LAPACHOL COMO MODELO PARA O ENSINO DE RMN: MODIFICAÇÃO ESTRUTURAL E CARACTERIZAÇÃOResumo
Teaching nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy in undergraduate chemistry poses challenges, particularly in developing skills of the student in spectral interpretation and structural analysis. Many curricula present NMR in a fragmented way, limiting the ability of the student to connect theoretical concepts with practical data. This study proposes a didactic, integrated approach that emphasizes active learning through experimental practice and critical analysis. Techniques such as 1H, 13C, and heteronuclear multiple bond correlation (HMBC) NMR are used to explore chemical shifts, coupling constants, and molecular structure. To support this methodology, lapachol, a secondary metabolite from Tabebuia species, was extracted and used in intramolecular cyclization reactions to synthesize β-lapachone and 3-sulfonic-acid-β-lapachone. These compounds enabled comparative structural analysis and discussion of spectral changes. The inclusion of 2D NMR spectra deepened student understanding of long-range heteronuclear couplings and their relation to structural differences. This practice-oriented strategy fosters critical thinking and improves the teaching of NMR, making it more accessible and meaningful in undergraduate chemistry and related programs.
INTRODUÇÃO
Os metabólitos secundários são substâncias químicas complexas amplamente investigadas devido ao seu significativo potencial biológico e farmacológico. Dentre esses compostos, destaca-se o lapachol (C15H14O3) (1) (Figura 1), um produto natural isolado de diferentes espécies do gênero Tabebuia.1 Esse metabólito tem sido objeto de diversas pesquisas em função de seu amplo espectro de atividades terapêuticas, demonstrando propriedades antitumorais,2,3 leishmanicidas,4 e antimicrobianas.5
Além disso, essa para-naftoquinona (1) pode ser utilizada como composto de partida para a síntese de derivados orto-naftoquinônicos com propriedades farmacológicas promissoras, como a β-lapachona (C15H14O3) (2) (Figura 1), também amplamente estudada por seu potencial biológico. A β-lapachona (2) apresenta atividade antifúngica,6,7 antitumoral,8 leishmanicida,9 e anti-inflamatória.10,11
Outro derivado relevante, ainda que menos explorado, é o ácido 3-sulfônico-β-lapachona (C15H14O6S) (3) (Figura 1), que apresenta atividade antibacteriana12 e se distingue dos demais por sua maior solubilidade em meio aquoso.7,13
A ressonância magnética nuclear (RMN) é uma das técnicas analíticas mais importantes e amplamente utilizadas na identificação e caracterização de compostos orgânicos. Por meio da interação de núcleos atômicos com campos magnéticos, a RMN fornece informações detalhadas sobre o ambiente químico de átomos como o hidrogênio (1H) e o carbono (13C), permitindo a determinação precisa da estrutura molecular, estereoquímica e dinâmicas conformacionais.14 Sua capacidade de diferenciar ambientes eletrônicos e de revelar conectividades entre átomos torna a técnica indispensável em áreas como síntese orgânica, química medicinal e química de produtos naturais.
Considerando a importância das técnicas de RMN de 1H e 13C uni e bidimensionais para a elucidação estrutural dos compostos orgânicos e a escassez de materiais didáticos em português que integrem o isolamento de produtos naturais, modificações estruturais e a interpretação espectral como sequência de aulas, este artigo propõe uma sequência de aulas onde os alunos explorarão a obtenção de um produto natural com relevante bioatividade. Em seguida, usarão esse produto para gerar diferentes derivados sintéticos. E, por fim, os alunos interpretarão os dados fornecidos pelas técnicas de RMN 1H, 13C, 13C DEPT-135 (distortionless enhancement by polarization transfer), 1H-13C HSQC (heteronuclear single quantum coherence) e 1H-13C HMBC (heteronuclear multiple bond correlation), relacionando-os com as modificações estruturais realizadas nas moléculas obtidas.
PARTE EXPERIMENTAL
Análises físico-químicas
Para a determinação do perfil cromatográfico, incluindo o cálculo do fator de retenção, foram utilizadas placas de cromatografia em camada delgada (CCD) de sílica gel suportada em alumina (2,5 × 5 cm) contendo indicador de fluorescência GF254, adquirida da Sigma-Aldrich, e reveladas em câmara de luz UV Solab (SL-204). As temperaturas de fusão (Pf) foram determinadas em um fusiômetro digital Microquímica (MQAPF-302). Os espectros de RMN de 1H e 13C foram obtidos em um espectrômetro Bruker (AscendTM). Para a elucidação dos espectros, utilizou-se o software MestReNova 15.2 (Mestrelab Research S.L. Espanha, 2025).
Reagentes e materiais
Para realização da extração do lapachol: álcool etílico anidro (99,3 °INPM (grau do Instituto Nacional de Pesos e Medidas), Santa Cruz), hidróxido de sódio (98% Alphatec) e ácido clorídrico (36,5-38%, Dinâmica). Para síntese da β-lapachona: ácido sulfúrico (95-98%, A.C.S). Para síntese do ácido 3-sulfônico-β-lapachona: anidrido acético (97%, Vetec), ácido sulfúrico (95-98%, A.C.S) e éter etílico (98%, Synth). Para eluição das placas de CCD: hexano (98,5%, Synth), acetato de etila (99,5%, Synth) e metanol (99,8%, Vetec). Para geração dos espectros de RMN, os solventes clorofórmio-d (CDCl3, Sigma-Aldrich) e dimetilsulfóxido-d6 (DMSO-d6, Sigma-Aldrich) foram utilizados.
Sequência de aulas
Aula 1: extração e purificação do lapachol (1)
Na primeira etapa dessa sequência de aulas, os alunos terão como objetivo a extração e purificação do lapachol (1) para utilização desse material como reagente na execução das aulas seguintes. Nesse momento, conceitos relacionados à exploração da biodiversidade vegetal como fonte de moléculas bioativas podem ser abordados, podendo ser trabalhados aspectos como: farmacobotânica, metabólitos secundários, métodos extrativos e métodos de purificação.
Para realização da extração: pesar 40 g de cerne da madeira de ipê (Tabebuia sp.) cortada ou triturada, a mesma deverá ser reservada em béquer com capacidade para 1 L. Em seguida, deverá ser preparada 400 mL de solução extrativa de NaOH(aq) 1% (m v-1), essa solução será adicionada ao béquer contendo o substrato natural, sendo mantida em repouso ou sob agitação por 1 h. Após esse tempo, o meio de extração deverá ser filtrado para separação da fase líquida, sendo essa submetida a tratamento com 50 mL de solução de HCl(aq) 6 mol L-1 para precipitação da naftoquinona (1). O sólido obtido deverá ser submetido à filtração a vácuo e reservado.
Para purificação do lapachol (1): o sólido será transferido para um béquer com capacidade para 600 mL, e gradualmente dissolvido em etanol 99 °INPM, sob aquecimento em chapa na faixa de 75-80 °C e agitação com bastão de vidro, até completa dissolução. Em seguida, a solução quente será despejada em frasco Erlenmeyer de 500 mL contendo 250 mL de água destilada gelada. Essa mistura deverá ser refrigerada por 30 min, filtrada a vácuo. O sólido obtido deverá ser submetido novamente à cristalização por mais 2 ou 3 vezes, ou até que seja obtido sólido amarelo com aspecto visual e ponto de fusão compatíveis com o demonstrado no Quadro 1.
Aula 2: síntese dos derivados b-lapachona (2) e ácido 3-sulfônico-b-lapachona (3)
Nessa etapa, é possível que a turma seja organizada de diferentes maneiras, de acordo com o tipo de abordagem preferencial do docente, uma vez que cada uma das duas metodologias sintéticas propostas pode ser executada por diferentes grupos, ou ainda, dependendo da disponibilidade de recursos, pode ser escolhido um único método para execução e comparação dos resultados obtidos. Durante a ocorrência das reações, alguns aspectos teóricos podem ser abordados, como o uso de metabólitos secundários para obtenção de novas moléculas.
Para síntese da β-lapachona (2): 242 mg (1 mmol) de lapachol (1) deverá ser adicionado a um balão de reação com capacidade de 25 mL, em seguida deverá ser adicionado ao mesmo frasco 2,5 mL de H2SO4 concentrado. O meio reacional deverá ser mantido sob agitação por bastão magnético sob chapa a temperatura ambiente até que todo o lapachol (1) seja consumido, mediante verificação em CCD. Caso não seja possível o acompanhamento por meio da cromatografia, a reação poderá ser mantida nas condições ditas por 2 h, para garantia de que a reação foi devidamente concluída. Após conclusão do processo, a mistura reacional deverá ser colocada em béquer de 250 mL contendo 200 mL de água destilada gelada, para precipitação do produto. O sólido obtido será posteriormente filtrado e seco a temperatura ambiente.
Para síntese do ácido 3-sulfônico-β-lapachona (3): 242 mg (1 mmol) de lapachol (1) deverá ser adicionado a um balão de reação com capacidade de 25 mL mantido em banho de gelo na faixa entre 5 e 15 °C. Em seguida, deverá ser adicionado 1,5 mL de anidrido acético gelado. Na suspensão formada, sob agitação por bastão magnético, deverá ser adicionado gota a gota 160 μL de H2SO4 concentrado. O meio reacional será mantido sob banho de gelo e agitação até que o consumo total do lapachol (1) seja verificado em CCD. Caso não seja possível o acompanhamento por meio de cromatografia, o meio poderá ser mantido nas condições mencionadas por 2 h, para garantia de que a reação foi devidamente concluída. O sólido obtido deverá ser filtrado, lavado com 60 mL de éter etílico gelado e depois seco a temperatura ambiente.
Aula 3: caracterização do lapachol (1) e seus derivados, a b-lapachona (2) e o ácido 3-sulfônico-b-lapachona (3)
Após obtenção dos produtos sólidos foram iniciadas as etapas de caracterização dos mesmos, sendo interessante inicialmente a determinação dos respectivos fatores de retenção em CCD utilizando os sistemas de eluição: hexano/acetato de etila 5:1 para os compostos (1) e (2). Já para o composto (3), devido às suas características particulares quanto a solubilidade é indicada a utilização de acetato de etila/metanol 5:1. Em seguida, a determinação dos respectivos pontos de fusão, usando aparelho fusiômetro. Para geração dos espectros, as amostras foram solubilizadas em solvente deuterado apropriado como, CDCl3 para (1) e DMSO-d6 para (2) e (3). Em um contexto em que a realização desse tipo de caracterização não seja uma alternativa viável, poderão ser utilizados os espectros disponibilizados no Material Suplementar.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para interpretação inicial dos resultados obtidos é sugerido que os mesmos sejam organizados como demonstrado no Quadro 1. Nesse momento poderão ser estabelecidas discussões que orientem a busca pela correlação entre as estruturas moleculares, as diferenças nos dados físico-químicos obtidos, e também os aspectos visuais dos sólidos. Além disso, também é sugerida a abordagem sobre os mecanismos envolvidos nas reações realizadas, como detalhado nos subtópicos a seguir, com o objetivo de que seja estimulado o raciocínio científico quanto a integração entre os procedimentos experimentais realizados e a base teórica envolvida nesses.
Extração do lapachol (1) a partir da madeira do ipê
Através dos métodos extrativo e de purificação descritos na seção Parte Experimental, deverá ser obtido o lapachol (1) como sólido amarelo claro (Quadro 1). O rendimento do material purificado deverá ser calculado como % (m m-1) numa relação entre a quantidade de produto purificado em g e a quantidade em g de madeira utilizada. Os valores de rendimento obtidos podem variar de acordo com a execução do procedimento de purificação, e principalmente de acordo com a qualidade da madeira utilizada. Como resultados foram obtidos o rendimento de 1,2% (m m-1), o fator de retenção em CCD de 0,67 em sistema de eluição 5:1 hexano/acetato de etila, e ponto de fusão 141-142 °C.7,9,15
O método empregado para a extração da naftoquinona (1) a partir da madeira do ipê foi baseado na protonação/desprotonação da hidroxila presente na molécula. Em meio alcalino, ocorre a desprotonação e formação do sal de sódio do lapachol (1), que possui maior solubilidade aquosa. Passado o tempo de extração, o tratamento com solução ácida possibilita o reestabelecimento do grupo hidroxila, consequentemente, fornecendo o produto com baixa solubilidade aquosa que precipita em meio aquoso (1) (Figura 2).
O método de purificação aplicado teve como objetivo a remoção dos contaminantes extraídos juntamente ao material de interesse. A técnica aplicada utiliza o princípio de solubilidade em diferentes meios para seletivamente separar o lapachol (1) das impurezas, onde a para-naftoquinona com boa solubilidade em etanol é solubilizada em pequenas quantidades de solvente aquecido, e posteriormente precipitada quando sua solução etanólica entra em contato com água destilada em baixa temperatura.
Sínteses da β-lapachona (2) e do ácido 3-sulfônico-β-lapachona (3)
Com a obtenção do lapachol (1), o mesmo foi utilizado como reagente para a síntese da β-lapachona (2),9,12 e do ácido 3-sulfônico-β-lapachona (3),12,13 através da ciclização intramolecular da cadeia lateral isoprenila (Figuras 3 e 4).
No contexto em que foram executadas ambas as metodologias sintéticas propostas, as mesmas podem ser explicadas e comparadas durante o tempo de execução das reações. Essa pode ser uma abordagem interessante do ponto de vista didático, uma vez que, apesar de seguirem uma lógica básica semelhante (ciclização intramolecular), e usarem reagentes em comum, como H2SO4, os métodos aplicados são capazes de gerar moléculas com propriedades estruturais e físico-químicas distintas.
A β-lapachona (2) foi obtida como sólido laranja (Quadro 1), com rendimento de 94%, apresentando ponto de fusão na faixa de 154 155 °C,3,9,12 e fator de retenção 0,33 através do sistema de eluição hexano/acetato de etila 5:1. Já o ácido 3-sulfônico-β-lapachona (3) foi obtido como sólido vermelho (Quadro 1), com rendimento de 80%, sendo verificado ponto de fusão entre 158-160 °C,12 e fator de retenção 0,37 no sistema de eluição 5:1 acetato de etila/metanol.
Ambas as reações para obtenção das moléculas (2) e (3) foram realizadas em ambiente acidificado com objetivo de inserir diferentes substituintes (H ou SO3H) na região alifática insaturada ao passo que ocorre a ciclização dessa mesma cadeia por ataque nucleofílico intramolecular. Apesar do propósito comum semelhante, essas reações diferem em condições, e também nos mecanismos reacionais propostos.
O mecanismo de obtenção da naftoquinona (2) possui menor número de etapas, neste caso, a dupla ligação C=C da cadeia isoprenila é protonada em meio ácido. O carbocátion terciário formado sofre ataque nucleofílico intramolecular da carbonila próxima, levando à ciclização e geração do heterociclo (Figura 3).
Na síntese da molécula (3), a reação pode ser dividida em duas etapas, onde inicialmente o ácido sulfúrico reage com o anidrido acético para que seja gerado in situ o agente sulfonante acetilsulfonato (Figura 4). Devido à alta reatividade dessa espécie química há também a demanda de condições reacionais mais brandas, como resfriamento em banho de gelo durante todo o processo.7,12
A formação de (3) é dada através da reação entre o acetilsulfonato e o lapachol (1). Nessa etapa, os elétrons π alifáticos realizam ataque nucleofílico sobre o enxofre de baixa densidade eletrônica sendo formado o intermediário reacional (Figura 4). Em seguida, há ataque nuclefílico intramolecular a partir da carbonila, que promove a remoção da porção acetil, permitindo a ciclização da cadeia contendo o grupo SO3H, sendo formado o ácido 3-sulfônico-β-lapachona (3).
Caracterização estrutural por espectroscopia de RMN
Para análise dos dados contidos nos espectros de RMN, os mesmos foram abertos no software MestreReNova, e tratados através da aba “Analysis”, onde foram indicados os valores de referência de acordo com os solventes utilizados: CDCl3 1H: d 7.27 (1) e 13C d 77.16 (3); e DMSO-d6: 1H d 2.50 (5) e 13C d 39.52 (7), sendo indicado entre parênteses as multiplicidades dos sinais.13 Em seguida, os sinais foram marcados através da função “peak by peak” demonstrando os valores para seus respectivos deslocamentos químicos em ppm. Os sinais foram integrados através da função “integration” em modo manual para atribuição dos números de hidrogênios respectivos. Por fim, todos esses dados espectrais foram utilizados para cálculo das constantes de acoplamento J que podem ser utilizadas para determinação dos acoplamentos entre os núcleos, de acordo com os espectros contidos no Material Suplementar (Figuras 1S-15S).
Como proposta de abordagem para discussão da caracterização estrutural dos produtos obtidos nas aulas 1 e 2 foi sugerida a apresentação dos espectros para análise comparativa, de modo que os diferentes resultados apresentados por cada naftoquinona sejam correlacionados às suas diferenças estruturais simultaneamente, sendo evidenciadas as mudanças nos deslocamentos químicos de cada grupamento em acordo com as modificações realizadas, como resumido na Tabela 1S (Material Suplementar).
Para a interpretação dos espectros, as estruturas moleculares escolhidas para as aulas experimentais podem ser comparadas. Como sugestão, recomenda-se dividir as porções estruturais em anéis e marcar as áreas onde houve modificações (Figura 5), separando os principais pontos a serem identificados nos espectros.
Espectros de RMN 1D: 1H, 13C e DEPT-135°
As técnicas de RMN 1D são muito importantes para caracterização estrutural de moléculas de origem natural ou sintética, uma vez que são capazes de fornecer uma grande quantidade de informações através dos sinais gerados em espectro. Como, por exemplo, através do RMN 1H é possível determinar a quantidade relativa de hidrogênios em uma estrutura (integração de sinal), os grupos funcionais hidrogenados (deslocamento químico) e a vizinhança entre hidrogênios através da determinação das constantes de acoplamento J para os sinais múltiplos.14
Inicialmente, a partir da integração dos sinais nos espectros de RMN 1H, é possível notar que (3) é a única amostra que apresenta número de hidrogênios incoerente com sua estrutura molecular. Esse fato deve ser destacado, pois é um exemplo de grande relevância sobre como as interações solvente-soluto são fatores de importância também nesse contexto, uma vez que o solvente utilizado para dissolver essa amostra foi o DMSO-d6, que é capaz de realizar abstração de hidrogênios de elevada acidez.
Em seguida, os espectros foram analisados a partir do campo mais baixo (maior deslocamento) onde pode ser destacado que ambos os compostos (2 e 3) demonstraram ausência do sinal de próton referente a OH d 7,34 (s, 1H),9 presentes na molécula (1), indicando sucesso quanto à oxidação do mesmo para formação do sistema orto-carbonílico e, consequentemente, ciclização da cadeia lateral (Figura 6).
As modificações referentes à formação do sistema heterocíclico (anel C) foram demonstradas através da ausência do sinal vinílico HC=C(CH3)2 em d 5,21 (m, 1H) e do metileno adjacente em CH2 d 3,31 (d, J 7,4 Hz, 2H) 9,16 de (1). O sinal atribuído ao próton vinílico poderia apresentar um padrão de triplo hepteto (th), onde o desdobramento principal em tripleto é resultante do acoplamento vicinal com os hidrogênios do grupo metileno adjacente (J ≈ 6 Hz), enquanto o acoplamento adicional com os seis hidrogênios equivalentes das duas metilas geminais produz o padrão de hepteto. Contudo, devido à sobreposição das linhas espectrais, o padrão não é completamente resolvido, sendo o sinal observado experimentalmente como um multipleto.
No lugar do sinal vinílico (d 5,21, m, 1H) e do metileno adjacente (d 3,31, d, J 7,4 Hz, 2H) de (1) surgem dois sinais distintos para os grupos CH2 d 2,38 (t, J 6,6 Hz, 2H) e d 1,81 (t, J 6,6 Hz, 2H)7,9 com vizinhança comprovada através das constantes de acoplamento de mesmo valor, comprovando sucesso na formação do anel pirano na β-lapachona (2). Em adição, os sinais referentes ao CH2 e CH do anel pirano, respectivamente em d 2,85 (m, 2H) e 2,50 (m, 1H),7,12 onde o último está parcialmente sobreposto ao sinal do DMSO-d6, indicam a formação do ácido 3-sulfônico-β-lapachona (3).
Nessa região dos espectros de RMN 1H, há possibilidade de introdução de discussões mais aprofundadas sobre como os diferentes substituintes em R são capazes de promover diferenças nos padrões de acoplamento dos grupamentos CH2 nas moléculas (2) e (3), gerando, em cada caso, multiplicidades diferentes para os sinais desse grupo. Em (2), os hidrogênios do CH2 (C13) são quimicamente e magneticamente equivalentes, ou seja, apresentam mesmo deslocamento químico, além de possuírem acoplamentos spin idênticos com os núcleos vizinhos, resultando em um tripleto pelo acoplamento com dois hidrogênios vizinhos, conforme a regra n + 1 (Figura 7).
Já em (3), o grupo SO3H introduz assimetria estereoquímica, tornando os hidrogênios do CH2 diastereotópicos. Isso leva a acoplamentos diferenciais, tanto com o próton do CH vizinho, quanto entre os hidrogênios do grupo, gerando um multipleto complexo. Nesse caso, a sobreposição com o sinal do solvente dificulta a atribuição direta dos deslocamentos aos respectivos hidrogênios, sendo interessante a aplicação de técnicas de RMN 2D (COSY, HSQC, HMBC) para maior facilidade numa elucidação estrutural mais precisa, assim como será demonstrado nas próximas seções.
Na região de menor deslocamento (d 1,0-2,0), os espectros de RMN de 1H demonstram que os sinais dos grupos CH3 variam conforme a estrutura do composto e seus substituintes. No lapachol (1), os grupos CH3 estão localizados próximos a uma insaturação na cadeia lateral isoprenila, isso desblinda, restringe a rotação livre e os posicionam em ambientes quimicamente distintos, gerando dois simpletos largos d 1,69 (sl, 3H) e d 1,80 (sl, 3H),7 que evidencia que essas duas metilas sofrem blindagem distinta. Visando o aumento da resolução espectral foi aplicada uma função de apodização gaussiana (Gaussian broadening (GB) = 0,15), o que revelou o desdobramento do sinal em d 1,69 em um dupleto com constante de acoplamento J 1,0 Hz (Figura 8a). Esse comportamento confirma a presença de acoplamento de longo alcance, estando em concordância com o desdobramento observado para o sinal em d 5,21.
Ampliação dos espectros de RMN 1H de (1), (2) e (3), 400 MHz, d 1-2. (a) Ampliação do espectro de RMN 1H de (1) após aplicação da função de apodização gaussiana (GB = 0,15)
Na β-lapachona (2), a estrutura cíclica do anel C atribui maior rigidez conformacional e também maior simetria eletrônica, dispondo ambos os CH3 em ambientes equivalentes, o que faz com que haja junção dos sinais de cada grupo levando a único simpleto d 1,41 (s, 6H),9,15 que demonstra a equivalência eletrônica entre esses.
Já no ácido 3-sulfônico-β-lapachona (3), o grupo SO3H de alta eletronegatividade afeta intensamente o ambiente na região em que está posicionado, o que leva à assimetria eletrônica que é evidenciada pelas diferentes intensidades de blindagem dos núcleos de hidrogênios dos CH3, com d 1,43 (s, 3H) e d 1,77 (s, 3H).12 O efeito retirador intenso do substituinte nessa região aumenta consideravelmente o deslocamento químico da metila mais próxima (Figura 8).
Esse contexto pode ser utilizado, mais uma vez, para propor discussões sobre as relações entre as equivalências dos hidrogênios, a geometria molecular e o padrão de desdobramento de sinal apresentado em espectro de RMN 1H.
Por fim, a região dos hidrogênios aromáticos também revela diferentes multiplicidades e constantes de acoplamento, evidenciando as complexidades dos sistemas. Como ilustrado na Figura 9, o lapachol (1) apresenta sinais com padrões de desdobramento relativamente complexos, o que oferece uma oportunidade para discussão mais aprofundada.
Em (1) são observados em região de campo mais baixo, dois duplos dupletos localizados em d 8,12 (dd, 3J1 7,6 Hz; 4J2 1,2 Hz, 1H) e d 8,07 (dd, 3J1 7,6 Hz; 4J2 1,2 Hz, 1H). Devido aos altos valores de deslocamento químico, esses sinais podem ser atribuídos aos hidrogênios vizinhos às carbonilas, cujos efeitos retiradores promovem desblindagem. A multiplicidade observada indica acoplamento com dois hidrogênios não equivalentes, resultando em constantes de acoplamento distintas: uma mais intensa (3J 7,6 Hz), característica de interação em posição orto, e outra mais fraca (4J 1,2 Hz), característica de acoplamento meta. Neste caso, esperava-se um padrão do tipo ddd (dupleto de dupleto de dupleto), entretanto, a baixa constante de acoplamento em para (5J 0,0-1,0 Hz), associada à ausência de resolução espectral, resultou em um duplo dupleto (dd) aparente.
Além disso, no campo mais alto são identificados dois sinais de maior complexidade, dois tripletos de dupletos, d 7,75 (td, 3J1 7,6 Hz; 4J2 1,2 Hz, 1H) e d 7,68 (td, 3J1 7,6 Hz; 4J2 1,2 Hz, 1H).15 Para os hidrogênios H8 e H9, esperava-se um padrão do tipo ddd. Entretanto, como as constantes de acoplamento em orto apresentam valores semelhantes, ocorre a equivalência espectral desses acoplamentos, fazendo com que dois dupletos se combinem em um tripleto. Esse padrão sofre ainda desdobramento pelo acoplamento em meta, originando os respectivos tripletos de dupletos (td) (Figura 9).
Na molécula (2), a multiplicidade dos sinais para a mesma região de aromáticos é bastante diferente, podendo ser utilizado como exemplo sobre como a modificação estrutural dos grupamentos substituintes do anel B também influenciou eletronicamente o sistema do anel A, ao se comparar com (1).
Para (2), são demonstrados em campo mais alto um dupleto largo d 7,89 (d, 3J1 7,6 Hz, 1H),7,12 caraterizado por um sinal oriundo do acoplamento com um próton não equivalente em orto. Embora fosse esperado um sinal ddd, apenas o acoplamento orto, de maior intensidade, foi resolvido experimentalmente. A baixa resolução espectral impossibilitou a detecção dos demais acoplamentos de menor magnitude, correspondentes às interações meta e para. Esse comportamento difere do observado para o lapachol (1), no qual apenas o acoplamento em para não foi resolvido (Figura 9).
Os multipletos em d 7,74 (m, 1H) e 7,75 (m, 1H) correspondem aos sinais dos dois hidrogênios mais próximos ao heterocíclico (H7 e H8) da naftoquinona (2). Para diferenciação desses hidrogênios, portanto, se faz necessária a aplicação de técnica de RMN 2D, como HSQC, que será demonstrado posteriormente.
No espectro da estrutura (3) nessa mesma região é possível destacar no campo mais baixo um dupleto largo, como d 7,91 (d, 3J1 7,4 Hz, 1H). Nesse caso particular, o sinal seguinte integrado para 2H apresenta maior complexidade e multiplicidade que indica a possível sobreposição de duas interações formadas por hidrogênios semelhantes, o que dificulta a caracterização do mesmo e definição de suas constantes de acoplamento, logo caracterizado como d 7,76 (m, 2H).7,12
Uma outra particularidade observada no espectro de (3) é o sinal d 7,61 (m, 1H), que apresenta multiplicidade diferente daquela vista em (1) para o mesmo tipo de hidrogênio (9H), indicando que apesar de serem o mesmo tipo de hidrogênios e em ambiente semelhantes, em (3) possivelmente há uma distorção maior do sistema aromático que leva a interações mais complexas que consequentemente elevam a multiplicidade do sinal.
Um fator que pode ter influenciado a resolução dos acoplamentos na região aromática é o efeito do solvente. O espectro do lapachol (1), obtido em clorofórmio deuterado, apresentou maior resolução espectral quando comparado aos espectros da β-lapachona (2) e do ácido 3-sulfônico-β-lapachona (3), realizados em DMSO-d6, solvente no qual estes compostos apresentaram solubilidade adequada.
Os espectros de RMN 13C evidenciam as variações nos deslocamentos químicos das carbonilas em função da modificação estrutural de 1,4- para 1,2-dicarbonílicos, decorrente da ciclização da cadeia isoprenila. No lapachol (1), os deslocamentos mais altos d 184,7 e 181,8 refletem menor conjugação entre as carbonilas distantes.15,16 Nas orto-quinonas a proximidade entre os grupos C=O permite a ressonância direta, intensificando a conjugação e promovendo desblindagem frente ao campo magnético externo em ambas, como indicado pelos deslocamentos d 177,6 e 178,8 em (2),9,15 e d 177,6 e 179,1 em (3)12 (Figura 10).
Nos espectros de RMN 13C, a comparação entre os compostos revela a ausência dos sinais d 184,7 (C1=O), 123,6 (C2=C) e 152,8 (C3-OH) do lapachol (1),15,16 nos espectros dos compostos (2) e (3). Na β-lapachona (2) esses carbonos dão origem aos sinais em d 160,4 (C5-O-C11) e 112,3 (C6);9 no ácido 3-sulfônico-β-lapachona (3), os correspondentes são d 159,8 (C5-O-C11) e 112,8 (C6).12 Tais mudanças indicam a formação do sistema heterocíclico por meio da saturação da cadeia lateral presentes em (1) (Figuras 3 e 4).
Destacam-se também as alterações nos sinais d 119,8 (C12) e 134,0 (C13) observados no composto (1), também ausentes nas estruturas (2) e (3). Esses carbonos passam a apresentar, respectivamente, d 30,6 (C12) e 78,8 (C11) na β-lapachona (2) e d 59,5 (C12) e 82,0 (C11) no ácido 3-sulfônico-β-lapachona (3).15 Essas mudanças demonstram a saturação da cadeia isoprenila, evidenciada pela expressiva redução no deslocamento químico de C12. Além disso, a diferença entre os valores de C12 em (2) e (3) reflete o efeito de desblindagem promovido pelo grupo SO3H.
Os campos altos dos espectros são demonstrados na Figura 11. Nessa região podem ser destacados inicialmente os sinais referentes a CH3 no composto (1) d 18,1 (C14↔C15) e 25,9 (C14↔C15),15 que sofrem modificações consideráveis quando comparados ao espectro do composto (2) com d 26,1 (C14 e C15),9 uma vez que nesse último o posicionamento dos grupos em ambientes quimicamente equivalente está em acordo com o que foi exibido no espectro de RMN 1H. Por outro lado, o composto (3) apresenta d 21,1 (C14↔C15) e 28,7 (C14↔C15),12 que demonstram a influência do substituinte sulfônico na promoção de maior desblindagem local.
Além das mudanças relativas à saturação da cadeia lateral durante a formação do heterocíclico, como discutido anteriormente, há também modificações dos valores de deslocamento químico dos sinais atribuídos aos grupos CH2 devido as mudanças no ambiente eletrônico próximo. Assim, o sinal de d 22,8 (CH2) da molécula (1) dá lugar a d 15,7 na β-lapachona (2),15,16 com aumento da blindagem após a perda da instauração, e na molécula (3) dá lugar a d 20,5,15 onde o efeito da desblindagem promovida por SO3H é mais uma vez demonstrada.
Como mais uma forma de comprovar a ciclização da cadeia isoprenílica e o sucesso nas modificações estruturais propostas podem ser utilizados os espectros de RMN 13C DEPT-135. Essa técnica permite a distinção entre CH, CH2 e CH3 com base no número de hidrogênios ligados a cada carbono, assim para o DEPT-135 os CH e CH3 são demonstrados como sinais positivos ao longo do espectro, ao contrário de CH2 que demonstra sinais invertidos (negativos). Isso a difere da técnica de RMN 13C convencional onde mesmo carbonos não hidrogenados são indicados (Figura 12).
Experimentos de RMN 2D: HSQC e HMBC
A RMN 1H-13C HSQC é uma técnica de espectroscopia de ressonância magnética que permite observar interações diretas entre os núcleos de hidrogênio 1H e núcleos de carbono 13C. Esta funciona através de uma sequência de pulsos que acoplam os núcleos de diferentes elementos, permitindo a obtenção de um espectro bidimensional onde os sinais são correlacionados fornecendo informações detalhadas sobre as interações entre esses.
A Figura 13 demonstra os hidrogênios diretamente ligados a carbonos do composto (1), e seus respectivos valores de deslocamento químico. Os resultados obtidos podem ser utilizados para corroborar as atribuições de deslocamentos que foram realizadas anteriormente nos espectros 1D. Como no caso da indicação do sinal em d 3,31 (d, J 7,4 Hz, 2H) como pertencente ao CH2, onde estes hidrogênios estão ligados ao carbono em d 22,8, este já havia sido indicado no espectro de DEPT-135 com o sinal invertido. Além disso, é possível diferenciar CH aromáticos através dos valores de deslocamentos e suas correlações.
No resultado do experimento HSQC obtido para a estrutura (2), as correlações entre os diferentes núcleos demonstram concordância com os dados obtidos através dos espectros 1D, onde os hidrogênios d 1,41 (s, 6H) estão correlacionados apenas ao sinal de carbono atribuído as CH3 d 26,1, bem como os hidrogênios em d 2,38 (t, J 6,6 Hz, 2H) e 1,81 (t, J 6,6 Hz, 2H) estão devidamente correlacionados aos carbonos em CH2 de deslocamentos d 15,7 e 30,6, evidenciando mais uma vez a modificação estrutural através da ciclização da cadeia lateral isoprenila (Figura 14).
Outra informação importante que pode ser apontada através desse espectro é a identificação dos hidrogênios presentes nos multipletos d 7,74 (m, 1H) e 7,75 (m, 1H) (Figura 14), onde há correlação respectivamente com dois diferentes carbonos, d 123,5 e 134,8, comprovando a presença de um dos hidrogênios próximo ao oxigênio do heterociclo (7H) e outro mais afastado (8H).
O experimento de HSQC da estrutura (3) também corrobora com os resultados demonstrados pelos espectros 1D, onde é possível identificar devidamente os hidrogênios CH d 7,76 (m, 2H) que, de maneira semelhante a (2), apresentam correlação com carbonos d 123,8 e 135,0, demonstrando posicionamento do primeiro mais próximo ao heterocíclico (7H), e do outro mais afastado (8H) (Figura 15).
Para essa estrutura, a análise desse tipo de espectro é um exemplo particularmente interessante para ser abordado em sala de aula, uma vez que apenas através dos espectros de RMN 1D não foi possível diferenciar adequadamente os hidrogênios em d 2,50 (m, 1H) e 2,85 (m, 2H) indicando quais desses fazem parte do grupo CH2 e qual é pertencente ao carbono assimétrico.
Através do espectro bidimensional é possível identificar que o hidrogênio de deslocamento d 2,50 está correlacionado ao carbono d 20,5, já dos outros dois estão correlacionados à d 20,5 e 59,5 (Figura 15). Por meio dessa informação há possibilidade de identificar claramente um dos hidrogênios d 2,85 (m, 2H) como pertencente ao grupamento quiral, pois o seu carbono correlacionado tem maior deslocamento devido à desblindagem direta promovida pelo grupamento sulfônico.
Por fim, mais uma vez fica evidenciada a influência do grupamento SO3H na desblindagem de CH3 onde, diferentemente de (2), essas apresentam valores de deslocamento diferentes para seus carbonos, como em d 1,43 (s, 3H) que correlaciona com d 21,1 e 1,77 (s, 3H) que correlaciona com d 28,7.
Para um maior aprofundamento no ensino de RMN e na discussão detalhada da caracterização estrutural, é fundamental que seja incluída a análise dos experimentos 1H-13C HMBC. Essa técnica se diferencia do experimento 1H-13C HSQC por detectar correlações heteronucleares de longo alcance (2-3J), envolvendo acoplamentos através de duas a três ligações químicas. Com isso, o HMBC permite observar interações entre hidrogênios e carbonos não diretamente ligados, inclusive aqueles que não possuem hidrogênios ligados diretamente, como carbonos quaternários ou carbonilas. Essa capacidade torna o HMBC uma ferramenta essencialmente relevante para a caracterização estrutural completa de compostos simples ou de maior complexidade.
Como estratégia didática para facilitar a interpretação das interações de longo alcance em espectros HMBC, recomenda-se o uso de setas indicativas entre os hidrogênios e os carbonos correlacionados (Figura 16).
A partir do espectro HMBC obtido para a estrutura (1), é possível estabelecer correlações de longo alcance entre hidrogênios e carbonos, complementando as atribuições já realizadas com base no espectro HSQC. Essas relações permitem confirmar as regiões previamente identificadas da molécula e fornecem informações importantes para a atribuição dos sinais correspondentes aos carbonos não hidrogenados.
Devido à grande quantidade de informações contidas nos espectros, a discussão desses resultados estará disposta aqui de maneira mais direta através da comparação entre as atribuições realizadas para as moléculas (1), (2) e (3). Os espectros podem ser consultados no Material Suplementar (Figuras 1S-15S), para acompanhamento dessa discussão, bem como para utilização em sala de aula como já mencionado.
O carbono com deslocamento químico d 22,8 (C11) no lapachol (1), originalmente não correlacionado com hidrogênios na estrutura do composto, passa a ser identificado como d 15,7 (C13) na β-lapachona (2) e d 20,5 (C13) no ácido 3-sulfônico-β-lapachona (3), após o fechamento da cadeia lateral. Nesses derivados, observa-se que esses carbonos passam a apresentar interações no espectro com os hidrogênios d 1,81 (t, 3J 6,6 Hz, 2H) e 2,85 (m, 1H), respectivamente, demonstrando que, com a formação do heterocíclico e aumento da rigidez estrutural, houve formação de uma interação não presente em (1).
Adicionalmente, o carbono HC com deslocamento d 119,8 (C12) do lapachol (1) exibe interações heteronucleares com os hidrogênios H11 e H14↔H15, respectivamente dos grupos CH2 e CH3 da cadeia isoprenila. No entanto, após a saturação da ligação dupla C=C e o fechamento do anel nas orto-quinonas (2) e (3), esse mesmo carbono passa a apresentar correlações apenas com os hidrogênios do grupo CH2 adjacente. Essa redução nas correlações é compatível com o alongamento da ligação C-C resultante da saturação, que promove diminuição da eficiência do acoplamento heteronuclear com hidrogênios mais distantes.
O outro carbono envolvido na insaturação, d 134,0 (C13) da estrutura (1), demonstra interação com os hidrogênios H11, H14 e H15. Nas estruturas (2) e (3), esse mesmo carbono não hidrogenado é identificado como C11 e apresenta deslocamentos em d 78,8 e 82,0, respectivamente, passando a exibir correlações com os hidrogênios H12, H13, H14 e H15. Essa mudança demonstra que, apesar da saturação da ligação dupla, o fechamento do anel heterocíclico impôs uma conformação espacial que favorece a proximidade entre esses núcleos. Tal proximidade, associada à restrição conformacional da estrutura cíclica, favorece correlações que não são vistas na cadeia aberta, como por exemplo entre o carbono mencionado e H11 no lapachol (1).
Os demais carbonos não hidrogenados puderam ter seus deslocamentos devidamente atribuídos através das correlações com os grupamentos hidrogenados identificados seguindo o mesmo raciocínio de interpretação mencionado anteriormente. As atribuições estão dispostas de maneira resumida na Tabela 1S.
CONCLUSÃO
A realização da sequência de aulas experimentais propostas neste trabalho proporcionou uma abordagem didática focada no aprendizado da caracterização estrutural de diferentes moléculas por meio das técnicas de RMN de 1H e 13C, utilizando o produto natural lapachol (1) e seus derivados sintéticos (2) e (3). A possibilidade de explorar espectros bidimensionais, como o HMBC, e correlacionar as diferenças nos acoplamentos heteronucleares identificados com as diferenças estruturais entre as moléculas de reagente e produto, enriqueceu ainda mais a compreensão sobre o tema por meio de abordagem contextualizada com a prática experimental, permitindo o desenvolvimento de uma visão mais aprofundada sobre o tema.
MATERIAL SUPLEMENTAR
Todos os dados de caracterização das moléculas mencionadas nesse trabalho, bem como seus respectivos espectros de RMN 1H e 13C, 13C DEPT-135, 1H-1H COSY, 1H-13C HSQC e 1H-13C HMBC, estão disponíveis integralmente a partir do website da Química Nova (http://quimicanova.sbq.org.br/), de acesso livre, no formato PDF.
Supplementary PDF
AGRADECIMENTOS
Os autores desejam agradecer à FACEPE (processo APQ 0127 1.06/26 e APQ-0184-1.06/24) pelo apoio financeiro e à CAPES - código de financiamento 001.
DECLARAÇÃO DE DISPONIBILIDADE DE DADOS
Todos os dados que sustentam este estudo estão incluídos no artigo e no material suplementar. Os registros experimentais brutos podem ser disponibilizados pelo autor correspondente mediante solicitação razoável.
REFERÊNCIAS
-
1 da Silva, M. N.; Ferreira, V. F.; de Souza, M. C. B. V.; Quim. Nova 2003, 26, 407. [Crossref]
» Crossref -
2 Fiorito, S.; Epifano, F.; Bruyère, C.; Mathieu, V.; Kiss, R.; Genovese, S.; Bioorg. Med. Chem. Lett. 2014, 24, 454. [Crossref]
» Crossref -
3 Hussain, H.; Green, I. R.; Expert Opin. Ther. Pat. 2017, 27, 1111. [Crossref]
» Crossref -
4 Araújo, I. A. C.; de Paula, R. C.; Alves, C. L.; Faria, K. F.; de Oliveira, M. M.; Mendes, G. G.; Dias, E. M. F. A.; Ribeiro, R. R.; de Oliveira, A. B.; da Silva, S. M.; Exp. Parasitol. 2019, 199, 67. [Crossref]
» Crossref -
5 Souza, M. A.; Johann, S.; Lima, L. A. R. S.; Campos, F. F.; Mendes, I. C.; Beraldo, H.; de Souza-Fagundes, E. M.; Cisalpino, P. S.; Rosa, C. A.; Alves, T. M. A.; de Sá, N. P.; Zani, C. L.; Mem. Inst. Oswaldo Cruz 2013, 108, 342. [Crossref]
» Crossref -
6 Medeiros, C. S.; Pontes-Filho, N. T.; Camara, C. A.; Lima-Filho, J. V.; Oliveira, P. C.; Lemos, S. A.; Leal, A. F. G.; Brandão, J. O. C.; Neves, R. P.; Braz. J. Med. Biol. Res. 2010, 43, 345. [Crossref]
» Crossref -
7 de Souza, M. A. A.; da Silva, A. R.; Ferreira, M. A.; de Lemos, M. J.; Ramos, R. G.; Ferreira, A. B. B.; de Souza, S. R.; Quim. Nova 2008, 31, 1670. [Crossref]
» Crossref - 8 Li, C. J.; Li, Y.; US20050222246A1, 2005
-
9 Guimarães, D. G.; Simplício, S. S.; de Souza, V. C.; Rodrigues, K. A. F.; Carvalho, F. A. A.; Carneiro, S. M. P.; da Costa, M. P.; Gonsalves, A. A.; Araújo, C. R. M.; Rev. Colomb. Cienc. Quim.-Farm. 2021, 50, 505. [Crossref]
» Crossref -
10 Fu, S.-C.; Chau, Y.-P.; Lu, K.-S.; Kung, H.-N.; Histol. Histopathol. 2011, 26, 905. [Crossref]
» Crossref -
11 Mokarizadeh, N.; Karimi, P.; Kazemzadeh, H.; Maroufi, N. F.; Sadigh Eteghad, S.; Nianfar, S.; Rashtchizadeh, N.; Int. Immunopharmacol. 2020, 87, 106810. [Crossref]
» Crossref -
12 Campos, W. R. A.; da Costa, M. M.; Rosa, D. S.; Gonsalves, A. A.; Araújo, C. R. M.; Braz. Arch. Biol. Technol. 2024, 67, e24240053. [Crossref]
» Crossref -
13 Fieser, L. F.; J. Am. Chem. Soc. 1948, 70, 3232. [Crossref]
» Crossref - 14 Paiva, D. L.; Lampman, G. M.; Kriz, G. S.; Vyvyan, J. R.; Introdução à Espectroscopia, 4ª ed.; Cengage Learning: São Paulo, 2010.
- 15 O’neil, M. J.; Heckelman, P. E.; Koch, C. B.; Roman, K. J.; The Merck Index, an Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals, 14th ed.; Merck Co., Inc.: Whitehouse Station, NJ, 2006.
-
16 Inagaki, R.; Ninomiya, M.; Tanaka, K.; Koketsu, M.; ChemMedChem 2015, 10, 1413. [Crossref]
» Crossref
Editado por
-
Editora Associada responsável pelo artigo:
Nyuara A. S. Mesquita
