Perda química de carbono e cinética do crescimento celular em cultivos de Spirulina

Chemical carbon losses and growth kinetics in Spirulina cultures

Spirulina sp LEB-18

carbon; microalga

ARTIGO

Perda química de carbono e cinética do crescimento celular em cultivos de Spirulina

Chemical carbon losses and growth kinetics in Spirulina cultures

Michele da Rosa Andrade; Felipe Vieira Camerini; Jorge Alberto Vieira Costa^*

Escola de Química e Alimentos, Universidade Federal do Rio Grande, CP 474, 96201-900 Rio Grande - RS, Brasil

ABSTRACT

Photosynthetic microorganism cultures, such as microalgae, represent one of the alternatives for fossil CO₂ emissions mitigation. Carbon supply is the major cost component in microalgal cultures. Aiming to enhance the dissolved inorganic carbon uptake efficiency in microalgal cultures, Spirulina sp LEB-18 was cultivated in mediums containing NaHCO₃ concentrations ranging from 2.8 to 100 g L^-1. Results indicated that lower dissolved inorganic carbon concentratios (2.8 g L^-1 NaHCO₃) produce higher growth parameters (X_max = 0.75 g L^-1; P_max = 0.145 g L^-1 d^-1; µ_max = 0.254 d^-1) and lower carbon losses (13.61%). At 50 g L^-1 of NaHCO₃ cell growth was inhibited and carbon losses reached 38.73%.

Keywords: carbon; microalga; Spirulina sp LEB-18.

INTRODUÇÃO

Microalgas são microrganismos fotossintéticos que podem ser empregados para capturar dióxido de carbono, contribuindo com a redução do efeito estufa no planeta. A biomassa pode ser utilizada como suplemento alimentar ou para a produção de biocombustíveis, entre outras aplicações.

A biomassa microalgal apresenta cerca de 50% de carbono na sua composição, assim o fornecimento deste nutriente aos cultivos representa um importante componente dos custos de produção, seja gasoso na forma de dióxido de carbono, ou sólido, principalmente na forma de bicarbonato.¹

A fonte de carbono, uma vez dissolvida no meio de cultivo, participa do equilíbrio químico CO_2(aq)↔ H₂CO₃↔ HCO₃^-↔ CO₃^2-, onde a distribuição entre as espécies químicas é determinada pelo pH. A concentração de sais dissolvidos contribui para a pressão osmótica do meio, que pode ter influência na fisiologia celular da microalga, refletindo nas taxas de crescimento e na composição da biomassa. As cianobactérias geralmente crescem em ambientes alcalinos, onde HCO₃^- é a forma predominante no equilíbrio químico.²

Spirulina é a microalga mais estudada com reconhecida habilidade para fixar carbono inorgânico.³ Esta microalga destaca-se por possuir o certificado GRAS (Generally Recognized As Safe) do FDA (Food and Drug Administration), o que garante seu uso como alimento e fármaco. Sua biomassa apresenta alto conteúdo de proteínas (64-74%), ácidos graxos poliinsaturados, pigmentos e vitaminas.⁴ No entanto, trabalhos voltados ao estudo dos fenômenos associados às reações de equilíbrio do carbono inorgânico dissolvido no meio são ainda escassos.

Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o crescimento da biomassa e a perda de carbono em cultivos da microalga Spirulina sp LEB-18 em diferentes concentrações de carbono inorgânico dissolvido.

PARTE EXPERIMENTAL

Foi utilizada a microalga Spirulina sp LEB-18⁵ mantida em meio Zarrouk.⁶ A biomassa foi previamente lavada e centrifugada (15 min, 5000 rpm) para a remoção de sais do meio. A concentração inicial foi 0,15 g L^-1, exceto nos ensaios de avaliação da perda de carbono, onde não houve a presença de células.

O meio de cultivo utilizado nos ensaios foi Zarrouk⁶ modificado, onde a fonte de carbono (NaHCO₃ 16,8 g L^-1) foi adicionada em diferentes concentrações, variando entre 2,8; 5; 10; 20; 50; 80 ou 100 g L^-1. O intervalo de concentrações foi definido entre o início do efeito tampão do sal no meio (2,8 g L^-1) até a saturação da solução (100 g L^-1). Assim, todos os ensaios iniciaram com o mesmo pH (8,2 ± 0,1), eliminando o efeito inicial desta variável no crescimento.

Os experimentos foram descontínuos, realizados em fotobiorreatores do tipo erlenmeyer de 2 L, com 1,8 L de meio. A temperatura foi mantida em 30 °C e o fotoperíodo em 12 h claro/escuro,⁷ com iluminância de 3200 Lux.³ A agitação foi realizada através da injeção de ar estéril a 0,3 vvm (volume de ar por volume de meio por min). O CO₂ do ar foi removido por absorção em NaOH 2 N.

Determinações analíticas

A concentração de biomassa de Spirulina sp LEB-18 foi determinada diariamente através da medida do peso seco de uma alíquota de amostra.⁸ O pH das culturas foi medido diariamente por pHmetro digital (Quimis Q.400H, Brasil). A alcalinidade total foi determinada diariamente por titulação do filtrado dos cultivos com HCl.⁹

Parâmetros de crescimento avaliados

Ao final de cada ensaio a máxima concentração de biomassa de Spirulina sp LEB-18 (X_máx, g L^-1) foi determinada. A produtividade (P, g L^-1 d^-1) foi calculada a partir da equação P = (X_t-X₀).(t_x-t₀)^-1, onde X_t é a concentração de biomassa (g L^-1) no tempo t_x (d) e X₀ é a concentração de biomassa inicial (g L^-1) no tempo t₀ (d),¹⁰ sendo a produtividade máxima (P_máx, g L^-1 d^-1) o maior valor de produtividade obtido. A velocidade específica máxima de crescimento (µ_máx, d^-1) foi calculada por regressão exponencial da fase logarítmica da curva de crescimento.¹¹ O conteúdo de carbono inorgânico total dissolvido e a distribuição das espécies químicas no equilíbrio CO_2(aq)↔ H₂CO₃↔ HCO₃^-↔ CO₃^2- foram calculados a partir das frações de ionização,¹² com valores de pH e alcalinidade total determinados experimentalmente.

A perda de carbono para a atmosfera foi calculada a partir da equação [(C_i - C_f)*(C_i)^-1]*100, onde Ci é a concentração inicial de carbono inorgânico dissolvido no meio e C_f a concentração final.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na Figura 1 são apresentadas as curvas de crescimento de Spirulina sp LEB-18 cultivada em diferentes concentrações de NaHCO₃. O crescimento da biomassa nos ensaios com 5, 10 ou 20 g L^-1 de NaHCO₃ foi semelhante, bem como os parâmetros cinéticos máximos avaliados (Tabela 1), em média X_máx = 0,6 g L^-1, P_máx = 0,08 g L^-1 d^-1 e _máx = 0,13 d^-1. Os maiores parâmetros entre todas as concentrações de NaHCO₃ testadas ocorreram no ensaio contendo 2,8 g L^-1 do sal. Neste ensaio a velocidade específica máxima de crescimento (0,254 d^-1) foi superior à obtida em cultivos de Spirulina com meio Zarrouk padrão, encontrados na literatura (0,093 d^-1;¹³ 0,111 d^-1;¹⁴ 0,2 d^{-1 15}).

Concentrações de 80 e 100 g L^-1 de NaHCO₃ provocaram inibição do crescimento da microalga (dados não apresentados), enquanto o ensaio com 50 g L^-1 de NaHCO₃ apresentou concentração de biomassa aproximadamente constante durante o cultivo (Figura 1).

Quando as células são expostas à alta concentração de NaHCO₃ a fotossíntese pode ser inibida, devido à rápida entrada de sódio na célula.³ A atividade fotossintética pode também ser inibida devido ao alto teor de carbonato (CO₃^2-) formado.^16,17 No ensaio com 50 g L^-1 de NaHCO₃, a concentração de CO₃^2- alcançou 6,3 g L^-1 e o pH 10,1 (Figura 2a). O lento crescimento celular neste ensaio com 50 g L^-1 de NaHCO₃ pode ainda estar associado com o aumento da energia requerida para expulsar o íon Na⁺ da célula, provocando elevadas taxas de respiração noturna, que consome parte da biomassa formada no período claro.^3,8

Perda de carbono nos cultivos

Devido à natureza apolar da membrana plasmática, a resistência à difusão da molécula de CO₂ é menor que a do íon HCO₃^-, tornando o CO₂ a espécie química de carbono inorgânico preferencialmente consumida pelas microalgas.¹⁷ Quando este é consumido, o sistema em equilíbrio CO_2(aq)↔ H₂CO₃↔ HCO₃^-↔ CO₃^2- reage no sentido de formação de CO₂, consumindo H⁺ do meio. Por outro lado, quando a concentração de HCO₃^- é alta, o consumo desta espécie química pode ocorrer pelo seu transporte ativo através da membrana plasmática¹⁸ ou por sua conversão a CO₂ pela enzima anidrase carbônica, segundo a reação HCO₃^-↔ CO₂ + OH^-.^3,19,20 Assim, seja CO₂ ou HCO₃^- a espécie química consumida pelas células, o crescimento celular resulta em aumento do pH do meio de cultivo.

Nos ensaios com 50, 80 e 100 g L^-1 de NaHCO₃ o crescimento da biomassa foi inibido. No entanto, ocorreu aumento do pH (Figura 2a) e queda da concentração de íons HCO₃^-, indicando que, além do crescimento da biomassa, outros fatores provocam a alteração do pH e da concentração de carbono inorgânico dissolvido no meio durante o cultivo de microalgas.

Soluções ricas em carbono inorgânico dissolvido, como o meio Zarrouk, contêm CO₂ livre em concentração superior (0,05 g L^-1) à de equilíbrio com a atmosfera (0,0004 g L^-1 CO₂ a 30 °C).²¹ Enquanto houver esse gradiente, ocorre um fluxo de CO₂ do meio de cultivo para a atmosfera.

O deslocamento do equilíbrio CO_2(aq)↔ H₂CO₃↔ HCO₃^-↔ CO₃^2- no sentido da reposição do CO₂ perdido, com conseqüente consumo de H⁺, provoca o aumento do pH do meio de cultivo até que a concentração de CO₂ dissolvido no meio líquido esteja em equilíbrio com a concentração de CO₂ na atmosfera.

O fluxo de massa entre o meio de cultivo e a atmosfera é proporcional ao gradiente de concentração entre as duas fases.²² Considerando que a concentração de CO₂ livre no meio aumenta em função do aumento da concentração total de carbono inorgânico dissolvido, a maior perda de CO₂ e a maior variação de pH são verificadas nos meios com as maiores concentrações de NaHCO₃ (Figura 2b).

A Figura 3 mostra a queda na concentração de CO₂ nos meios na ausência de Spirulina sp LEB-18. A partir do segundo dia de cultivo a concentração de CO₂ livre tornou-se aproximadamente igual e constante em todas as concentrações de NaHCO₃ testadas. Assim, a utilização de meios sintéticos com altas concentrações de carbono inorgânico no cultivo de microalgas deve ser evitada, uma vez que sua composição inicial é alterada em função das perdas de carbono para o meio externo, resultando em um meio com uma concentração de CO₂ dissolvido próxima à de equilíbrio com a atmosfera.

No ensaio contendo 2,8 g L^-1 de NaHCO₃, onde foram verificados os melhores parâmetros de crescimento para a microalga entre todas as concentrações de NaHCO₃ testadas (Tabela 1), foi verificada a maior diferença entre as variações de pH provocadas pela perda de CO₂ para a atmosfera e as variações provocadas pelas perdas somadas ao consumo biológico (Figura 4a). A Figura 4b mostra a variação da concentração de NaHCO₃ neste ensaio, evidenciando a diferença entre o consumo biológico de carbono e as perdas para a atmosfera. As perdas de carbono em função da concentração de NaHCO₃ no meio são apresentadas na Figura 5, demonstrando que o aumento na concentração de carbono inorgânico dissolvido utilizado no preparo do meio Zarrouk provoca maiores perdas de carbono para a atmosfera.

Além das perdas de carbono dos cultivos para a atmosfera representarem um custo adicional na produção de biomassa, o aumento de pH associado pode conduzir a valores de pH inibitórios ao crescimento celular. Poucos autores consideram as perdas químicas de carbono nos cultivos, de modo que em estudos sobre o pH e o consumo de carbono em cultivos de microalgas estas perdas podem ser confundidas com o consumo biológico de carbono pelas células, levando a resultados equivocados.^21,23,24

A elevação do pH do meio de cultivo reduz a concentração de CO₂ livre, segundo o equilíbrio, dificultando a perda química deste componente para a atmosfera, além de reduzir a suscetibilidade do cultivo de Spirulina à contaminação.²⁵ Assim, microalgas alcalifílicas como Spirulina apresentam características biológicas adequadas às condições físico-químicas do meio, que levam à maior eficiência do consumo de carbono.

CONCLUSÃO

A menor perda química de CO₂ para a atmosfera (13,61%) e os maiores parâmetros de crescimento (X = 0,75 g L^-1, P = 0,145 g L^-1 d^-1, µ = 0,254 d^-1) da microalga Spirulina sp LEB-18 ocorreram no ensaio com a menor concentração de carbono testada (NaHCO₃ 2,8 g L^-1). Com o aumento da concentração de bicarbonato os parâmetros de crescimento diminuíram e as perdas de carbono foram maiores. Em 50 g L^-1 de NaHCO₃ 38,73% do carbono do meio foi perdido para a atmosfera, além de ocorrer inibição do crescimento celular.

A manutenção dos cultivos em baixas concentrações de carbono inorgânico dissolvido pode resultar em maior eficiência no consumo do nutriente pela microalga Spirulina sp LEB-18, contribuindo para a redução de custos em plantas de produção da biomassa microalgal.

Recebido em 16/12/07; aceito em 12/6/08; publicado na web em 10/11/08

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Jan 2009
• Data do Fascículo
  2008

Histórico

• Aceito
  12 Jun 2008
• Recebido
  16 Dez 2007