cepas padrão de Staphylococcus aureus ATCC 25923 e cinco isolados de campo provenientes de leite mastítico, uma cepa de S. aureus ATCC 33592 resistente à meticilina (MRSA), Escherichia coli ATCC 8739 e dois isolados de campo de E. coli. Os isolados bacterianos foram semeados por plaqueamento em superfície, em placas de Petri, com meio Agar Muller Hinton, e as placas incubadas a 35ºC±2ºC por 24 h. A densidade populacional inicial dos inóculos foi padronizada utilizando-se o controle de turbidez da escala McFarland de 0,5, o qual equivale a uma suspensão contendo de 107 a 108 UFC/mL. Nos testes, foi utilizada a diluição de 105 UFC/mL do inóculo em solução salina (0,9%).

O óleo essencial foi preparado por emulsificação, com etanol (8%), em diferentes concentrações, que variaram de 30 a 0,01 mg/mL. Para a realização do ensaio, em cada poço de uma microplaca de 96 poços, foram adicionados 100 μL da emulsão, 100 μL de caldo Muller Hinton e 10 μL do inóculo (105 UFC/mL). A placa foi acondicionada a 35ºC±2ºC, por cerca de 18 a 24 h. Em todos os ensaios, incluíram-se os controles negativos, que consistiram em (a) inóculo + meio Muller Hinton e (b) diferentes concentrações da emulsão + caldo Muller Hinton. O caldo sem bactéria foi utilizado como controle estéril. Além disso, inicialmente o efeito antimicrobiano do etanol 8% (inóculo + meio Muller Hinton + etanol 8%) foi testado, não tendo sido encontrada redução do crescimento bacteriano na concentração utilizada. Após o período de incubação das microplacas, as absorbâncias foram determinadas a 600 nm, em um leitor de microplacas (EL808, Bio-Tek Instruments, Inc.), e a porcentagem de redução do crescimento bacteriano foi calculada conforme a equação:

ICM (%) = [1- (Ac/A0)] x 100,

em que: ICM representa a inibição do crescimento microbiano, Ac representa a absorbância da concentração de óleo testada subtraída do valor da absorbância da mesma concentração do óleo sem a adição do inóculo e A0 representa a média das absorbâncias do controle de crescimento microbiano (sem óleo) (Gudiña et al., 2010GUDIÑA, E.J.; ROCHA, V.; TEIXEIRA, J.A.; RODRIGUES, L.R. Antimicrobial and antiadhesive properties of a biosurfactant isolated from Lactobacillus paracasei ssp. Paracasei A20. Lett. Appl. Microbiol., v.50, p.419-424, 2010.). O resultado quantifica a porcentagem de células microbianas que foram inibidas pela ação do óleo essencial. Estabeleceu-se que a concentração que apresentasse um percentual de inibição superior a 80% seria considerada a CIM (Methods..., 2006). Para uma confirmação visual, após a leitura dos valores de absorbância, utilizou-se o revelador resazurina (100 µg/mL). Foram adicionados 50 µL do revelador em cada um dos poços das microplacas. No decorrer de 30 min para S. aureus e 2 horas para E. coli, foi realizada a leitura, que consistiu na avaliação das cores azul, representando ausência de crescimento bacteriano, e rosa, representando a presença de crescimento bacteriano. Esse processo ocorre por meio de uma reação de redução da resazurina em resarufina (Palomino et al., 2002PALOMINO, J.C.; MARTIN, A.; CAMACHO, M. et al. Resazurin microtiter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother., v.46, p.2720-2722, 2002.).

O teste de citotoxicidade foi realizado sobre células epiteliais da glândula mamária bovina da linhagem MAC-T para verificar a concentração inibitória de 50% de crescimento celular (IC50). As células foram cultivadas em meio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) e suplementadas com 20% de soro fetal bovino (SFB), 4 mM de L-glutamina, 4,5 g/L de glucose, 1 mM de piruvato de sódio, 1,5 g/L de bicarbonato de sódio, 5 μg/mL de insulina e 1 μg/mL de hidrocortisona. O meio foi trocado a cada 48 h, as células mantidas em cultura a 37°C, e a atmosfera modificada a 5% de CO2. Quando as células atingiam confluência, foram tratadas com 0,25% de tripsina, lavadas com PBS e contadas em câmara de Neubauer. Os testes foram executados em microplacas de 96 poços e foi utilizada a concentração de 10.000 células por poço. A citotoxicidade do óleo sobre as MAC-T foi realizada pelo método do brometo de 3-4,5-dimetiltiazol-2-il-2,5-difeniltetrazólio (MTT), com modificações. Para isso, ao meio de cultura contendo as células aderentes, foram acrescidas diferentes concentrações do óleo essencial (0,1 a 1000 µg/mL) emulsificado em DMSO (dimetilsulfóxido; 0,5%) e DMEM (100 µL/poço). Após 24h de incubação a 37oC em atmosfera modificada contendo 5% de CO2, os poços foram lavados duas vezes com PBS (100 µL/poço), e o MTT (0,5 mg/mL) foi adicionado e incubado por mais 2 h. Neste ensaio, quantifica-se quanto do MTT presente no meio é metabolizado a formazan (cristais de cor azul) (Reuter et al., 2008REUTER, S.; EIFES, S.; DICATO, M. et al. Modulation of anti-apoptotic and survival pathways by curcumin as a strategy to induce apoptosis in cancer cells. Biochem. Pharmacol., v.76, p.1340-1351, 2008. ).

Assim, a quantidade de formazan foi medida por espectrofotometria, em leitor de microplacas a 546 nm (EL808, Bio-Tek Instruments, Inc.), e considerada diretamente proporcional ao número de células viáveis. O controle (i.e., meio fresco contendo 0,5% de DMSO) foi considerado como 100% de células viáveis. Os experimentos foram realizados em triplicata. O cálculo do IC50 foi feito por meio do programa Prism 5 (Graph Phad, San Diego, CA).

Para os ensaios antimicrobianos, a variável % de inibição foi analisada pelo procedimento MIXED do SAS (versão 9.2). Para análise de E. coli, o modelo incluiu o efeito fixo do isolado (1 grau de liberdade = GL), a concentração (7 GL) e sua interação (7 GL); para S. aureus, os efeitos fixos de isolado (4 GL) e a concentração (7 GL). Comparações pareadas foram determinadas por meio do LSMEANS. Foram utilizadas as médias de dois experimentos independentes, com cinco réplicas cada. Na análise da cepa de S. aureus multiresistente, foram testadas oito concentrações (7GL) e foi realizada uma repetição do experimento. Para o teste de citotoxicidade, foram utilizadas as médias de três experimentos independentes, com seis réplicas cada. Neste caso, os dados foram analisados por ANOVA, com P<0,01, mediante a utilização do programa Prism 5 (Graph Phad, San Diego, CA).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A caracterização química do óleo de T. minuta em estudo mostrou que os componentes majoritários foram cis-tagetona (24,24%), di-hidrotagetona (16,65%), 1,3,6-octatrieno-3,7-dimetil-E (13,61%), trans-ocimenona (13,52%) e cis-ocimenona (10,06%) (Tab.1). Tais resultados diferem dos encontrados por Garcia et al. (2012GARCIA, M.V.; MATIAS, J.; BARROS, J.C. et al. Chemical identification of Tagetes minuta Linnaeus (Asteraceae) essential oil and its acaricidal effect on ticks. Rev. Bras. Parasitol. Vet., v.21, p.405-411, 2012.), que verificaram, em amostras provenientes da região Centro-Oeste do Brasil, maiores teores de di-hidrotagetona (54,21%), limoneno (6,96%), tagetona (6,73%) e β-ocimeno (5,11%). Por outro lado, Gil et al. (2000GIL, A.; GHERSA, G.M.; LEICACH, S. Essential oil yield and composition of Tagetes minuta accessions from Argentina. Biochem. Syst. Ecol., v.28, p.261-274, 2000. ) constataram, em amostras da Argentina, maiores quantidades de di-hidrotagetona, a-felandrena, limoneno, o-cimeno, b-ocimeno, tagetona e tagetenona. Esses resultados demonstram, portanto, que a composição química do óleo varia muito com o local do cultivo. Em relação ao rendimento do óleo essencial das amostras em estudo, encontrou-se 1,57%. Singh et al. (2006SINGH, A.; KHANUJA, S.P.S.; ARYA, S.J.K. et al. Essential oil quality and yield with respect to harvest index in Tagetes minuta cultivated in sub tropical plains of North India. J. Essent. Oil Res., v.18, p.362-365, 2006. ) encontraram resultados similares quando avaliaram o rendimento do óleo em plantas de T. minuta cultivadas em região subtropical do norte da Índia.

Tabela 1
Composição química do óleo de T. minuta em estudo

Na Fig. 1, estão representadas as curvas de inibição do crescimento de S. aureus (ATCC 25923 e isolados de campo), E. coli (ATCC 8739 e isolados de campo) e S. aureus resistente à meticilina (MRSA) (ATCC 33592). Para S. aureus, 1 mg/mL do óleo essencial reduziu cerca de 80% do crescimento bacteriano (Fig. 1A). A revelação da placa com o corante resazurina após a leitura em espectrofotômetro confirmou que 1 mg/mL do óleo é a concentração inibitória mínima (CIM) para esse micro-organismo. Esse valor está acima do encontrado por Senatore et al. (2004SENATORE, F.; NAPOLITANO, F.; MOHAMED, M.A.H. et al. Antibacterial activity of Tagetes minuta L. (Asteraceae) essential oil with different chemical composition. Flavour Frag. J., v.19, p.574-578, 2004.), que testaram o óleo essencial de T. minuta proveniente de diferentes países, para essa mesma espécie de bactéria. Os valores de CIM registrados pelos autores foram de 25, 50 e 100 μg/mL, para amostras do Reino Unido, Egito e África do Sul, respectivamente. Enquanto o óleo do Reino Unido apresentava maiores teores de di-hidrotagetona (34,3%), cis-tagetona (23%) e trans-tagetona (17,1%), os óleos essenciais originários do Egito e da África do Sul possuíam maiores teores de cis-β-ocimenona (50,9 e 32,2%, respectivamente). Já Shizari et al. (2014SHIZARI, M.T.; GHOLAMI, H.; KAVOOSI, G. et al. Chemical composition, antioxidant, antimicrobial and cytotoxic activities of Tagetes minuta and Ocimum basilicum essential oils. Food Sci. Nut., v.2, p.146-155, 2014.), ao avaliarem a atividade do óleo de T. minuta cultivado no Irã, verificaram que a CIM para S. aureus foi de 67±8 μg/mL, resultado também muito inferior ao encontrado no presente estudo. O óleo testado possuía maiores teores de di-hidrotagetona (33,9%), E-ocimenona (19,9%) e tagetona (16,1%).

Figura 1
Concentração inibitória mínima (mg/mL) (média +/- erro-padrão da média) do óleo essencial de Tagetes minuta sobre (A) Staphylococcus aureus (ATCC 25923 e isolados de campo), (B) Escherichia coli ((ATCC 8739 e (isolados de campo) e (C) Staphylococcus aureus MRSA (ATCC 33592). (A, C) Letras minúsculas diferentes representam diferenças estatísticas entre as concentrações (P<0,01). (B) Letras minúsculas diferentes representam diferenças estatísticas entre as concentrações, e letras maiúsculas diferentes representam diferenças estatísticas entre as bactérias (P<0,001).

Para E. coli, foi observada diferença entre a CIM encontrada para a cepa-padrão ATCC 8739 (1 mg/mL) e para o isolado de campo (3 mg/mL) (Fig. 1B). Tais diferenças podem ser, em parte, explicadas pela diversidade genética entre elas, o que acarreta resistência distinta. Um isolado de campo tende a ser mais agressivo quando comparado a uma cepa de referência. Contudo, tais resultados de CIM se diferenciam dos encontrados também por Senatore et al. (2004SENATORE, F.; NAPOLITANO, F.; MOHAMED, M.A.H. et al. Antibacterial activity of Tagetes minuta L. (Asteraceae) essential oil with different chemical composition. Flavour Frag. J., v.19, p.574-578, 2004.). Esses autores observaram uma CIM de 100 μg/mL para E. coli. Da mesma forma, Shizari et al. (2014SHIZARI, M.T.; GHOLAMI, H.; KAVOOSI, G. et al. Chemical composition, antioxidant, antimicrobial and cytotoxic activities of Tagetes minuta and Ocimum basilicum essential oils. Food Sci. Nut., v.2, p.146-155, 2014.) registraram 90% de inibição dessas bactérias com 165±9 μg/mL de óleo, valor muito inferior ao encontrado no presente estudo. Esses valores superiores de CIM, do presente estudo, podem ser decorrentes da variação existente na composição química do óleo. Desse modo, variações na composição química do óleo decorrentes do local de cultivo precisam ser mais investigadas antes de se sugerir o seu uso terapêutico. Os diversos estudos que avaliaram o óleo essencial da T. minuta por CG-MS indicaram que os terpenos presentes variam em quantidade e qualidade, de acordo com o estágio de crescimento da planta no momento do corte (Moghaddam et al., 2007MOGHADDAM, M.; OMIDBIAGI, R.; SEFIDKON, F. Changes in content and chemical composition of Tagetes minuta oil at various harvest times. J. Essent. Oil Res., v.19, p.18-20, 2007.), a localização geográfica, os nutrientes presentes no solo (Singh et al., 2006SINGH, A.; KHANUJA, S.P.S.; ARYA, S.J.K. et al. Essential oil quality and yield with respect to harvest index in Tagetes minuta cultivated in sub tropical plains of North India. J. Essent. Oil Res., v.18, p.362-365, 2006. ), a parte da planta colhida (Chamorro et al., 2008CHAMORRO, E.R.; BALLERINI, G.; SEQUEIRA, A.F.; VELASCO, G.A. et al. Chemical composition of essential oil from Tagetes minuta L. leaves and flowers. J. Argent. Chem. Soc., v.96, p.80-86, 2008.), entre outros.

No teste com a cepa de S. aureus resistente à meticilina ATCC 33592, a CIM encontrada foi de 1 mg/mL (Fig. 1C), de maneira similar a cepa-padrão de S. aureus ATCC 25923 e os isolados de campo. Esse resultado gera uma expectativa promissora quanto ao desenvolvimento de um produto que possa ser usado no controle de bactérias resistentes à meticilina, uma vez que esta é causa frequente de morbimortalidade, principalmente em pacientes imunodeprimidos, embora o seu mecanismo de ação precise ser investigado (Luna et al., 2010LUNA, C.M.; RODRIGUEZ-NORIEGA, E.; BAVESTRELLO, L.; GOTUZZO, E. Tratamento de Staphylococcus aureus resistente à meticilina na América Latina. Braz. J. Infect. Dis., v.14, Suppl.2, p.S121-S129, 2010.).

Quanto ao efeito do óleo essencial sobre as células epiteliais da glândula mamária, verificou-se alta citotoxicidade com uma inibição de mais de 90% do crescimento celular a partir de 10 μg/mL (Fig. 2).

Figura 2
Citotoxicidade (μg/mL) (média +/- erro-padrão da média) do óleo essencial de Tagetes minuta em células epiteliais da glândula mamária MAC-T. Letras diferentes representam diferenças estatísticas entre as concentrações (P<0,01).

O valor constatado de IC50 do óleo sobre esse tipo celular foi de apenas 26,24 μg/mL. Em outros tipos celulares (células KB e HepG2), as concentrações do óleo de Tagetes que reduziram significantemente a viabilidade celular foram 50-200 μg/mL (Shizari et al. 2014SHIZARI, M.T.; GHOLAMI, H.; KAVOOSI, G. et al. Chemical composition, antioxidant, antimicrobial and cytotoxic activities of Tagetes minuta and Ocimum basilicum essential oils. Food Sci. Nut., v.2, p.146-155, 2014.). Por outro lado, Karimian et al. (2014KARIMIAN, P.; KAVOOSI, G.; AMIRGHOFRAN Z. Anti-oxidative and anti-inflammatory effects of Tagetes minuta essential oil in activated macrophages. Asian Pac. J. Trop. Biomed., v.4, p.219-227, 2014.) registraram atividade anti-inflamatória do óleo essencial de T. minuta, originário do Irã, utilizando macrófagos como modelo na concentração de 50 μg/mL. Os principais componentes do óleo de T. minuta estudado pelos autores eram di-hidrotagetona (33.86%), E-ocimenona (19.92%), tagetona (16.15%), cis-β-ocimenona (7.94%) e Z-ocimenona (5.27%). No presente estudo, o óleo reduziu significantemente a oxidação de NADH, a síntese de óxido nítrico e a expressão do mRNA do TNF-α. Esse resultado indica que o produto possui um potencial de modulação ou diminuição de respostas imunológicas, sugerindo a possibilidade de uso interno. No entanto, esses efeitos devem estar relacionados a uma composição química distinta da amostra em estudo, devendo-se, portanto, aprofundar o estudo com os compostos do óleo para elucidar quais são os principais terpenos responsáveis pelas atividades observadas.

Sugerem-se estudos futuros envolvendo a encapsulação do óleo visando à elaboração de um possível produto para a utilização externa (i.e., teto do animal) em concentrações intermediárias (entre 0,3 mg/mL e 3 mg/mL) que poderiam impedir a entrada de bactérias no sistema mamário da vaca, ou para desinfecção de insumos utilizados na ordenha, ou ainda para tratar infecções causadas por micro-organismos provocadas por MRSA.

CONCLUSÕES

O óleo essencial de T. minuta possui atividade antimicrobiana para as duas principais espécies causadoras de mastite, E. coli e S. aureus, incluindo uma cepa multirresistente. No entanto, mesmo em concentrações muito baixas, elevado efeito citotóxico foi encontrado sobre as células MAC-T, sugerindo um potencial dano ao tecido se o seu emprego for intramamário.

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    10 Out 2019
  • Data do Fascículo
    Jul-Aug 2019

Histórico

  • Recebido
    04 Abr 2018
  • Aceito
    04 Dez 2018
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