INFLUÊNCIA DA DOSIFICAÇÃO PROLONGADA DE ORGANOFOSFORADO NA RESPOSTA IMUNE DE HAMSTERS VACINADOS COM BACTERINA ANTI-LEPTOSPIROSERESUMO
A influência daadministração do organofosforado triclorfon em concentração não letal (30 mg /kg peso vivo ao dia de segunda a sexta feira durante oito semanas consecutivas) foi investigada em hamsters vacinados com bacterina comercial anti-leptospirose, indicada para bovinos e suínos e preparada com as variantes sorológicas (canicola, grippotyphosa, pommw. icterohaemorrhagiae, hardjo e wolf.fi). Na quarta semana de tratamento com o fosforado os bamsters rereberarn a primeira dose de vacina e na quinta semana a segunda. Na primeira aplicação a vacina foi diluída na concentração de 1:2.400 da dose recomendada pelo fabricante e a segunda na concentração de 1:800. Aos 14 dias da primeira vacinação os animais foram desafiados com uma estirpe vírulenta de L interrogans sorotipo pomona, em cinco diluições seriadas de razão dez, oito animais por diluição; o inóculo puro apresentou de 20 a 30 leptospiras ativas pôr campo microscópico (aumento de 200 vezes). Após o desafio foram analisados os níveis de anticorpos aglutinantes, a proporção de mortes por leptospirose e a propor-ção de sobreviventes que apresentaram leptospiras nos rins. A partir da terceira semana da administração do fosforado houveredução significativa no ganho de peso dos animais; no entanto a proporção de casos de.leptospirose foi idêntica nos tratados e oontroles. O triclorfon não influenciou a produção de anticorpos aglutinantes (p = 0,48) nem a proporção de portadores renais (p = 0,09). A administração do fosforado, na dosagem e período estudados, não provocou efeito imunossupressor no sistema biológico empregado.
PALAVRAS-CHAVE:
Fosforado, leptospirose; vacina; imunossupressão.
ABSTRACT
The influence of the administration of trichlorfon on the immune response of hamsters vaccinated witbananti-leptospiral multivalent bacterin produced for use in cattle and swine, containing the serovar pomona,, and challenged with a virulent strain of this serovar, was investigated taking into account the proportion of deaths afterchallenge, the levels of anti-leptospiral agglutinating antibodies and the proportion of kidney carriers. The treatment consisted of a daily dose of 30 mg/kg live weight of the pesticide by subcutaneous route, fiom Monday to Friday, for a period of eight weeks. At the fourth week of the treatment, the animais received the first dose of the anti-leptospiral bacterin; and seven days later, the second dose. The first one was diluted at the proportion of 1:2,400 of the vaccine recomendation and the second at the dilution of 1:800. Fourteen days after the first dose of the vaccine, five lots of eight hamsters each were challenged with avirulent strain ofleptospira. At the sarne occasion, eight animals were submitted to microscopic serum agglutination test. The sarne procedure occurred fourteen days after the second dose of the bacterin, to another group of eight animais. Control animais were submitted to the sarne procedures and maneuvers applied to the treated ones. Twenty-one days after the challenge, all surviving animais were killed and examined. The proportion of animais showing leptospirosis was identical to both treated and control subgroups. The geometric means of agglutinating antibodies and the proportion of kidney carriers between the treated and untreated controls have no statistical significance, with p values of 0.48 and 0.09, respectively. The immunodepression effect of trichlorfon was not observed for the dose and time administration period studied.
KEY WORDS:
Leptospirosis; hamsters; agglutination; antibodies; immunosupression; trichlorfon; organophosphorus compound.
INTRODUÇÃO
O emprego de pesticidas trouxe grandes benefícios para a humanidade (ERCEGOVICH, 1973). No entanto, a constatação de que estes produtos também podem provocar efeitos indesejáveis e, inclusive, permanecer por longos períodos de tempo no ambiente (PAOLA, 1985), tem sido um alerta para as autoridades em saúde. Dentre as conseqüências indesejáveis do uso dos pesticidas são referidas: neurotoxidade (DUBOIS et al., 1949), reações alérgicas (DÉSI, et al., 1978), carcinogênese (PAOLA, 1985), doenças autoimunes, maior susceptibilidade a infecções, mutagênese, teratogênese (POPE et al.,1986) e alterações no sistema imune celular e humoral (DÉSI et al., 1978; ERCEGOVICH, 1973; KOLLER, 1979; MURPHY, 1991; STREET, 1981; STREET & SHARMA, 1975).
Os organofosforados, largamente utilizados em atividades agropecuárias (KHAN, 1973), apresentam um tempo de degradação relativamente curto, no entanto, possuem uma considerável toxicidade aguda (DAVIES, 1973). A despeito da dose letal 50% destes produtos ser um parâmetro bem estudado (MURPHY, 1991), ainda não foram suficientemente analisadas as conseqüências da sua administração continuada em doses não letais.
SHTENBERG & DZHUNUSOVA (1968) observaram, em ratos, que o metilparation provocou a redução da reação imunológica com supressão dos níveis de aglutininas induzidas por vacinas polivalentes.
STREET & SHARMA (1975) constataram que os fosforados podem determinar uma depressão imunológica temporária; no entanto ressaltaram que este efeito poderia variar, para um mesmo composto tóxico, na dependência do teste a que o animal fosse submetido.
FAN et al.(1978) verificaram, em camundongos, que a administração de metilparation por um período de quatro semanas provocou a redução da proteção vacinai contra a Salmonella typhimurium.
CASTANO (1991) em hamster tratados com o triclorfon, em doses capazes de reduzir os níveis de colinesterases mas incapazes de produzir sintomas de intoxicação aguda, verificou que, a despeito de não ocorrerem alterações nos resultados do teste intradérmico de tuberculina, as lesões granulomatosas induzidas pelo BCG foram de menor intensidade nos animais que receberam a maior concentração do fosforado.
CRUZ (1995) constatou elevação nas proporções de mortes observadas em camundongos tratados com doses não letais do triclorfon e infectados com o vírus rábico, pela via periférica. Houve, inclusive, modificações no período de incubação e na evolução da doença.
FERREIRA NETO et al. (1996), em hamsters tratados com doses não letais do triclorfon e infectados pelo Mycobacterium bovis, constataram a existência de alterações na fase aguda da instalação do granuloma, a qual foi maior no grupo controle; no entanto, na fase crônica da instalação do granuloma, bem como na evolução da doença, não houve influência da administração do fosforado.
A análise do comportamento da infecção induzida por um microrganismo de localização extracelular poderia elucidar aspectos ainda não esclarecidos nas investigacões de CASTANO, 1991, CRUZ, 1995 e FERREIRA NETO et al. (1996); deste modo o presente estudo foi delineado para investigar o efeito da administração de doses não letais do triclorfon, na resposta imune de hamsters vacinados com bacterina anti-leptospirose..
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados 137 hamsters (Mesocricetus auratus), machos, com 80 a 125 gramas de peso vivo, divididos em três grupos: Grupo A (56 animais tratados com triclorf on1 na dosagem de 30 mg/kg de peso vivo ao dia, pela via subcutânea, de segunda a sexta-feira, durante oito semanas consecutivas); Grupo B (56 animais tratados com água despirogenizada estéril, no mesmo volume do fosforado) e Grupo C (25 animais empregados para o controle do inóculo de desafio). O esquema empregado para administração do triclorfon foi utilizado de forma idêntica ao adotado em investigação anterior (FERREIRA NETO, et al., 1996). onde foi caracterizada a redução significativa da atividade das colinestarases plasmáticas e cerebrais.
A vacina utilizada foi uma bacterina, comercial, indicada para bovinos e suínos2 , preparada com as variantes sorológicas canicola, grippothyphosa, icterohaemorrhagiae, pomona, hardjo e wolffii. Os animais receberam duas doses da bacterina com intervalo de sete dias. Na primeira vacinação, efetuada quatro semanas após o início da administração do pesticida, a vacina foi diluída na proporção de 1:2.400 da dose recomendada pelo fabricante e na segunda foi adotada a diluição de 1:800.
Ao final da sexta semana do início da administração do fosforado os animais dos grupos A e B foram divididos em sete lotes de oito animais cada. Cinco lotes foram desafiados com L. interrogans sorotipo pomona (subgrupos A1 e B1 ) e dois lotes, não infectados, destinaram-se à análise dos níveis de aglutininas pós-vacinais anti-leptospirose (subgrupos A2 e B). O inóculo infecccioso foi administrado em cinco diluições seriadas de razão dez, num volume de 0,2 ml, pela via intraperitoneal, oito animais por diluição 0 0-1 a 10-5 ). No inóculo puro as contagens de leptospiras ativas revelaram de 20 a 30 microrganismos por campo, no aumento de 200 vezes.
Os animais foram observados duas vezes ao dia. Os que apresentaram sinais clínicos de leptospirose foram sacrificados em estado agônico, em câmara com vapores de clorofórmio e posteriormente necropsiados para a confirmação da leptospirose. Decorridos 21 dias do desafio todos os sobreviventes foram sacrificados para a investigação da condição de portador renal de leptospiras.
A pesquisa de aglutininas anti-leptospira foi efetuada segundo a técnica de soroaglutinação microscópica com antígenos vivos (SANTA ROSA, 1970). O antígeno empregado no teste foi a própria estirpe utilizada para o desafio e cultivada em meio líquido de EMJH3 modificado (ALVES et al.,1996). O critério adotado para um soro ser considerado como reagente foi o de 50% de leptospiras aglutinadas por campo microscópico. A diluição inicial dos soros foi a de 1:100.
Os cultivas de tecido renal foram efetuados em meio de Fletcher3 segundo a técnica das diluições seriadas e incubados à temperatura de 28 a 30º C, durante 60 dias (SANTA ROSA, 1970).
RESULTADOS
A partir da terceira semana do experimento, os animais do grupo A passaram a apresentar um ganho de peso médio significativamente inferior ao constatado no grupo B; diferença que se acentuou na quarta semana e persistiu por todo o restante do experimento (P<0,01).
Todos os animais utilizados para o controle do inóculo de desafio apresentaram quadro clínico (período de incubação de quatro a cinco dias, apatia, pelos eriçados, icterícia conjuntival, hemorragias nas narinas) e anátomo-patológico (icterícia pleura e peritônio, hiperplasia e congestão do fígado e baço) compatível com leptospirose. A sobrevivência, em dias, foi diretamente proporcional à diluição do inóculo (Fig. 1).
Sobrevivência em dias dos hamsters inoculados com leptospiras, segundo a diluição do inóculo.
O efeito protetor da bacterina foi idêntico para os subgrupos A1 e B1 ; houve 36 sobreviventes por subgrupo e conseqüentemente 90% de proteção conferida pela vacina.
Não foram constatadas diferenças estatisticamente significantes quando comparadas às médias geométricas dos títulos aglutinantes ou às proporções de portadores renais entre os subgrupos A1 e B1 (Tabela l e Fig. 2).
Todos os soros dos animais não desafiados e apenas vacinados (Subgrupos A2 e B2 )fo ra m não reagentes ao teste de soroaglutinação microscópica aplicado a leptospirose tanto para as colheitas efetuadas aos sete quanto aos 14 dias das duas aplicações de vacina.
Médias geométricas dos títulos de aglutininas anti L interrogans sorotipo pomona e proporção de portadores renais de leptospiras nos subgrupos Al e Bl.
Médias geométricas dos títulos de aglutininas anti Leptospira interrogans sorotipo pomona e proporção de portadores renais de leptospiras nos subgrupos Al e B1.
DISCUSSÃO
Os resultados da proteção conferida pela vacina demonstraram a inexistência de efeito imunossupressor decorrente da administração do fosforado. De fato as proporções de animais protegidos foram idênticas nos grupos tratado e controle. A eficiência das bacterinas anti-leptospirose em termos de prevenção das manifestações clfuicas da doença já foi confirmada em diversas oportunidades (HAGAN & BRUNER,1988; HANSON, 1977; SULLIVAN. 1974), no entanto cumpre ser ressaltado que, no presente estudo, a diluição empregada para a primeira aplicação de vacina foi superior ao valor preconizado pelo teste de potência oficial (UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE AND ANIMAL AND PLANT HEALTH INSPECTION SERVICE, 1977).
No grupo de animais tratados com o fosforado, dois dos quatro hamsters que adoeceram pertenciam ao lote desafiado com a maior concentração do inóculo (I 0-1 ) e os outros dois com as diluições 104 e 10_5- Já no grupo controle, todos os quatro hamsters que adoeceram pertenciam à diluição 10-1• Tais achados sugerem que, no grupo tratado houve hamsters susceptíveis a concentrações bacterianas incapazes de provocar a doença no grupo controle, o que poderia ser atribuído a uma possível imunossupressão, entretanto não pode ser excluída a hipótese da existência de variações das características individuais de resistência.
O percentual de animais reagentes à SAM foi maior no subgrupo tratado (33/40; 82,50%) do que no controle (30/39; 76,92%), no entanto esta diferença absoluta foi destituída de significado estatístico (p=0,54). De maneira análoga, no relativo às médias geométricas dos títulos aglutinantes, em ora estatísticamente iguais, os valores absolutos apontam uma média superior para o subgrupo tratado (1,96 contra 1,83 do controle). Esta constatação sugere que ao invés de depressão, o fosforado pudesse ter estimulado a produção de anticmpos humorais, o que já foi referido por STREET (1981). Tal dúvida poderia ser esclarecida com o emprego de um número maior de animais.
A constatação de que todos os animais vacinados e não desafiados (subgrupos e B2 ) foram caracterizados como não reagentes à SAM. indica que os níveis de aglutininas pós vacinais foram muito baixos e não puderam ser revelados com a metodologia adotada. Esta constatação já foi observada em outras investigações (CARGILL & DAVOS, 1981; DOBSON & DAVOS, 1975; HANSON, 1972; SULLIVAN, 1974; TRIPATHY et.al., 1975; WHITE et al, 1982).
Apesar de ter sido encontrada menor proporção de portadores renais nos animais do subgrupo A1 (25/ 35= 0,71) frente ao B1 (29/33= 0,88), esta diferença não apresentou significado estatístico (p=0,09). A elevada proporção de portadores renais em ambos os subgrupos demonstra que, apesar da bacterina ter sido capaz de proteger 91 % dos animais contra as manifestações clínicas da leptospirose, ela não impediu a infecção e a colonização dos túbulos renais. Tais achados concordam com constatações alilteriores (HUSSEIN et al., 1973; KILLINGER et al., 1971; LAURIE-RHODES, 1962; MADRUGA etaL, 1983; SULLNAN, 1974).
CONCLUSÕES
Houve interferência do tratamento com o fosforado no ganho de peso dos animais, mas não na proteção vacinal conferida pela bacterina anti leptospirose, no que diz respeito à freqüência de casos clínicos.
O triclorfon não influenciou a produção de anticorpos aglutinantes anti lept:ospira nos animais vacinados e desafiados e não houve produção de aglutininas em níveis detectáveis pelo teste naqueles vacinados e não desafiados.
A proporção de portadores renais nos animais vacinados e desafiados não foi influenciada pelo esquema de dosificação de fosforado adorado.
O fosforado, nas condições ensaiadas, não provocou efeito imunossupressor detectável pelos critérios de avaliação utilizados.
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Parte da Tese de doutoramento: THOME, S.M.G. Influência da dosificação prolongada de organofosforado na resposta imune de hamstas vacinados com mti-leptospirose. São Paulo, 1996. Tese (Doutc ado) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Pamillo, realizada com apoio financeiro do CNPq.
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1= BAYER; 2=S0LVAY; 3=DIFCO
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