Estudo microcalorimétrico da interação de tensoativos n-alquil-sulfato de sódio com tripsina a 298 k

Microcalorimetric study of sodium N-alkyl sulfate interactions with trypsin at 298 K

surfactants; protein; microcalorimetry

Estudo microcalorimétrico da interação de tensoativos n-alquil-sulfato de sódio com tripsina a 298 k

Eloi A. Silva Filho

Departamento de Química - Universidade Federal do Espírito Santo (UFES) - 29060-970 - Vitória - ES

Pedro L. O. Volpe

Instituto de Química - Unicamp - CP 6154 - 13083-970 - Campinas - SP

Recebido em 8/4/96; aceito em 24/10/96

Microcalorimetric study of sodium N-alkyl sulfate interactions with trypsin at 298 K. systematic study of the interactions of ionic surfactants with protein trypsin in buffer solution pH 3.5, 7.0 and 9.0, ionic strength 10 mM at 298 K was done using the microcalorimetric technique. In this study, anionic surfactant solutions of the sodium n-alkyl sulfates series (C₈, C₁₀, C₁₂ and C₁₄) were used. The enthalpy of interaction (Δ_intHº) shows that the interaction of the surfactants C₈, C₁₀, C₁₂ and C₁₄ with trypsin in the solution pH 3.5 is an endothermic process with the value of Δ_intHº decreasing linearly with increasing carbon chain length, which is attributed to the unfolding of the polypeptide chain. In the solution pH 7.0, we observed the same trend except for C₁₄. In the solution pH 9.0, from C₁₀ the enthapy of interaction didn't change with the increasing of the carbon chain length due to unfolding of the polypeptide. We concluded that when trypsin is folded, the enthalpy of interaction shows a linear relationship with the surfactant's hydrophobicity, in agreement with Traube's rule.

Keywords: surfactants; protein; microcalorimetry.

INTRODUÇÃO

O estudo termodinâmico da interação de tensoativos iônicos com proteínas globulares é atualmente de grande interesse nas áreas de Físico-Química e Bioquímica.

Tensoativos iônicos ligam-se a proteínas globulares em concentrações abaixo da concentração micelar crítica (CMC) por uma combinação de interações iônicas e hidrofóbicas formando o chamado complexo proteína-tensoativo. A parte lipofílica da molécula de tensoativo, como por exemplo, dodecil-sulfato de sódio (SDS) interage com as regiões hidrofóbicas no interior das proteínas, causando a quebra da sua estrutura secundária e terciária. Também, a formação de pares iônicos entre moléculas de tensoativos e resíduos de aminoácidos contribuem para este processo. Por este motivo, os tensoativos iônicos possuem propriedades desnaturantes incomparáveis, pois em concentrações da ordem de milimolar desnaturam proteínas enquanto que desnaturantes clássicos¹ como uréia e cloridrato de guanidina necessitam de concentrações da ordem de 6,0 a 8,0 M.

A aplicação de tensoativos na bioquímica, principalmente no estudo da solubilização de proteínas intrínsecas das membranas biológicas, tem sido de interesse em estudos físico-químicos sôbre a natureza das interações entre tensoativos e proteínas pelo fato dos tensoativos iônicos serem ingredientes importantes em muitos cosméticos, produtos de toilete, preparações farmacêuticas (soluções de gargarejo, entre outros), e todos estes materiais entram em contato com as proteínas da membrana². No entanto, os estudos da interação de tensoativos iônicos com proteínas existentes na literatura comprovam que os tensoativos iônicos interagem com proteínas através de forças de interação eletrostática e hidrofóbicas, interações estas que contribuem de forma cooperativa para a quebra da estabilidade estrutural da proteína³. No presente trabalho esta complexidade da interação proteína-tensoativo foi estudada utilizando a técnica de titulação microcalorimétrica para obter a entalpia de interação (Δ_intHº).

PARTE EXPERIMENTAL

Tripsina (pancreas bovino) da Sigma Chemical Co., massa molecular média 23300 g.mol^-1. Dodecil-sulfato de sódio (SDS, C₁₂) da Sigma Chemical Co., 99% e decil-sulfato de sódio (DSS, C₁₀) da Fluka foram purificados por extração com éter etílico sob refluxo usando um extrator soxhlet, e depois secados a vácuo⁴. Octil-sulfato de sódio (OSS, C₈) e tetradecil-sulfato de sódio (TDSS, C₁₄) foram sintetizados através da reação de sulfonação dos álcoois octanol (da BDH) e tetradecanol (da Fluka) respectivamente, utilizando o procedimento descrito por Livingston et al⁵.

As soluções tampão foram preparadas segundo o procedimento: tampão acetato pH 3,5 e força iônica I=0,01 M (5,4x10^-5 mol de CH₃COONa.3H₂O/litro + 9,4 x 10^-4 mol de CH₃COOH/litro); tampão fosfato pH 7,0 e força iônica I=0,01 M (3,1 x 10^-4 mol de K₂HPO₄/litro + 6,8 x 10^-4 mol de KH₂PO₄/litro); o tampão bórax pH 9,0 e I=0,01 M foi preparado diretamente do frasco que continha o mesmo, com sua devida especificação da faixa de variação de pH. No ponto isoelétrico da tripsina pH(I)=4,0 foi utilizado a solução tampão biftalato pH 4,0, força iônica 10 mM. Todos os outros reagentes usados foram de grau analítico e as soluções preparadas em água bidestilada. As concentrações micelares críticas (CMC) a 25ºC da série homóloga dos tensoativos n-alquil-sulfato de sódio (C₈, C₁₀, C₁₂ e C₁₄) em água e nas soluções tampão pH 3,5; 7,0 e 9,0 foram determinadas pelo método espectrofotométrico tendo como sonda, o corante azul de metileno conforme descrito por Ray e Némethy⁶ que resultou nos seguintes valores da CMC: C₈ (1,3x10^-1 mol/L), C₁₀ (3,3x10^-2 mol/L), C₁₂ (8,2x10^-3 mol/L) e C₁₄ (2,1x10^-3 mol/L) em boa concordância com os valores encontrados na literatura⁷.

Para a calibração do microcalorímetro foi usado o padrão primário, tris(hidroximetilaminometano), ou THAM, C₄H₁₁O₃N, da Riedel-De HäenAG, que foi triturado e recristalizado por sublimação a vácuo em atmosfera de nitrogênio sob temperatura de 140ºC durante uma hora⁸. Sua pureza foi determinada por titulação potenciométrica (potenciômetro digital da Metrohm Herisau E-500) com HCl 0,01 M, mostrando ser 99,9% puro.

As medidas de absorção no ultravioleta-visível foram feitas nos espectrofotômetro, DMS 100 (da Intralab) e Cary 2300 (da Varian), ambos operando no modo feixe duplo e termostatizado a 25ºC. Todas as medidas foram feitas utilizando soluções de tripsina em concentrações na faixa de 0,6 mg/mL a 4,0 mg/mL preparadas no tampão pH 3,5; 7,0 e 9,0 com força iônica 10 mM.

Foram feitas medidas de variação da entalpia de interação dos n-alquil-sulfato de sódio com tripsina a 25ºC no sistema microcalorimétrico LKB-2277 (Thermal Activity Monitor) no seu modo de titulação microcalorimétrica. Antes de iniciarmos as medidas da variação da entalpia, fizemos uma calibração no sistema microcalorimétrico por meio de uma reação de protonação do tris(hidroximetilaminometano) proposta por Wadsö⁹ que atualmente é recomendada pela IUPAC passando a ser uma reação padrão em diversos laboratórios que utilizam técnicas microcalorimétricas para verificar a precisão e exatidão do calorímetro^10-12. A medida da variação da entalpia de protonação do Tris (D_protHº) foi feita utilizando solução de Tris 1,0 mM e solução do titulante HCl 10 mM o qual foi adicionado em alíquotas de 26 mL com o auxílio de uma microbureta. A entalpia de protonação do THAM resultou no valor de -47,43 ± 0,70 kJ.mol^-1, sendo concordante com os valores encontrados na literatura, na faixa de (-47,44 ± 0,05 a -47,04 ± 0,06 kJ.mol^-1)^13,14.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A variação da entalpia de interação (Δ_intHº/ kJ.mol^-1) tripsina-tensoativo foi determinada experimentalmente utilizando a técnica de titulação microcalorimétrica. As medidas foram realizadas usando soluções dos tensoativos aniônicos da série dos n-alquil-sulfato de sódio (C₈, C₁₀, C₁₂ e C₁₄) em concentrações abaixo da CMC e soluções de Tripsina na faixa de concentração 0,6 a 4,0 mg/mL, todas preparadas no tampão pH 3,5; 7,0 e 9,0 com força iônica 10 mM. Para uma melhor compreensão de como foi determinada a variação da entalpia de interação, descrevemos o exemplo de cálculo da variação da entalpia de interação (Δ_intHº) para a titulação da solução de tripsina 2,0 mg/mL com a solução do tensoativo OSS. Os dados experimentais obtidos são mostrados na tabela 1.

Os dados contidos na tabela 1 mostram o calor observado para cada mol de OSS adicionado na solução de tripsina, sendo que o calor de diluição do OSS na solução tampão e o calor de diluição da tripsina foram descontados. Em todos os dados tabelados de titulação microcalorimétrica tripsina-tensoativo, foram sempre descontados os calores de diluição das soluções. A entalpia de interação tripsina-OSS foi calculada utilizando o gráfico da figura 1, construído com os dados experimentais da tabela 1, onde na abscissa representamos o número de moles do tensoativo OSS e na ordenada o somatório do calor observado (Q_obs./mJ). O coeficiente angular da reta da figura 1 corresponde ao valor de (Δ_intHº), calculada pela equação 1.

Os valores de (Δ_intHº) são valores aparentes e se referem ao calor por mol total de detergente adicionado e não ao calor por mol de detergente efetivamente ligado à proteína. Isto deve-se ao fato de que o método da titulação microcalorimétrica não permite corrigir os valores de Δ_intHº para a fração de tensoativo livre.

A interação tripsina-tensoativo quando estudada pelo método do equilíbrio de diálise consiste num processo lento de difusão do tensoativo através de uma membrana de diálise e conseqüente interação deste tensoativo, inicialmente em baixíssimas concentrações, com a molécula da proteína. Nestas condições, interações cooperativas de natureza iônica e hidrofóbica ocorrem lentamente com a proteína e são monitoradas até atingir o equilíbrio permitindo desta maneira a construção das isotermas de interação².

No processo de titulação microcalorimétrica para a determinação da variação da entalpia de interação Δ_intHº tripsina-tensoativo, imediatamente após adição do titulante (tensoativo), a concentração deste em contato com a tripsina é alta e o calor observado é na realidade, mesmo descontando o efeito da diluição dos reagentes, o resultado líquido de todas as interações que ocorrem.

O valor da variação da entalpia de interação Δ_intHº dos demais tensoativos com a tripsina foram obtidos segundo o mesmo procedimento descrito para o tensoativo OSS e estão contidos na tabela 2.

Podemos observar na tabela 2 que o valor de Δ_intHº para a série homóloga dos n-alquil-sulfato de sódio no pH 3,5 diminui com o aumento da cadeia carbônica do tensoativo. Esta diminuição no valor de Δ_intHº pode ser melhor observado no gráfico (figura 2).

Na figura 2, observamos que a variação da entalpia de interação tripsina-tensoativo (série homóloga dos n-alquil-sulfato de sódio) no pH 3,5 diminuiu linearmente com o aumento da cadeia carbônica do tensoativo. Esta diminuição de Δ_intHº com o aumento da lipofilia provavelmente deve-se a interação cooperativa, prevalecendo nestas condições o efeito hidrofóbico na desnaturação da tripsina. Este comportamento é concordante com o observado nas isotermas de interação².

A relação linear observada entre a entalpia de interação Δ_intHº versus número de carbonos da cadeia alquílica é concordante com o comportamento conhecido como regra de Traube¹⁵. Embora o valor de Δ_intHº seja pequeno e endotérmico, com o aumento da cadeia carbônica do tensoativo o processo tende a tornar-se exotérmico, significando que o processo de desnaturação deva ser entropicamente dirigido.

Utilizando técnicas microcalorimétricas e espectroscópicas, Housaindokht et alli¹⁶ estudaram recentemente a interação da proteína globular insulina com n-alquil-sulfato de sódio e concluíram que a entalpia de desnaturação contribui com cêrca de 85% no valor da entalpia de interação. Estes autores mostraram também, que numa primeira aproximação, a entalpia de interação medida poderá ser expressa em termos da contribuição da entalpia de interação com sítios catiônicos, Δ_catHº, de interação hidrofóbica do tensoativo Δ_hidHºe da entalpia de desnaturação da proteína Δ_dHº, ou seja;

(2)

Nesta aproximação, os autores consideram que extrapolando o valor de Δ_intHº para número de carbono zero na cadeia do tensoativo, Δ_hidHº ® 0, Δ_dHº pode ser estimado. Utilizando esta aproximação obtivemos os valores de Δ_dHº da ordem de 10 kJ.mol^-1 e 24 kJ.mol^-1 nos pH's 3,5 e 7,0 respectivamente para a série dos n-alquil-sulfato de sódio. O valor endotérmico estimado para Δ_dHº em pH 3,5 é menor do que em pH 7,0 e portanto coerente com o fato de que em pH 3,5 a contribuição de sítios catiônicos na interação é maior do que em pH 7,0, isto é, o termo Δ_catHº contribui no abaixamento de Δ_dHº.

Uma revisão da literatura confirma que há uma ampla variação de valores de Δ_dHº para a Tripsina. Os valores obtidos dependem dos métodos usados e da precisão das condições experimentais. Valores desde 30 até 280 kJ.mol^-1 têm sido publicados^16-19.

No tampão fosfato pH 7,0, observamos para os três primeiros membros da série homóloga dos tensoativos n-alquil-sulfato de sódio, a mesma tendência que em pH 3,5, isto é, a variação da entalpia de interação tripsina-tensoativo diminui linearmente com o aumento da cadeia carbônica do tensoativo, sendo que nestas condições Δ_intHº tende para valores mais exotérmicos, figura 3. Este comportamento nos faz crer que Δ_intHº deve-se predominantemente as interações de natureza hidrofóbica, pois neste pH a carga líquida da tripsina tem o mesmo sinal do tensoativo, dependendo apenas do caráter hidrofóbico deste. Entretanto, no pH 7,0 o TDSS mostrou uma quebra na tendência à linearidade com um valor de Δ_intHº da mesma ordem de grandeza que no pH 3,5, isto é, » 1 kJ.mol^-1. Não temos uma explicação para este comportamento, podendo apenas especular em termos de precipitação conforme observado também nos experimentos de equilíbrio de diálise².

No tampão bórax pH 9,0 não observamos a tendência de linearidade de D_intHº com a hidrofobicidade do tensoativo, figura 4 ,sendo o comportamento não linear muito comum nesses casos. Nestas condições o tensoativo OSS apresentou D_intHº próximo de zero e os tensoativos DSS, SDS e TDSS apresentaram praticamente o mesmo valor para D_intHº, sendo a interação neste pH insensível ao aumento da lipofilia do tensoativo, certamente devido a tripsina encontrar-se desnaturada nestas condições.

Sendo a tripsina uma enzima globular de baixo peso molecular e muito hidrofóbica, (hidrofobicidade média de 680 kJmol^-1 na escala de Bigelow²⁰) as suas características estruturais permitem interações hidrofóbicas com as cadeias alquílicas dos tensoativos.

Nos valores de entalpia de interação D_intHº estão contidas contribuições devido a: interação do grupo polar do tensoativo com os resíduos dos amino ácidos catiônicos; interações hidrofóbicas das cadeias n-alquil e desenovelamento da estrutura terciária da tripsina.

Em contraste com a entalpia de interação D_intHº, os valores de DG_uº obtidos nos experimentos de equilíbrio de diálise², mostra pequena dependência do comprimento da cadeia alquílica e pH. Ambas observações sugerem que a cabeça polar do tensoativo exerce também um papel importante na interação tensoativo-tripsina. Os resíduos de amino ácidos carregados localizados na superfície da enzima nativa são acessíveis ao tensoativo, mas as interações iônicas não são marcadamente afetadas pelo estado de desenovelamento da estrutura terciária.

Com base nos resultados de D_intHº obtidos neste trabalho, concluimos que a interação tensoativo-tripsina é predominantemente hidrofóbica. Os dados obtidos nos experimentos de equilíbrio de diálise² mostram que os valores de DG_uº de interação tensoativo-tripsina são consideravelmente maiores do que D_intHº sugerindo que a maior contribuição termodinâmica da interação vem do têrmo entrópico.

Parece provável, portanto, que nos pHs 3,5 e 7,0, o complexo tensoativo-tripsina possa ser do tipo micelar, no qual a molécula hidrofóbica da tripsina forma uma parte integral de uma estrutura micelar simples.

• 1. Jones, M. N.; Biochemical Thermodynamics, Elsevier Sci. Publishers, 2nd edn., 1988, p. 221.
• 2. Volpe, P. L.; Silva Filho, E. A.; Quím. Nova 1994, 17, 199.
• 3. Jones, M. N.; MacFariane, A. J. B.; Paz Andrade, M. I.; Sarmiento, F.; J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1994, 90, 2511.
• 4. Hayashi, S.; Ikeda, S.; J. Phys. Chem. 1980, 84, 744.
• 5. Livingston JR, J. R.; Drogin, R.; Kelly, R. J., I & EC Product Research and Development 1965, 4, 28.
• 6. Ray, A.; Némethy, G.; J. Phys. Chem. 1971, 75, 804.
• 7. Fendler, J. H.; Catalysis in Micellar and Macromolecular Systems, Academic Press: New York, London, 1975, p.20.
• 8. Koch, W. F.; Bigg, D. L.; Dieh, H.; Talanta 1975, 22, 637.
• 9. Wadsö, I.; Acta Chem. Scand. 1968, 22, 927.
• 10. Heringlon, E. F. G.; Pure & Appl. Chem. 1974, 40, 392.
• 11. Poore, V. M.; Beezer, A. E.; Thermochim. Acta 1983, 63, 83.
• 12. Grenthe, I.; Ots, H.; Ginstrup, O.; Acta Chem. Scand. 1970, 24, 1067.
• 13. Hill, J. O.; Öjelund, G.; Wadsö, I.; J. Chem. Thermodyn. 1969, 1, 111.
• 14. Öjelund, G.; Wadsö, I.; Acta Chem. Scand. 1968, 22, 2691.
• 15. Shinoda, K.; Nakagawa, T.; Tamamushi, B.; Isemura, T.;Colloidal Surfactants, Academic Press, New York, 2Ş ed., 1969.
• 16. Housaindokht, M. R.; Jonwa, M. N.; Newall, J. F.; Prieto, G.; Sarmiento, F.; J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1993, 89, 1963.
• 17. Anson, M. L.; Mirsky, A. E.; J. Gen. Physiol. 1933, 17, 393.
• 18. Lazdunski, M.; Biochim. Biophys. Acta 1965, 105, 541.
• 19. Sarmiento, F.; Prieto, G.; Jones, M. N.; J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1992, 88, 1003.
• 20. Bigelow, C. C.; J. Theoret. Biol 1967, 16, 187.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  17 Set 2008
• Data do Fascículo
  Abr 1997

Histórico

• Recebido
  08 Abr 1996
• Aceito
  24 Out 1996