Atividade antiproliferativa de Sloanea garckeana K. Schum.

Antiproliferative activity of Sloanea garckeana K. Schum.

Sloanea garkeana; Elaeocarpaceae; 3-O-methyl ellagic acid-4'-O-α-L-rhamnoside

ARTIGO

Atividade antiproliferativa de Sloanea garckeana K. Schum.

Antiproliferative activity of Sloanea garckeana K. Schum.

Adriano Lopes Romero^I; Álvaro Fontana^I; Cleuza Conceição da Silva^I; Maria Conceição de Souza^II; João Ernesto de Carvalho^III; Emiret O. Faria^IV; Lucilia Kato^IV; Cecília M. A. de Oliveira^IV,*

^IDepartamento de Química, Universidade Estadual de Maringá, Av. Colombo 1590, 87020-900 Maringá – PR, Brasil

^IINúcleo de Pesquisas em Limnologia, Ictiologia e Aqüicultura, Universidade Estadual de Maringá, Av. Colombo 1590, 87020-900 Maringá – PR, Brasil

^IIICentro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas Biológicas e Agrárias, CP 6171, 13083-970 Campinas - SP, Brasil

^IVInstituto de Química, Universidade Federal de Goiás, CP 131, Campus II, Samambaia, 74001- 970 Goiânia – GO, Brasil

ABSTRACT

The crude methanol extract and hexane, ethyl acetate, chloroform and methanol fractions from leaves of S. garckeana were examined in vitro for their antiproliferative activity on MCF-7, NCI-ADR, NCI-460, UACC-62, 786-0, OVCAR-03, PCO-3 and HT-29 human cancer cell lines. Among the assayed fractions, the ethyl acetate fraction showed to be cytotoxic against 786-0, UACC-62, OVCAR-03 and NCI-ADR cell lines with IC₅₀ values of 12 µg/mL, 42 µg/mL, 53 µg/mL and 51 µg/mL, respectively. Through fractionation and isolation procedures compound (1) was obtained from the EtOAc fraction and its structure was elucidated by spectral techniques.

Keywords:Sloanea garkeana; Elaeocarpaceae; 3-O-methyl ellagic acid-4'-O-α-L-rhamnoside.

INTRODUÇÃO

Elaeocarpaceae é uma família de plantas florais compreendendo 12 gêneros e aproximadamente 600 espécies de árvores e arbustos, os quais estão distribuídas principalmente em regiões tropicais e subtropicais.¹ Os gêneros Aristotelia, Peripentadenia e Elaeocarpus estão entre os mais estudados dentro da família e são conhecidos como fonte de metabólitos ativos derivados de ácido elágico,² além de alcalóides pirrolidínicos³ e indolizidínicos.^4,5 No Brasil, a família Elaeocarpaceae é representada pelos gêneros Sloanea e Crinodendron, cuja fitoquímica é bem pouco conhecida. Somente uma espécie de cada gênero foi investigada e ambas são descritas como fonte de curcubitacinas citotóxicas.^6,7 Como parte de um programa de colaboração interdisciplinar que tem como objetivo o estudo de plantas medicinais, selecionamos para investigação o extrato bruto de Sloanea garckeana, com base no perfil fitoquímico e na atividade citotóxica exibidos por algumas espécies da família. Neste trabalho, descrevemos a atividade antiproliferativa do extrato bruto e das frações de S. garckeana assim como o isolamento de um derivado do ácido elágico (1). A estrutura do composto isolado foi elucidada com base nas análises dos dados espectrais e por comparação com dados da literatura.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O extrato bruto metanólico das folhas de S. garckeana foi submetido à avaliação da atividade antiproliferativa em culturas de células tumorais humanas de UACC-62 (melanoma), NCI-460 (pulmão tipo não pequenas células), MCF-7 (mama), NCI-ADR (mama que expressa o fenótipo de resistência MDR), HT-29 (cólon), OVCAR (ovário), C786-0 (rim) e PCO-3 (próstata) e mostrou-se ativo em concentrações abaixo de 100 µg/mL (Figura 1) para todas as linhagens testadas. Com base neste resultado, o extrato bruto foi fracionado em ordem crescente de polaridade resultando nas frações hexano, CHCl₃, AcOEt e MeOH.

As frações assim obtidas foram avaliadas frente às mesmas células descritas acima e a análise dos dados obtidos permitiu identificar a fração AcOEt (Figura 2, Tabela 1) como a mais ativa entre as quatro frações testadas, sendo predominantemente ativa, com efeito citocida (morte celular), para a linhagem C786-0 (rim) e UACC-62 (melanoma), com valor de IC₅₀ 12 e 42 µg/mL, respectivamente. A fração apresentou ainda, efeito citostático para as linhagens OVCAR (ovário) e NCI-ADR com valores de IC₅₀ de 53 e 51 µg/mL, respectivamente. Alιm disso, a fração CHCl₃ apresentou efeito citocida para a linhagem C786-0 (rim) com valor de IC₅₀ de 32 µg/mL e para a linhagem MCF-7 (mama) com valor de IC₅₀ de 28 µg/mL.

Com base nestes resultados, o fracionamento foi direcionado para o isolamento das substâncias presentes na fração AcOEt, a qual foi submetida à filtração em Sephadex LH-20 com metanol, resultando no isolamento do composto (1), como o constituinte majoritário da mistura.

A identificação do composto (1) foi realizada com base nos dados de RMN ¹³C e ¹H uni e bidimensionais (Tabela 2) e por comparação com dados da literatura.^8,9 No espectro de RMN de ¹³C/DEPT-135º, são observados 21 sinais, dentre eles, 4 relativos a carbonos carbinólicos em δ_C 72,0, 70,3, 70,2, 70,1, um a carbono anomérico em δ_C 100,3 e um outro referente à metila em δ_C 18,1, os quais sugerem uma unidade ramnose. Dois sinais de carbonos metínicos em δ_C 111,9 e 111,7 e 10 de carbonos não ligados a hidrogênio na região de δ_C 107,7–152,9 indicam a presença de dois anéis aromáticos contendo apenas um hidrogênio cada. Duas carbonilas conjugadas em δ_C 158,9 e 159,0 são também observadas, além de um sinal referente a uma metoxila em δ_C 61,2. O espectro de RMN de ¹H confirma a presença da unidade de ramnose através dos sinais entre δ_H 3,30 a 5,50, característicos de hidrogênios carbinólicos; do dupleto em δ_H 5,47 (J = 1,2 Hz), referente ao hidrogênio anomérico e do dupleto em δ_H 1,11 (J = 6,0 Hz), atribuído à metila. Adicionalmente, são observados dois simpletos em δ_H 7,73 e 7,52, com integração para um hidrogênio cada, um simpleto intenso de uma unidade de metoxila em δ_H 4,03, além de dois simpletos referentes a duas hidroxilas em δ_H 11,11 e δ_H 10,79. O espectro de HMQC permite confirmar a presença das unidades aromáticas, além da unidade glicosídica. O espectro ¹H – ¹H COSY apresenta correlações somente para a ramnose, porém o espectro HMBC permite conectar as duas unidades aromáticas através de correlações entre os hidrogênios H-5 (δ_H 7,52) e os carbonos C-1 (δ_C 111,6), C-3 (δ_C 140,4), C-4 (δ_C 152,9) e C-7 (δ_C 159,0); H-5' (δ_H 7,73) e os carbonos C-1' (δ_C 114,6), C-3' (δ_C 141,6), C-4' (δ_C 146,7) e C-7'(δ_C 158,9). Além disso, observa-se também uma correlação entre o hidrogênio anomérico H- 1" (δ_H 5,47) e o carbono C-4'(δ_C 146,7), o que confirma a ligação do resíduo de açúcar neste carbono (Figura 3).

A comparação da estrutura assim obtida com dados da literatura permitiu identificar o composto 1 como sendo o ácido 3-O-metilelágico-4'-O-α-L-ramnopiranosídeo, o qual foi isolado anteriormente de Eucalyptus globulus (Myrtaceae)⁸ e Potentilla discolor (Rosaceae).⁹ O ácido elágico e seus derivados glicosilados e não glicosilados são compostos fenólicos isolados de fontes naturais tais como frutas vermelhas, uvas, nozes e de outras espécies vegetais, sendo comumente associados ao potencial antioxidante destes alimentos.¹⁰ Por outro lado, a atividade citotóxica apresentada pelo extrato AcOEt pode estar relacionada à presença do constituinte majoritário, 3-O-metilelágico-4'-O-α-L-ramnopiranosídeo (1), visto que o ácido elágico na sua forma livre apresenta elevada atividade citotóxica e antiproliferativa para várias linhagens de células.¹¹

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais

Os espectros de RMN de ¹H e ¹³C foram obtidos em espectrômetro Varian Mercury Plus (300,6 MHz para ¹H e 75,45 MHz para ¹³C). Os deslocamentos químicos foram dados em ppm, tendo como referência interna o TMS (δ = 0,0 ppm). A cromatografia em coluna foi realizada em sílica gel 60 [(0,063–0,200 mm) (70-230 mesh ASTM)] e a filtração em Sephadex LH-20. A concentração que promove a inibição de 50% do crescimento celular (IC₅₀) foi determinada por análise de regressão não-linear usando-se o programa GraphPad Prism.

Material vegetal

Sloanea garckeana K. Schumam foi coletada em 12 de outubro de 2000, em Porto Rico-PR, pela Profa. Dra. M. C. de Souza (NUPELIA/UEM). Uma exsicata (no. HUEM 13407) da espécie estudada encontra-se depositada no Herbário do Departamento de Biologia da Universidade Estadual de Maringá.

Preparação e fracionamento do extrato bruto

As folhas secas e moídas (791,52 g) foram exaustivamente extraí­das por maceração à temperatura ambiente com metanol. O extrato bruto obtido foi evaporado sob pressão reduzida em evaporador rotativo à temperatura de 40 ºC, obtendo-se 67,00 g de extrato bruto seco. Parte desse extrato (32,00 g) foi adsorvido em sílica gel e submetido ao pré-fracionamento em coluna cromatográfica utilizando-se os eluentes hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol em ordem crescente de polaridade, obtendo-se as frações hexânica (1,50 g); clorofórmica (3,20 g); acetato de etila (9,09 g) e metanólica (18,10 g). Parte da fração acetato de etila (1,30 g) foi submetida à filtração em Sephadex LH-20 utilizando-se metanol, resultando no isolamento de 6,5 mg do composto (1) na forma de cristais brancos.

Avaliação da atividade antiproliferativa

Para a realização da triagem in vitro foram selecionadas as linhagens: MCF-7 (mama), NCI-ADR (mama com fenótipo de resistência a múltiplas drogas), UACC-62 (melanoma), NCI-460 (pulmão), PCO-3 (próstata), HT-29 (cólon), OVCAR (ovário) e 786-0 (rim). A avaliação da atividade antiproliferativa do extrato bruto metanólico e das frações oriundas do mesmo foi realizada segundo metodologia descrita por Monks e colaboradores,¹² utilizando-se doxorrubicina como controle positivo. Para o teste de atividade, foram plaqueados 100 µL de células em meio RPMI/SFB/gentamicina, em placas de 96 compartimentos. As placas foram incubadas por 24 h a 37 ºC em atmosfera de 5% de CO₂. Depois desse período uma placa controle foi fixada através da adição de ácido tricloroacético para determinação da quantidade de células no momento da adição das drogas. O extrato e as frações foram ensaiados nas concentrações de 0,25; 2,5; 25 e 250 µg/mL e incubados por 48 h. Em seguida, as placas foram coradas pela adição de 50 µL do corante proteico sulforrodamina B (SRB) a 0,4% (peso/volume), dissolvido em ácido acético a 1%, e incubadas a 4 ºC, durante 30 min. O corante ligado às proteínas celulares foi solubilizado com uma solução de Trizma Base na concentração de 10 µM e pH 10,5 por 5 min em ultra-som. A leitura espectrofotométrica da absorbância foi realizada em 560 nm em um leitor de microplacas.

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq pela concessão das bolsas PIBIC de A. L. Romero e A. Fontana e à Fundação Araucária pelo apoio financeiro.

REFERÊNCIAS

1. Mabberley, D. J.; The Plant Book, 2^nd ed., Cambridge University Press: Cambridge, 2000.

2. Elkhateeb, A.; Subeki, K.; Takahashi, K.; Matsuura, H.; Yamasaki, M.; Yamato, O.; Maede, Y.; Katakura, K.; Yoshihara, T.; Nabeta, K.; Phytochemistry 2005, 66, 2577.

3. Katavic, P. L.; Venables, D. A.; Rali, T.; Carroll, A. R.; J. Nat. Prod. 2007, 70, 866.

4. Katavic, P. L.; Venables, D. A.; Forster, P. I.; Guymer, G.; Carroll, A. R.; J. Nat. Prod. 2006, 69, 1295.

5. Carroll, A. R.; Arumugan, G.; Quinn, R. J.; Redburn, J.; Guymer, G.; Grimshaw, P.; J. Org. Chem. 2005, 70, 1889.

6. Rodriguez, N.; Vasquez, Y.; Hussein, A. A.; Coley, P. D.; Solis, P. N.; Gupta, M. P.; J. Nat. Prod. 2003, 66, 1515.

7. Bittner, M.; Poyser, K. A.; Poyser, J. P.; Silva, M.; Weldt, E.; Sammes, P. G.; Phytochemistry 1973, 12, 1427.

8. Yazaki, Y.; Hillis, W. E.; Phytochemistry 1976, 15, 1180.

9. Xue, P-F.; Zhao Y-Y.; Wang, B.; Liang, H.; Biochem. Syst. Ecol. 2006, 34, 825.

10. Zafrilla, P.; Ferreres, F.; Tomas-Barberan, F. A.; J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 3651; Colaric, M.; Veberic, R.; Solar, A.; Hudina, M.; Stampar, F.; J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 6390; Cerda, B.; Tomas-Barberan, F. A.; Espin, J. C.; J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 227.

11. Losso, J. N.; Bansode, R. R.; Trappey, A.; Bawadi, H.A.; Truax, R.; J. Nutr. Biochem. 2004, 15, 672.

12. Monks, A.; Scudiero, D.; Skehan, P.; Shoemaker, R.; Paull, K.; Vistica, D.; Hose, C.; Langley, J.; Cronise, P.; Vaigro-Wolff, A.; Gray-Goodrich, M.; Campbell, H.; Mayo, J.; Boyd, M.; J. Natl. Cancer Inst. 1991, 83, 757.

Recebido em 12/6/07; aceito em 15/2/08; publicado na web em 31/7/08

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  10 Out 2008
• Data do Fascículo
  2008

Histórico

• Recebido
  12 Jun 2007
• Aceito
  15 Fev 2008