Desenvolvimento e validação de método analítico para determinação do teor de sinvastatina em cápsulas magistrais

Development and validation of analytical method for determination of simvastatin in capsules

simvastatin; spectrophotometry; validation studies

NOTA TÉCNICA

Desenvolvimento e validação de método analítico para determinação do teor de sinvastatina em cápsulas magistrais

Development and validation of analytical method for determination of simvastatin in capsules

Hudson Caetano Polonini^I; Felipe Cerqueira dos Santos^I; Urias Pardócimo Vaz^I; Marcos Antônio Fernandes BrandãoI, ^*; Nádia Rezende Barbosa Raposo^II; Anderson de Oliveira Ferreira^III

^IDepartamento Farmacêutico, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Juiz de Fora, Rua José Lourenço Kelmer, s/n, 36036-330 Juiz de Fora - MG, Brasil

^IIDepartamento de Alimentos e Toxicologia, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Juiz de Fora, Rua José Lourenço Kelmer, s/n, 36036-330 Juiz de Fora - MG, Brasil

^IIIOrtofarma Laboratório de Controle da Qualidade, BR 040, Empresarial Park Sul, 39, 36120-000 Matias Barbosa - MG, Brasil

ABSTRACT

Simvastatin is an oral anti-hyperlipidemic that has been widely used to reduce the cardiovascular disease risk. There isn't any pharmacopoeic method to assay this drug in capsules. It was proposed and validated a method for determining the content of simvastatin in capsules by UV/visible spectrophotometry (l = 237 nm), a more affordable method for the compounding pharmacy. The method was validated for linearity, specificity, range, accuracy, precision, performance, robustness, and limits of detection and quantification.

Keywords: simvastatin; spectrophotometry; validation studies.

INTRODUÇÃO

As doenças cardiovasculares (DC), dentre as quais figura a doença arterial coronariana (DAC), são um grande problema de saúde pública, uma vez que é a principal causa de morte no mundo. O Brasil acompanha este fenômeno internacional apresentando valores percentuais de mortalidade em torno de 25% para DC, o que representa cerca de 250.000 óbitos ao ano.¹

Desde 1950, se conhece o risco que representam as taxas elevadas de colesterol plasmático para as doenças coronarianas, sendo seu controle plasmático ligado às proteínas de baixa densidade (LDL-col) fundamental para preveni-las. Desde então, a busca por agentes capazes de controlar as taxas de colesterol plasmático desperta o interesse das indústrias farmacêuticas.²

Nesse contexto, a sinvastatina insere-se como um agente hipocolesterolêmico amplamente utilizado. Trata-se de uma lactona inativa que é convertida em seu b,d-hidroxiácido correspondente (forma ativa), via metabolismo hepático pelo citocromo P450, após administração oral. Este fármaco (Figura 1) é um potente inibidor da enzima 3-hidroxi-3-metil-glutaril-coenzima A (HMGCoA) redutase, que catalisa a síntese de colesterol.¹ É comercializada com o nome de Zocor^® na forma de comprimidos revestidos nas concentrações de 10, 20, 40 e 80 mg e como Sinvastacor^® na forma de comprimido revestido de 5 mg.³

Além das indústrias farmacêuticas, a sinvastatina também atraiu o interesse das farmácias magistrais, que atualmente manipulam extensivamente o fármaco na forma de cápsulas. Tais farmácias passaram, nos últimos anos, por um processo de expansão no número de medicamentos dispensados, o que pode acarretar riscos para o paciente, caso os requisitos de segurança, qualidade e eficácia não sejam comprovados. Desta forma, é essencial o controle de qualidade do produto acabado nas farmácias de manipulação, pois um dos parâmetros que mais comumente apresentam desvios da qualidade é a quantidade de princípio ativo determinada no doseamento.^4,5

Dentre as monografias de produtos acabados que constam nos compêndios oficiais reconhecidos pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária pesquisados (Farmacopeias Brasileira,⁶ Norte-americana,⁷ Britânica,⁸ Europeia,⁹ Internacional - OMS,¹⁰ Japonesa,¹¹ Mexicana¹² e Portuguesa¹³), bem como em outras farmacopeias não oficiais no Brasil (Chinesa¹⁴ e Indiana¹⁵) não há descrição de método para a sinvastatina em cápsulas. A United States Pharmacopeia 32 ⁷ e a British Pharmacopoeia 2010 ⁸ possuem métodos para o doseamento em comprimidos, ambos por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), uma técnica de elevado custo para as farmácias magistrais.

Na literatura consultada, são descritos métodos por cromatografia eletrocinética micelar,¹⁶ voltametria cíclica,¹⁷ CLAE,^18-20 espectrofotometria direta²¹ e espectrofotometria derivativa,²² porém todos destinados ao controle de comprimidos, e não cápsulas. Este fato inviabiliza a execução do controle de qualidade das cápsulas manipuladas por estes estabelecimentos.

O objetivo deste trabalho foi validar um método espectrofotométrico rápido, seguro e de baixo custo para determinação do teor de sinvastatina em cápsulas.

PARTE EXPERIMENTAL

Reagentes e padrão de referência

Cápsulas contendo sinvastatina (10 mg) foram gentilmente fornecidas por Singularis Farmácia de Manipulação Ltda. (São João Nepomuceno, MG). A sinvastatina, substância química de referência Deg (São Paulo, SP), foi padronizada de forma rastreável ao padrão primário da United States Pharmacopoeia (Rockville, MD). O solvente usado foi acetonitrila pró-análise (PA) Vetec (Rio de Janeiro, RJ).

A formulação das cápsulas foi: laurilsulfato de sódio 1,0%; amidoglicolato de sódio 4,0%; dióxido de silício coloidal 0,2%; e lactose mono-hidratada malha 200: celulose microcristalina (3:1, p/p), qsp (quantidade suficiente para) 100,0%.

Os espectros de absorção na região do ultravioleta foram obtidos em espectrofotômetro UV/visível de duplo feixe (Cary 50 Probe, Varian, Palo Alto, CA), com espectro de absorção de 190 a 1100 nm e cubeta de quartzo com caminho óptico de 1,0 cm. O aparelho foi calibrado com acetonitrila PA e as absorvâncias foram lidas em comprimento de onda (l) de 237 nm.

Métodos

Doseamento de cápsulas de sinvastatina

O conteúdo de 20 cápsulas magistrais de sinvastatina foi homogeneizado e uma quantidade de pó equivalente a 50 mg de sinvastatina foi pesada, transferida para balão volumétrico de 100 mL, solubilizada com acetonitrila e diluída com o mesmo solvente até o volume final do balão. A solução foi agitada mecanicamente por 10 min e filtrada em membrana de celulose com porosidade de 0,45 mm. Uma alíquota de 1 mL do filtrado foi então transferida para balão volumétrico de 50 mL, o qual teve seu volume completado com acetonitrila (concentração final = 10 mg mL^-1). A absorvância desta solução foi lida em 237 nm, utilizando acetonitrila como branco. O teor de sinvastatina foi calculado pela comparação com a absorvância do padrão secundário preparado sob as mesmas condições descritas. Todos os experimentos foram conduzidos ao abrigo da luz.

Parâmetros analíticos da validação

Conforme a Resolução RE n. 899, de 29/5/2003,²³ que regulamenta a validação de métodos analíticos e bioanalíticos no Brasil, considera-se que este trabalho (determinação de teor) se encontra classificado na categoria de "Testes quantitativos para a determinação do princípio ativo em produtos farmacêuticos ou matérias-primas". Portanto, foram avaliados os seguintes parâmetros exigidos pela legislação para o método desenvolvido: linearidade e intervalo, especifidade e exatidão, precisão e robustez. Em caráter de complementação, foram determinados os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ).

Linearidade e intervalo

O teste foi realizado a partir de três curvas analíticas, construídas a partir das concentrações de 80, 90, 100, 110 e 120% (faixa de aceitação do produto), de forma a avaliar a relação linear entre a concentração do analito e as absorvâncias obtidas. Para tanto, os dados de cada nível de concentração foram estatisticamente avaliados através de análise de variância (ANOVA) e do valor do coeficiente de correlação da curva analítica. Dessa forma, a linearidade foi avaliada no intervalo de 80-120%, ou seja, de 8-12 mg mL^-1 de sinvastatina na solução final utilizada para leitura espectrofotométrica.

Precisão

O teste de precisão teve o intuito de avaliar o grau de dispersão entre a série de medidas obtidas por um mesmo analista (repetibilidade) e entre dois analistas (precisão intermediária), para soluções na concentração de 100%. A repetibilidade (precisão intraensaio) foi determinada pela análise de 6 replicatas de forma consecutiva e a precisão intermediária também foi realizada em 6 replicatas, mas em 2 dias, por analistas diferentes e em dois períodos do dia.

Especificidade e exatidão

Para determinação da especificidade e da exatidão do método foi realizado um teste de recuperação. A recuperação é a proporção da quantidade do analito que é passível de ser quantificada, sendo que a porcentagem de recuperação é obtida dividindo-se o teor medido do componente adicionado pelo valor efetivamente adicionado e multiplicado por 100.^24,25

Para essa determinação foram preparadas 5 soluções padrão de sinvastatina nas concentrações de 80, 90, 100, 110 e 120%, todas com solução placebo (solução com excipiente). As leituras obtidas para estas soluções foram comparadas com uma solução padrão a 100% não contaminada (dita real), a fim de se avaliar a recuperação obtida.

Robustez

A robustez referente ao preparo da amostra foi avaliada e, para este intento, a legislação brasileira²³ preconiza o estudo da estabilidade da solução analítica, o qual foi realizado com a solução contendo amostra de sinvastatina contaminada com placebo e da solução de padrão secundário, esta última sem contaminação de placebo.²⁶ Este estudo foi realizado através da leitura das soluções imediatamente após o preparo e em intervalos específicos de tempo após o mesmo: 2, 3, 4 e 5 h.

Limites de detecção e quantificação

Os limites de detecção e quantificação do método proposto foram determinados a partir de três curvas de calibração do padrão e foram calculados a partir das Equações 1 e 2:

nas quais S é o desvio padrão do intercepto com o eixo y de três curvas de calibração e a é o coeficiente angular da curva analítica.

Análise estatística

Foi realizada a análise descritiva dos dados, calculando-se a medida da tendência central (média) e medidas de dispersão (desvio padrão, desvio padrão relativo e coeficiente de variação) referentes aos parâmetros avaliados.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O intuito deste trabalho foi validar um método acessível ao setor magistral, ou seja, mais facilmente aplicado à rotina de controle da qualidade de produtos magistrais. Desta forma, foi desenvolvido um método espectrofotométrico para o doseamento de sinvastatina em cápsulas, pois a espectrofotometria no UV/visível é uma alternativa mais econômica e de mais fácil execução quando comparada à CLAE.

A varredura pelos comprimentos de onda de 200-300 nm de uma solução de cápsulas de sinvastatina em acetonitrila a 10 mg mL^-1 forneceu o espectro de absorção visualizado na Figura 2. O espectro evidencia a não interferência dos excipientes na leitura espectrofotométrica. Pode-se visualizar o pico principal situado em 237 nm, o qual serviu de base para o cálculo do teor pela comparação da absorvância entre padrão e amostra nesse comprimento de onda. O teor médio encontrado foi de 99,87%.

A validação deste método possibilita que se afirme que o mesmo é uma ferramenta eficiente para o controle de qualidade de cápsulas de sinvastatina, de modo seguro e confiável analiticamente. Os parâmetros avaliados foram linearidade, limites de detecção e quantificação, precisão, especificidade, exatidão e robustez.

A RE 899/2003 ²³ preconiza que se avalie a relação linear entre os dados gerados durante o processo de validação, considerando-se que um método linear é aquele que gera resultados diretamente proporcionais à concentração do analito, dentro do intervalo especificado.²⁷ Deve-se, então, submeter os resultados a testes estatísticos para determinação do coeficiente de correlação (r), intersecção com eixo y, coeficiente angular, soma residual dos quadrados mínimos da regressão linear e desvio padrão relativo.

Pelo método dos mínimos quadrados, obteve-se a equação da reta y = 0,0526x + 0,0074. A análise da regressão linear demonstrou um coeficiente de determinação (R²) muito próximo da unidade (0,9991), o que sugere a linearidade do método.

Através da análise de variância,^28,29 pode-se testar a linearidade do método e a significância estatística da curva ajustada. Utilizando a razão entre a média quadrática (falta de ajuste) e a média quadrática (erro puro) foi possível verificar se houve falta de ajuste (Tabela 1).

Através do teste F, analisou-se a validade da regressão e o modelo linear da curva analítica. Assim, foram comparados valores de F tabelados e calculados. Para avaliar o comportamento linear da curva, foi comparado o F₀ obtido para a linearidade com o F_crítico ou F_tabelado, de forma que para comprovar a linearidade se deve encontrar um valor de F₀ menor que o F_crítico. Esta relação apresentou um F_calculado (F₀) igual a 3,19, abaixo do valor crítico tabelado 4,83. Pode-se afirmar, portanto, com 95% de confiança, que o modelo é linear e está bem ajustado na faixa de concentração estudada.

Para a validade da regressão, também foram comparados valores de F₀ e F_crítico, de modo que para o coeficiente angular da curva ser diferente de zero se deve ter valores de F₀ maiores que os de F_crítico. O valor encontrado para F₀ foi 6120,16, muito maior do que o F_crítico 6,410. Assim, concluiu-se que a inclinação da reta não é nula.

A partir da curva analítica foram estimados o limite de detecção, a menor concentração detectável de analito pelo método e o limite de quantificação, a menor concentração quantificável do mesmo.^7,26,27 Obtiveram-se os seguintes valores: LD = 0,5879 mg mL^-1 e LQ = 1,9597 mg mL^-1, que demonstram a sensibilidade do método, comprovando que o mesmo é adequado aos objetivos propostos.

Outro parâmetro analítico avaliado, a precisão, mede o grau de variação dos resultados apresentados pelo método proposto. Segundo a RE 899/2003,²³ os resultados obtidos para as medições da precisão não podem apresentar variações, que são expressas em coeficiente de variação, superiores a 5%. Conforme pode ser visto nas Tabelas 2 e 3, todos os resultados encontrados se mantiveram dentro do critério de aceitação, sendo o método preciso para ambos os tipos de precisão avaliados. Logo, pode-se afirmar que o método se apresenta preciso intracorrida e intercorrida.

O critério de aceitação para a recuperação obtida para que o método seja considerado exato e específico é de ± 2,0%,³⁰ ou seja, entre 98,0 e 102,0%. Como a porcentagem de recuperação média foi de 99,88% (Tabela 4), considera-se o método como sendo específico.

De acordo com as normas do ICH (International Conference on Harmonization),²⁶ a exatidão pode ser inferida desde que a precisão, linearidade e especificidade sejam estabelecidas. Sendo assim, pode-se afirmar que o método proposto é exato, visto que estes três parâmetros foram avaliados. Pela Tabela 4, vê-se que tanto a recuperação média para cada nível de concentração quanto para a média de todos os níveis se situaram de 98,0-102,0%. Assim, entende-se que o método é capaz de medir exatamente a sinvastatina mesmo em presença de outros compostos.

Para o estudo da robustez, foi avaliada a estabilidade da solução analítica. Pelos resultados mostrados na Tabela 5, vê-se que as soluções se mantiveram estáveis por até 4 h após o preparo. Apesar de ter havido interferência nas leituras no intervalo de tempo 5 h, pode-se depreender que o método é robusto, pois dentro de 4 h foi possível determinar quantitativamente o fármaco, de modo que os teores encontrados foram próximos aos obtidos na determinação da precisão.

CONCLUSÕES

Nas condições descritas, o método espectrofotométrico para determinação quantitativa de sinvastatina em cápsulas se mostra de acordo com os parâmetros de validação exigidos pela legislação brasileira vigente. O método é, portanto, adequado para análises de rotina de controle de qualidade de cápsulas magistrais contendo sinvastatina, visto ser simples, rápido, seguro e de baixo custo.

Recebido em 23/4/10; aceito em 9/9/10; publicado na web em 8/12/10

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  12 Abr 2011
• Data do Fascículo
  2011

Histórico

• Aceito
  09 Set 2010
• Recebido
  23 Abr 2010