Obtenção de vanilina: oportunidade biotecnológica

Production of vanillin: a biotechnological opportunity

Natural aroma compounds are of major interest to the food and fragrance industry. Vanillin (3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde) was isolated from the vanilla beans in 1816 and its world consumption has reached today about 12000 tons per year. But only approximately 50 tons per year are extracted from vanilla pods (Vanilla planifolia). The remainder is provided by synthetic vanillin. This review is about alternative processes to produce natural vanillin de novo or by biotransformation using biotechnological methods involving enzymes, microorganisms and plant cells.

biotransformation; vanillin; review


biotransformation; vanillin; review

REVISÃO

Obtenção de vanilina: oportunidade biotecnológica

Production of vanillin: a biotechnological opportunity

Andreas Daugsch* * e-mail: daugsch@fea.unicamp.br ; Gláucia Pastore

Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, Rua Monteiro Lobato, 80, 13083-970 Campinas - SP

ABSTRACT

Natural aroma compounds are of major interest to the food and fragrance industry. Vanillin (3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde) was isolated from the vanilla beans in 1816 and its world consumption has reached today about 12000 tons per year. But only approximately 50 tons per year are extracted from vanilla pods (Vanilla planifolia). The remainder is provided by synthetic vanillin. This review is about alternative processes to produce natural vanillin de novo or by biotransformation using biotechnological methods involving enzymes, microorganisms and plant cells.

Keywords: biotransformation; vanillin; review.

INTRODUÇÃO

A vanilina (4-hidroxi-3-metoxibenzaldeído) é um dos compostos aromáticos mais apreciados no mundo e um importante flavorizante para alimentos, bebidas e é usada também em produtos farmacêuticos1. Ela possui vários efeitos como prevenção de doenças, antimutagênico, antioxidante, conservante e antimicrobiano2-4.

O aroma de baunilha, ou seja, a vanilina, é obtida da planta Vanilla planifolia na forma de gluco-vanilina, na proporção de 2% em peso. A fonte natural da gluco-vanilina (a vagem da baunilha) pode fornecer apenas 20 t métricas das 12000 t métricas consumidas anualmente (cerca de 0,2%)5.

A produção de baunilha é um processo trabalhoso e de alto custo (a vanilina de extrato natural rende US$ 4000 por kg). Existe também a vanilina artificial, comumente derivada de liquores de sulfito, produzidos durante o processamento da polpa de madeira para a fabricação de papel6. Porém, o extrato sintético de vanilina fornece apenas a nota sensorial principal do "flavour" de baunilha. Além disso, esse tipo de produção rende somente US$ 12 por kg para a indústria. Esses números demonstram o interesse industrial em encontrar novas alternativas para a produção de vanilina natural, que poderiam fornecer um preço significativamente maior quando comparado à produção sintética de vanilina.

A distinção entre a vanilina natural e a sintética pode ser feita através de vários métodos analíticos como, por ex., análises de isótopos. Nesta análise é feito um perfil de isótopos usando um espectro de massa (13C EMPI) ou o método de ressonância magnética nuclear (2H-RMN) onde é possível destinguir a origem natural ou sintética da vanilina, já que a percentagem de 13C na vanilina de origem da orquídea Vanilla planifolia difere da sintética7-13.

Os métodos de análise usados para controle de qualidade incluem cinzas, acidez total, espectroscopia UV, cromatografia de camada delgada e em papel14-16, cromatografia gasosa e líquida de alta eficiência17,18.

De acordo com as normas européias e norte-americanas, classificam-se como produtos "naturais", os compostos obtidos de fontes biológicas, como as biotransformações em que se empregam as enzimas ou suas células vivas de fontes naturais. Para a indústria, tem-se tornado cada vez mais importante o uso de compostos aromatizantes que possam ser denominados "naturais", a fim de obter a aceitação do consumidor.

A vanilina produzida biotecnologicamente é considerada um produto natural e pode ser produzida com baixos custos, a partir do uso de fontes renováveis. Ela pode ser produzida biotecnologicamente através de extratos enzimáticos ou enzimas purificadas, microrganismos e cultura de células de planta5. Os principais precursores para a produção biotecnológica de vanilina são eugenol, isoeugenol, ácido ferúlico e outros menos utilizados19.

Recentemente, foi desenvolvida uma alternativa para obtenção de vanilina, tendo a glicose como precursor. A D-glicose é transformada, utilizando-se Escherichia coli recombinante, em ácido vanílico, o qual é, subseqüentemente, reduzido a vanilina, utilizando-se a atividade de aldeído desidrogenase20.

Devido à toxicidade celular da vanilina, esta não é facilmente formada em grandes quantidades em sistemas microbiológicos. Em geral, concentrações de vanilina acima de 1 g/L inibem o crescimento de microrganismos. Neste caso, torna-se difícil encontrar vanilina no sistema microbiano, mas pode-se encontrar álcool vanílico ou ácido vanílico21. A álcool vanílico oxidase do fungo Penicillium simplicissimum foi descrita como um catalisador da oxidação de álcool vanílico para vanilina22,23.

A biotransformação do ácido ferúlico, eugenol, isoeugenol e outros em vanilina pode ser feita enzimaticamente. Um rendimento de vanilina de até 17 g/L foi obtido pelo tratamento de isoeugenol com lipoxidase. Enquanto que o eugenol tratado com lipoxidase resultou em concentrações bem mais baixas que 0,5 g/L, o ácido ferúlico não pode ser transformado em vanilina usando-se lipoxidase. Economicamente, esses resultados ainda não são viáveis24.

PRODUÇÃO BIOTECNOLÓGICA DE VANILINA POR MICRORGANISMOS

A bioconversão de ácido ferúlico e outros precursores nos seus correspondentes aldeídos, álcoois e ácidos carboxílicos por microrganismos oferece a possibilidade de produção de vanilina natural25. A produção de compostos aromáticos por fermentação microbiológica tem muitas vantagens comparada à síntese química e enzimática (enzimas puras ou extratos enzimáticos). Em relação à síntese química, as vantagens de se usar microrganismos são: acesso à atividade e especificidade enzimáticas, condições brandas de reação, o que torna possível reduzir custos e a possibilidade de produzir os aromas diretamente no alimento. Em relação à síntese enzimática, as vantagens de se usar microrganismos são a reciclagem de cofatores necessários nas reações enzimáticas, a disponibilidade de enzimas e cofatores do próprio sistema biológico do microrganismo e uma atividade enzimática estável26.

As limitações da síntese biotecnológica utilizando-se microrganismos são o rendimento baixo do produto, pois o mesmo não é acumulado; a toxicidade do substrato e do produto aos microrganismos; e tempos longos de fermentação. Algumas fermentações são difíceis de proceder, devido à morfologia dos microrganismos (dificuldades de aeração, alta viscosidade, etc.)27. Os subprodutos apresentam 'off flavours' (e.g. vinila guaiacol), os quais devem ser removidos completamente, caso o produto seja utilizado em indústria de flavorizantes.

A formação de vanilina utilizando-se bactérias foi estudada. Isoeugenol ou eugenol foram usados na biotransformação, utilizando-se espécies de Corynebacterium28, Serratia e Enterobacter29. Vanilina, ácido ferúlico e ácido vanilínico foram identificados como intermediários no metabolismo de eugenol de Pseudomonas28,30. Foi investigado um plasmídeo catabólico de Pseudomonas sp. para o metabolismo de ácido ferúlico31.

As vias b-oxidativas e não b-oxidativas foram descritas na bioconversão do ácido ferúlico em vanilina por Pseudomonas fluorescens32. As vias não b-oxidativas da degradação de ácido ferúlico foram estudadas, recentemente, com o microrganismo termofílico Bacillus sp. retirado de madeira em decomposição e fontes de água quente33. Existe um terceiro caminho para a degradação de ácido ferúlico em vanilina. Este mecanismo não direto e não-b-oxidativo foi estudado no microrganismo Delftia acidovorans. Este caminho poderia levar a um novo processo biotecnológico para a produção de vanilina34.

A biotransformação em vanilina foi realizada em duas etapas, sendo que na primeira o recombinante Escherichia coli XL1-Blue (pSKvaom-PcalAmcalB) transformou eugenol em ácido ferúlico, com rendimento de 14,7 g/L, depois de uma fermentação de 30 h. O gene vaoA foi retirado do Penicillium simplicissimum CBS 170.90, produzindo a enzima álcool vanílico oxidase. Os genes calA e calB foram retirados de Pseudomonas sp. HR199, produzindo as enzimas álcool coniferílico desidrogenase e aldeído coniferílico desidrogenase. Na segunda etapa, o recombinante Escherichia coli (pSKechE/Hfcs) fez a conversão do ácido ferúlico em vanilina, com rendimento de 0,3 g/L35.

Streptomyces setonii acumulou vanilina até uma concentração de 6,4 g/L e um rendimento molar de 68%. Guaiacol e ácido vanílico também foram produzidos e participam no aroma de vanilina.

O efeito tóxico do formaldeído produzido durante a degradação de monômeros de lignina, como a vanilina e o ácido vanílico, foi estudado com o microrganismo Burkholderia cepacia TM1. Encontraram-se duas enzimas que podem ser usadas na detoxificação através da incorporação do formaldeído36.

A bactéria Nocardia sp. NRRL 5646 foi utilizada na conversão de ácido vanílico e ácido o-benzil vanílico em vanilina, usando células completas ou preparação de enzimas. A enzima ácido carboxílico redutase de Nocardia sp., que depende de ATP e NADPH, reduziu quantitativamente o ácido vanílico em vanilina37.

O microrganismo Sphingomonas paucimobilis SYK-6 foi analisado e encontraram-se dois genes essenciais, ferA e ferB, responsáveis pela degradação do ácido ferúlico a vanilina. O gene ferB tem uma similaridade na seqüência dos aminoácidos de 40 até 48% com as enzimas encontradas em Pseudomonas e Amycolatopsis. Já o gene ferA possui uma similaridade de 31% com uma enzima encontrada no Pseudomonas mendocina 3538.

Dois genes responsáveis pela degradação de vanilina em Pseudomonas sp. HR199 produzindo a enzima protocatecóico 3,4-dioxigenase foram caracterizados molecularmente39,40. Posteriormente, o catabolismo de ácido ferúlico em Pseudomonas sp. HR199 foi analisado bioquimica e geneticamente41. Pseudomonas fluorescens E118 pode ser usado para a produção de ácido ferúlico através de eugenol com um rendimento de 6,1 g/L42.

A bactéria Bacillus coagulans foi isolada de madeira em decomposição, a qual utiliza como fonte de carbono. Tendo em vista este fato, a bactéria pode apresentar uma facilidade para crescer na presença de ácido ferúlico. Neste caso a biotransformação foi testada como a linhagem de Bacillus coagulans BK07, a qual mostrou uma rápida descarboxilação de ácido ferúlico em 4-vinilguaiacol, o qual foi imediatamente convertido em vanilina e oxidado para ácido vanílico. O ácido vanílico foi, então, desmetilado e obteve-se ácido protocatecóico43.

O microrganismo Streptomyces setonii, através do metabolismo do ácido ferúlico, é capaz de produzir vanilina e ácido protocatecóico44.

Escherichea coli recombinante foi usada como biocatalisador na produção de vanilina, utilizando como substrato a glicose. Primeiramente, a glicose foi convertida em ácido vanílico, que foi então reduzido a vanilina pela enzima aril aldeído desidrogenase, isolada de Neurospora crassa20.

Alguns fungos podem ser usados na bioconversão de ácido ferúlico em ácido vanílico e vanilina. Como ex. podem-se citar os fungos filamentosos Aspergillus niger e o basidiomiceto Pycnoporus cinnabarinus45,46. Foi analisada a produção de vanilina através de Pycnoporus cinnabarinus usando [5-2H] ácido ferúlico47. A produção de vanilina através de ácido ferúlico em presença de celobiose produziu vanilina e álcool vanílico48-50. Pycnoporus cinnabarinus foi usado para a produção de vanilina de ácido vanílico com rendimento de 1260 mg/L51. A biotransformação de ácido ferúlico em ácido vanílico pode ser feita através do microrganismo Sporotrichum thermophile com um rendimento de 4798 mg/L52.

Em concentrações de vanilina acima de 1 g/L ocorre uma inibição do crescimento de microrganismos. Uma maneira possível de superar esse problema é utilizar um solvente aquoso-orgânico em um sistema de duas fases, acumulando vanilina na fase orgânica e reduzindo sua concentração na fase aquosa. Lee et al.53 reportaram um rendimento superior de biotransformação do ácido ferúlico em 4-vinilguaiacol utilizando o n-pentano, n-hexano ou n-octano como fase orgânica. Outra maneira de aumentar o rendimento é a extração contínua do produto pela extração da fase sólida54.

A b-ciclodextrina foi utilizada para separar e concentrar vanilina pela formação de complexos de inclusão e gerou resultados satisfatórios, como o aumento de rendimento de vanilina20. A habilidade das ciclodextrinas de formar complexos de inclusão estáveis com moléculas orgânicas provocou uma mudança nas propriedades físicas dos ligantes, incluindo sua solubilidade em meios aquosos, e diminuiu a inibição do substrato e do produto55-57.

A absorção de vanilina por polímeros especiais e sua posterior remoção a altas temperaturas permite a diminuição da concentração de vanilina na fase aquosa, reduzindo os problemas da inibição através da toxicidade celular da vanilina e permitindo a extração do produto58. Pela aplicação de um adsorvente seletivo usando Phanerochaete chrysosporium, a formação de álcool vanílico foi reduzida com sucesso e o rendimento de vanilina aumentou59. A vanilina foi oxidada para ácido vanílico pela aldeído óxido-redutase reversível e o ácido vanílico foi reduzido para álcool vanílico pela álcool desidrogenase60.

A bioconversão com temperaturas elevadas, próximas à de ebulição da água, foi reportada para Pyrococcus furiosus25.

Além dos precursores já mencionados acima, aldeído protocatecóico, ácido cafeico e estilbenos fenólicos foram utilizados como substrato para a biotransformação em vanilina61-66.

PRODUÇÃO BIOTECNOLÓGICA DE VANILINA POR CULTURA DE CÉLULAS DE PLANTA

A biotransformação de compostos sintéticos e naturais utilizando culturas de células de plantas é um método possível para a síntese de vanilina e que tem recebido bastante atenção67. As plantas são fontes de diversas substâncias químicas inclusive aromas, drogas, pigmentos e agroquímicos. Algumas das reações que ocorrem em células de plantas são complexas e não podem ser alcançadas facilmente por caminhos sintéticos. Para produzir essas reações complexas, as células de plantas, a cultura de órgãos e as enzimas de plantas são os biocatalisadores adequados. As reações mediadas por biocatalisadores (oxidações, reduções, hidroxilações, metilações, acetilações, isomerizações, glicosilações, esterificações, etc.) são produzidas em valores de pH e temperatura não extremos e são regio e estereosseletivas68.

Fitormônios e elicitores são necessários para produzir vanilina através de culturas de tecidos de plantas69. Por ex., um extrato aquoso de micélios de Aspergillus niger foi usado como um elicitor de fungos19. Além disso, diversas biotransformações, como a do ácido ferúlico e vanilil-amina em capsaicina e vanilina, foram efetuadas utilizando células de plantas e fitormônios70,71. O crescimento celular máximo acontece durante a fase em que as células estão indiferenciadas, ou seja, em que as células desenvolvem somente metabolismo primário. Muitos compostos aromáticos são produzidos somente a partir do metabolismo secundário, que ocorre só durante a fase em que as células já estão diferenciadas. O problema é que nesta fase de células diferenciadas o crescimento celular é baixo72.

PATENTES/APLICAÇÕES INDUSTRIAIS

Recentemente foi mostrada uma boa aplicação industrial para a produção de vanilina, através de um processo fermentativo do acido ferúlico, no qual empregou-se o microrganismo Amycolatopsis, cuja produção de vanilina atingiu a concentração de 11,5 g/L73-75. No processo fermentativo com o fungo Pycnoporus a mesma reação levou somente a uma produção de 46 mg/L de vanilina76,77.

A Kraft General Foods descreveu o processo no qual Pseudomonas putida ATCC 55180 acumulou uma concentração de até 210 mg/L de vanilina, através do ácido ferúlico, em 54 dias. Tal concentração pode ser obtida pela adição de um agente redutor (tiol glicol) à cultura de fermentação para reduzir a produção de ácido vanílico, favorecendo a produção de vanilina. A biotransformação do eugenol em vanilina apresentou uma concentração de apenas 3,6 mg/L de vanilina. Nesse sentido, o ácido ferúlico apresenta-se como um melhor substrato para a produção de vanilina78.

Um acúmulo de até 280 mg/L de vanilina foi obtido pela linhagem de Pseudomonas sp. TK2102 (FERM P-12689) através do eugenol. Além disso, nesta reação foram identificados outros metabólitos que incluem álcool coniferílico, aldeído coniferílico, álcool vanílico e ácido ferúlico79.

A bactéria Serratia marcescens oxidou o isoeugenol em vanilina em concentrações de até 3,8 g/L (com um rendimento teórico de 5% e velocidade de biotransformação de apenas 0,018 g/L por h). O eugenol como precursor apresentou um menor rendimento de vanilina (apenas 18 mg/L) por um período de 13 dias80.

Aminoácidos aromáticos (metoxitirosina) foram usados como substratos iniciais para a produção de vanilina utilizando Proteus vulgaris CMCC2840.

Uma nova dioxigenase (Pseudomonas sp) foi patenteada, a qual clivou estilbenos naturais, uma matéria-prima em potencial para a produção de vanilina81.

Enzimas sintéticas foram patenteadas e produzem, além de outros, ácido ferúlico, vanilina e ácido vanílico82.

A produção de vanilina em cultura de Vanilla planifolia e em plantas intactas, inclusive células e plantas transgênicas, foi patenteada, mas o rendimento obtido não foi economicamente interessante83. É provável que, no futuro, novos sistemas microbiológicos, que acumulem uma maior concentração de vanilina, sejam descobertos84.

CONCLUSÃO

Pelo que foi estudado, observa-se que o melhor método atual para a produção de vanilina biotecnologicamente é o método de Haarman e Reimer73, que utiliza Amycolatopsis e rende 11,5 g/L na cultura de fermentação74,75.

A área de biotransformação para a obtenção de vanilina precisa ser mais pesquisada. Existe uma boa possibilidade de se encontrar novos microrganismos que podem ser usados para aplicações práticas e mais viáveis para a indústria.

AGRADECIMENTOS

O presente trabalho foi realizado com o apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento tecnológico – CNPq – Brasil.

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Recebido em 8/3/04; aceito em 14/12/04; publicado na web em 13/4/05

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    11 Ago 2005
  • Data do Fascículo
    Ago 2005

Histórico

  • Aceito
    14 Dez 2004
  • Recebido
    08 Mar 2004
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