O uso do aspirado de medula óssea de ilíaco em falhas ósseas de fêmures de camundongos: estudo experimental

Resumos

The aim of this study is to analyze the bone marrow employment in rats to stimulate the bone callus formation. Ten adult rats were used, male, isogenic, gioto lineage, approximate weight of 250 grams. Bone failures were produced at femur distal portion, alternating the right and left sides, and they were divided in group A and B. The control was held in rats presenting an isolated bone failure or having their bone marrow previously collected After quantitative and qualitative analysis, it was observed that the bone marrow utilization does not lead to the bone callus formation and there isn't an increase in the local inflammation process.

Rats; endogamous strains; Bone marrow; bone callus

ARTIGO ORIGINAL

O uso do aspirado de medula óssea de ilíaco em falhas ósseas de fêmures de camundongos - Estudo experimental

Alberto Tesconi Croci^I; Olavo Pires de Camargo^I; George Bitar^II; Silvio Luiz Borges Pereira^III; Talmo de Melo Freire^IV; Sérgio Cristiano Inácio Cardoso^IV

^IProfessor Livre-Docente do Departamento de Ortopedia e Traumatologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo e do Instituto de Ortopedia e Traumatologia do Hospital das Clínicas da FMUSP

^IIChefe do Serviço de Residência Médica de Ortopedia e Traumatologia na Santa Casa de São Vicente e Faculdade Ciências Médicas de Santos – UNILUS

^IIIPreceptor do Serviço de Residência Médica de Ortopedia e Traumatologia na Santa Casa de São Vicente e Faculdade Ciências Médicas de Santos – UNILUS

^IVEx-residente de Ortopedia e Traumatologia da Santa Casa de São Vicente e Faculdade de Ciências Médicas de Santos – UNILUS

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Os autores estudam a utilização de medula óssea em camundongos como estimulação da formação de calo ósseo. Foram utilizados dez camundongos adultos machos de linhagem isogênica gioto com peso de aproximadamente 250 gramas, e realizadas falhas ósseas na região distal do fêmur com alternância do lado direito e esquerdo, divididos em grupos A e B, sendo como controle camundongos com falha óssea isolado e com falhas ósseas com medula óssea colhida previamente de cada camundongo. Após análise qualitativa e quantitativa foi observado que o uso do aspirado de medula óssea não leva à estimulação da formação do calo ósseo e não há o aumento de processo inflamatório local.

Descritores: Camundongos de cepas endogâmicas; Medula óssea; Calo ósseo.

INTRODUÇÃO

O osso é um tecido conjuntivo especializado com uma estrutura colágena mineralizada para o apoio esquelético do corpo. Sua estrutura pode ser esponjosa (trabecular) ou compacta (cortical). O osso esponjoso consiste de osso entrelaçado e de ligação (trabéculas) de diversas formas e espessuras entre as quais há espaços ocupados pela medula óssea. O osso compacto é uma massa óssea contínua contendo canais vasculares interligados de dimensões microscópicas.

O osso aparece pela primeira vez depois da sétima semana embrionária. Esse osso pode ser de dois tipos: o membranoso é o que forma diretamente os folhetos membranosos e o cartilaginoso que é aquele o qual a estrutura é formada em primeiro lugar cartilaginosa e em seguida substituída por osso. Embora a histogenia do osso seja idêntica em cada caso, no último tipo a cartilagem deve ser primeiramente removida antes que possa ser depositado o osso^(6,8).

A membrana de tecido mesenquimatoso ou conjuntivo forma primeiramente o modelo original dos ossos faciais e cranianos. Em um ou mais pontos centrais da membrana começa a ossificação intramembranosa. Esses centros de ossificação se caracterizam pelo aparecimento de osteoblastos que depositam uma rede de trabéculas ósseas espalhadas radialmente em várias direções⁽²⁾.

O mesênquima na periferia se diferencia em uma bainha fibrosa (o periósteo), cuja superfície inferior se diferencia em osteoblastos que por sua vez, depositam placas paralelas de osso compacto (as lamínulas). As trabéculas são distribuídas principalmente ao longo de linhas de maior tensão.

Um modelo cartilaginoso da estrutura precede a destruição da cartilagem e sua substituição por osso. Estão envolvidos dois processos: a ossificação central da cartilagem ou ossificação endocondral, e a ossificação periférica abaixo do pericôndrio ou periósteo ou ossificação pericondral (perióstica).

No centro percursor cartilaginoso, as células se hipertrofiam e estão distribuídas radialmente. São depositados sais de cálcio na matriz. Esta cartilagem calcificada se desintegra e é destruída pelo tecido vascular neoformado proveniente do pericôndrio. Ao mesmo tempo a massa germiforme neoformada dá origem também a osteoblastos que depositam novo osso em muitos pontos e até na cartilagem calcificada. Essa formação óssea esponjosa continua a substituir a cartilagem, estendendo-se no sentido proximal e distal⁽²⁾.

Ao mesmo tempo em que está ocorrendo a formação do osso central esponjoso, a camada interna de pericôndrio (agora denominada mais adequadamente de periósteo) é depositada em camadas paralelas de osso compacto. O processo de ossificação endocondral continua durante o período de crescimento pela existência de uma camada de cartilagem próximo às epífises, e é responsável pelo crescimento em comprimento da estrutura, a ossificação perióstica contribui para o crescimento em espessura da estrutura.

A consolidação das fraturas ocorre por um processo fisiológico similar à cicatrização das feridas dos tecidos moles, apenas acontecendo em um tempo maior, pois se trata de um tecido com grande quantidade de estrutura óssea mineral. Mas há uma vantagem fundamental: após a maturação do calo ósseo, ficam estabelecidas todas suas propriedades e estruturas histológicas anteriores, o que não ocorre com nenhum outro tecido.

A consolidação óssea depende de vários fatores, tais como a vascularização, a estabilidade, o contato dos extremos dos fragmentos e o tempo para que o osso neoformado restaure uma união forte entre os fragmentos ósseos.

Às vezes o processo de consolidação se desvia do seu curso normal produzindo três tipos de complicações tardias: 1. o retardo de consolidação, 2. a pseudo-artrose e 3. a consolidação viciosa⁽²⁾.

O modelo habitual utilizado para explicar a consolidação é baseado em uma fratura fechada de diáfise de osso longo, pois os princípios de reparo podem ser aplicados em qualquer fratura. O processo se supõe dividido em três fases baseadas nas mudanças morfológicas, ou seja a fase inicial inflamatória, a fase reparativa e a fase de remodelação.

A duração do processo de cicatrização, bem como o de cada fase varia de acordo com inúmeros fatores, inclusive com a espécie do animal estudada.

Na fase inflamatória o hematoma é formado a partir da ruptura dos vasos sangüíneos lesados da medula e da cortical óssea. Alguns dos vasos trombosam, determinando necrose de algum tecido ósseo ao nível da fratura. As células inflamatórias então invadem o hematoma.

Na fase reparativa há células pluripotenciais mesenquimatosas e novos capilares invadem o hematoma organizado, diferenciando-se em fibroblastos, condroblastos ou osteoblastos, formando o calo fraturário.

Na fase de remodelação o novo osso é formado pelos osteoblastos predominantes em relação aos outros elementos do calo e cada vez mais assume as suas características iniciais.

Na formação do calo ósseo ocorre lesão de vários vasos, que determina a formação de um hematoma que preenche o espaço entre os fragmentos ósseos, e os tecidos moles ao redor. Como no reparo de todas as feridas, a cicatrização começa com a coagulação do sangue extravasado. A organização do hematoma começa nas primeiras 24 horas, constituindo-se na invasão do coágulo por tecido de granulação (capilares e fibroblastos jovens). O periósteo, o endósteo e a medula óssea próximos ao foco de fratura fornecem células que se proliferam e diferenciam em tecido fibroso, fibrocartiloginoso e cartilagem hialina, todos fazendo parte da formação de osso novo. As células indiferenciadas da medula óssea também contribuem para a neoformação óssea^(4,7).

Esta começa em indivíduos jovens nas superfícies interna e externa do osso lesado, nas primeiras 48 horas. No momento do traumatismo, é produzida certa elevação do periósteo no osso acima e abaixo da fratura. Esse descolamento de periósteo é um grande estímulo para a proliferação celular das camadas profundas. Microscopicamente se pode ver uma neoformação óssea nos dois primeiros dias depois do traumatismo. A neoformação óssea inicia a certa distância dos extremos dos fragmentos, e as células mais proximais produzem um tecido cartilaginoso ou fibrocartilaginoso. A quantidade de calo ósseo depende do tipo, localização, duração, idade do paciente e tratamento da fratura.

A consolidação óssea significa o restabelecimento da resistência da estrutura óssea que ocorre em poucas semanas, mas o estabelecimento microscópico da estrutura original pode demorar até a remodelação interna.

Dois pré-requisitos são essenciais para a consolidação óssea adequada: a capacidade biológica (vascularização) e a condição biomecânica que controlam a atividade das células.

Croci⁽²⁾ descreve, em artigo de revisão, os fatores mediadores envolvidos na consolidação óssea, dentre os quais: as prostaglandinas PGE 1 e 2, as somatomedinas, o fator de crescimento epidermal, os fatores angiogênicos, a fibronectina, as interleucinas 1 e 2, o fator de crescimento plaquetário, o fator ativador de osteoclastos, as bradicininas e o fator de necrose tumoral.

Com relação à comunicação intercelular, os estudos sugerem a presença de um fator, que seria importante na aceleração dos fenômenos da consolidação, como RAP (fenômeno aceleratório rápido), que poderia ser considerado uma nova fase na consolidação. O trauma iniciaria e aceleraria esse processo, que teria começo alguns dias após a fratura, com um pico de ação de um a dois meses, tendo duração de seis meses a dois anos. Esse fenômeno, segundo o autor, só não ocorreria em cerca de 3% das fraturas⁽⁵⁾.

CASUÍSTICA E MÉTODO

São usados neste experimento 10 camundongos da linhagem isogênica gioto, provenientes do Biotério da Faculdade de Ciências Médicas Lusíadas de Santos.

Estes animais são colocados em gaiolas separadas e numerados de 01 a 10, e são submetidos aos procedimentos cirúrgicos nos fêmures, alternando-se o lado direito e esquerdo, tendo-se 10 fêmures (cinco direitos e cinco esquerdos como grupo controle e cinco direitos e cinco esquerdos como grupo onde é utilizada a medula óssea).

OBJETIVO

O objetivo desse trabalho é o de avaliar a consolidação óssea em um estudo experimental em camundongos, com o aspirado de medula óssea utilizada na estimulação da formação do calo ósseo, em falhas ósseas produzidas nos fêmures doa animais.

MATERIAL

São utilizados 10 camundongos adultos machos de linhagem isogênica gioto, provenientes do Biotério da Faculdade de Ciências Médicas Lusíadas de Santos do estado de São Paulo, com peso aproximado de 250 gramas. Após o exame objetivo, os animais fisicamente aptos, são submetidos aos procedimentos. São divididos em dois Grupos alternando-se os fêmures direitos e esquerdos para os experimentos (Grupo A e B).

No Grupo A são realizadas falhas ósseas, com perfurações segmentares de dois milímetros do fêmur, alternadamente do lado direito e esquerdo, de tal maneira que temos cinco fêmures operados do lado direito e cinco do lado esquerdo. Estas falhas não são substituídas por qualquer elemento (Grupo controle).

No Grupo B são realizadas falhas ósseas, semelhantes ao do Grupo A, seguido de colocação, nesta falha de aspirado medular, colhido previamente do mesmo rato, em sua crista ilíaca, por punção com agulha e seringa. Desta forma temos cinco fêmures direitos operados e cinco do lado esquerdo, todos com colocação na falha óssea de aspirado medular.

Em resumo, temos 10 camundongos, sendo 20 fêmures operados, 10 do lado direito e 10 do lado esquerdo, onde o Grupo A é o Grupo controle, onde foram induzidas as falhas ósseas, sem qualquer substituição e o Grupo B onde é utilizado o aspirado medular retirado da crista ilíaca do mesmo rato.

MÉTODO

Protocolo anestésico: Os animais são anestesiados pela via intraperitonial, com Virboxil® 2% (Cloridrato de xilazina) na dose de 0,01 ml/kg, associado a Francotar® (Quetamina) na dose de 0,50mg/100 gramas.

Técnica cirúrgica: Após tricotomia bilateral das coxas, é feita a anti-sepsia com polivinil pirolidona tópica a 1% e posicionados os campos estéreis.

A Incisão na pele é de aproximadamente um centímetro na região distal do fêmur, com controle da hemostasia, diérese dos tecidos moles com pinça de Kelly curva e tesoura de Metzembaum delicada, e revisão da hemostasia.

Faz-se a elevação subperiostal dos fêmures com descolador de Freer e seguido de perfurações dos fêmures direito e esquerdo a um centímetro acima da interlinha articular do joelho, no sentido de lateral para medial, utilizando perfuradora sob pressão manual, com broca de titânio de dois milímetros de diâmetro sob irrigação com solução salina a 0,9% (Figura 1A). É recolhido o aspirado de medula óssea, cerca de 0,3 ml, com seringa estéril de 10 ml com agulha de 40X16 milímetros na crista ilíaca, e injetada imediatamente nas falhas ósseas(Figura 1B). A sutura dos tecidos moles para fechamento da ferida cirúrgica é feita com fio mononylon 4-0 em pontos isolados.

Os camundongos são colocados em caixas individuais, numeradas de 01 a 10, recebendo nas primeiras 12 horas de pós-operatório, analgesia com 0,1 ml de dipirona sódica sob via intraperitonial. Os animais são alimentados com ração padrão normoprotéica e fornecida água "ad libitum", em temperatura ambiente de 19 a 20 graus centígrados, nas gaiolas individuais.

Após duas semanas de confinamento, os animais são eutanasiados, com a retirada das peças (fêmures) para preparação das mesmas para exame anatomopatológico, onde são analisados tanto qualitativamente como quantitativamente.

Protocolo de eutanásia: São realizadas as eutanásias nos grupos A e B, com os camundongos devidamente anestesiados por via intraperitonial com cloridrato de xilazina na dose 0,01ml/kg, associado a quetamina na dose de 0,50mg/100 gramas. Após a anestesia é utilizada máscara inalatória com éter em dose letal, até a parada cárdio respiratória.

Protocolo anatomopatológico: As peças retiradas são identificadas segundo o número do camundongo e o lado retirado, conforme protocolo do experimento. As mesmas são fixadas em formol a 10% pelo período de doze horas e descalcificadas em ácido nítrico, por vinte e quatro horas, e seccionado longitudinalmente no seu maior eixo.

São identificadas segundo o protocolo de processamento tecidual, e em seguida submetidas a um banho seqüencial de álcool, xilol e parafina, e colocadas em bloco de parafina; são submetidas aos cortes histológicos de quatro micras de espessura e em seguida coradas com hematoxilina e eosina.

São feitas duas a três lâminas por bloco e analisadas em microscópio tipo Nykon – alpha phot numero 2, com 400 vezes de aumento (Figura 2A e ^B), tendo-se como parâmetro os seguintes achados que serão levados em consideração para o presente estudo: 1. Hemorragia, 2. Polimorfonucleares, 3. Tecido de granulação, 4. Atividade osteoblástica, 5. Matriz óssea e 6. Osteoclastos.

CRITÉRIOS DE AVALIAÇÃO

A avaliação anatomopatológica segue os parâmetros habituais adotados pelo nosso Serviço de anatomia patológica para análise do processo inflamatório e formação do calo ósseo e foram pontuados, conforme a presença ou não dos achados estudados, conforme o Tabela 1.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

Observamos a freqüência (absoluta e relativa) da incidência dos achados anatomopatológicos nas lâminas dos Grupos A e B.

Realizamos a estatística descritiva dos parâmetros quantitativos nos Grupos A e B dos achados de hemorragia, polimorfonucleares, tecido de granulação, atividade osteoblástica, matriz óssea e osteoclastos.

Nas comparações dos resultados paramétricos utilizamos o teste exato de Fisher, comparando-se os eventos para cada achado do Grupo A X Grupo B.

Em todos os resultados adotamos a probabilidade de significância de 5% (p=0,05), sendo os resultados significativos indicados com asterisco.

RESULTADOS

A análise dos resultados, segundo os critérios adotados para o presente estudo encontra-se na Tabela 2, para o grupo A (controle) e quadro 3 para o grupo B (medula óssea).

ESTUDO COMPARATIVO

Os resultados dos achados de hemorragia, polimorfonucleares, tecido de granulação, atividade osteoblástica, matriz óssea e osteoclastos nas lâminas do Grupo A (controle) e Grupo B (medula óssea) podem ser vistos na Tabela 3.

DISCUSSÃO

A necessidade de diminuição do tempo de consolidação e uma boa formação do calo ósseo, justificam as tentativas em estudos experimentais onde todos querem entender melhor este processo de consolidação, e que estes resultados levem a descoberta de soluções biológicas, se possível as mais simples possíveis.

A observação de células primitivas indiferenciadas podendo se transformar em osteoblastos sob influência de substâncias osteoindutoras⁽⁸⁾ muito contribuiu para o entendimento do processo de formação do calo ósseo.

Carvalho et al.⁽¹⁾ verificaram que a denervação ciática não resulta em alterações da formação do calo ósseo, sendo que a fisiologia nervosa não interfere na consolidação óssea.

O fator aceleratório descrito por vários autores⁽²⁾ é um fator importante e até certo ponto considerando uma nova fase na consolidação, sendo desencadeada a sua função ou presença pelo trauma.

O uso da medula óssea para acelerar a consolidação óssea, por ser um método simples podendo ser obtido do próprio paciente, em lugar do enxerto autógeno que obrigaria a uma intervenção cirúrgica para a sua retirada, nos faz seguir esta linha de pesquisa, no sentido de obter resposta quanto a sua utilização e grau de resposta obtida.

Para tal, utilizamos camundongos isogênicos, que por serem geneticamente iguais, não existindo interferência quanto à imunidade do receptor, e portanto sem alteração na formação óssea. Além disto, a alternância do lado (direito e esquerdo) foi usado para evitar-se eventual influência de um membro predominante.

Adotamos para o experimento a utilização de perfurações ósseas, que foi padronizado com a mesma broca para todos os animais, além da uniformização por parte da equipe tanto que realiza a cirurgia, quanto à mesma bióloga cuidando igualmente na parte de alimentação e cuidados diversos.

Usamos para técnica anestésica a via intraperitonial, que garante ser um procedimento adequado para o experimento, associando drogas como a quetamina e o cloridrato de xilazina e em relação à eutanásia, utilizamos o protocolo padrão do biotério, onde após a anestesia, foi usado por via inalatória o éter até a dose letal seguindo-se a parada cardiopulmonar.

Em virtude da área da fratura ser pequena o número de campos microscópicos adotado não ultrapassou cinco campos HPF por uma área de 0,5 cm de extensão da lâmina analisada.

Os critérios anatomopatológicos foram estabelecidos segundo as normas estabelecidas para o Serviço de Anatomia Patológico, analisando as alterações presentes no processo em reparação das fraturas ósseas que levaram em conta:

1 - Hemorragia: Definido como a presença de hemácias no interstício e presença de pingentes de hemossiderina, caracterizando uma alteração de natureza recente após o trauma. Foi avaliado, constituído de hemorragia em organização como ausente ou focal (0) ou presente (mais de 2 campos) não havendo alterações entre os grupos A e B.

2 - Polimorfonucleares: As células inflamatórias (neutrófilos), primariamente presentes em seguida ao trauma, responsáveis pela produção de mediadores quimiotáxicos foram avaliados como ausentes (0) e presentes (1 a 4 neutrófilos por 10 HPF), não se observando diferenças entre os grupos A e B; o achado pode ser em decorrência do fato dos tecidos terem sido estudados após duas semanas do trauma inicial.

3 - Tecido de granulação: Este corresponde à fase de resposta tecidual caracterizado pela proliferação fibroblástica e neovascular, resultando na ação de mediadores químicos tais como fator de crescimento fibroblástico e fatores angiogênicos, sendo avaliados como ausente (até 2 campos HPF) e presente e escasso (com mais de 3 campos HPF), não ocorrendo diferença entre os grupos A e B.

4 - Osteoblastos: Os mesmos constituem em células formadoras de tecido ósseo, sendo as principais no processo da osteogênese. Morfologicamente estas células se dispõem na periferia das trabéculas ósseas do osso maduro ou entremeado a matriz osteóide jovem, sendo avaliado com ausente ou focal quando a atividade osteoblástica for até 4 HPF ou presente quando acima de 4 HPF.

5 - Matriz óssea: Caracterizada pelo depósito de matriz extracelular osteóide, de aspecto hialino, visto pela coloração de hematoxilina e eosina. Esta matriz jovem sofrerá mineralização dando origem ao tecido ósseo maduro. Foi avaliado quantitativamente como ausente ou focal observando até 4 campos HPF ou presente acima de 5 campos HPF, não observado diferença estatística entre os grupos A e B.

6 - Osteoclastos: Constituem as células principais na modelação óssea responsáveis pela reabsorção da matriz óssea. Morfologicamente caracterizam-se por células grandes, multinucleadas e citoplasma amplo, localizando-se preferencialmente na periferia das trabéculas ósseas mineralizadas. Foram avaliados como ausente ou mínima quando observado até 5 HPF e presente quando acima de 5 HPF. Entre os dois grupos A e B, não houve diferença no processo de consolidação óssea avaliados histologicamente após duas semanas do trauma.

Para análise estatística adotamos a probabilidade de significância de 5% (p= 0,05) como padrão para todos resultados.

Os parâmetros histológicos da hemorragia, polimorfonucleares e tecido de granulação podem ter sido sub-avaliados em decorrência ao período tardio da análise.

Os resultados desse trabalho nos levam a necessidade de estudos posteriores, enfocando alterações em períodos mais precoces após o trauma e uma análise morfológica minuciosa incluindo estudos morfogenéticos para avaliação de eventuais diferenças no processo de consolidação e remodelação óssea utilizando materiais biológicos (medula óssea) em estímulo da formação do calo ósseo.

CONCLUSÕES

1. O uso do aspirado de medula óssea de ilíaco, colocado em falhas ósseas de fêmures de camundongos, não leva a estimulação da formação do calo ósseo.

2. Não há aumento do processo inflamatório no local das falhas ósseas, com o uso de aspirado de medula óssea de ilíaco.

Trabalho recebido em 10/06/03

Aprovado em 18/02/04

Trabalho realizado no Serviço de Residência Médica em Ortopedia e Traumatologia na Santa Casa de São Vicente e Faculdade Ciências Médicas de Santos – UNILUS

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  24 Jun 2004
• Data do Fascículo
  Mar 2004

Histórico

• Aceito
  18 Fev 2004
• Recebido
  10 Jun 2003