Estudos quimiométricos da pheo formulada em pluronics®: ação fotodinâmica Sobre Artemia salina

Chemometric studies of pheo formulated in pluronics®: photodynamic action against Artemia salina

Resumo

The self-aggregation of pheophytin, a possible photosensitizer for Photodynamic Therapy, is solved by formulation in polymeric surfactant as P-123. The photosensitizer incorporation was found to be time dependent, exhibiting two steps: a partition at the micellar interface followed by an incorporation into the micelle core. The photodynamic efficiency of the formulation was tested by the bioassays against Artemia salina. In order to evaluate how the experimental parameters: pheophytin concentration, P-123 percentage and illumination time influenced the death of artemia, the factorial design 2³ was chosen. The illumination time was found to be the main factor contributing to the mortality of artemia.

photodynamic therapy; pheophytin; polymeric surfactant

photodynamic therapy; pheophytin; polymeric surfactant

ARTIGO

Estudos quimiométricos da pheo formulada em pluronics^®: ação fotodinâmica Sobre Artemia salina

Chemometric studies of pheo formulated in pluronics^®: photodynamic action against Artemia salina

Adriana Passarella Gerola^*; Bianca Martins Estevão; Wilker Caetano; Noboru Hioka; André Luiz Tessaro

Departamento de Química, Universidade Estadual de Maringá, Av. Colombo, 5790, 87020-900 Maringá - PR, Brasil

ABSTRACT

The self-aggregation of pheophytin, a possible photosensitizer for Photodynamic Therapy, is solved by formulation in polymeric surfactant as P-123. The photosensitizer incorporation was found to be time dependent, exhibiting two steps: a partition at the micellar interface followed by an incorporation into the micelle core. The photodynamic efficiency of the formulation was tested by the bioassays against Artemia salina. In order to evaluate how the experimental parameters: pheophytin concentration, P-123 percentage and illumination time influenced the death of artemia, the factorial design 2³ was chosen. The illumination time was found to be the main factor contributing to the mortality of artemia.

Keywords: photodynamic therapy; pheophytin; polymeric surfactant.

INTRODUÇÃO

A utilização de luz no tratamento de doenças é conhecida há tempos, porém a aplicação significativa na medicina ocorreu a partir da segunda metade do século XX.¹ Uma dessas utilizações é a terapia fotodinâmica (TFD) empregada no tratamento de doenças caracterizadas pelo crescimento celular anormal. A TFD consiste na combinação de um composto fotossensível e luz gerando o oxigênio singlete (¹O₂), espécie altamente reativa e responsável pela destruição de células-alvo na TFD do tipo II.^2,3 Um fotossensitizador (FS) adequado para TFD deve apresentar algumas características específicas, tais como, forte absorção da luz na região do vermelho conhecida como janela terapêutica; alto rendimento quântico de oxigênio singlete; alta afinidade e penetração no tecido doente (seletividade); simplicidade na formulação, dentre outras.^4,5 As porfirinas possuem muitas das características requeridas aos fotossensibilizadores, sendo compostos de grande interesse à TFD.

A feofitina (Pheo), obtida pela desmetalação da clorofila, apresenta uma estrutura porfirínica com um dos anéis pirrólicos reduzido, do tipo clorina, e uma cadeia fitil de 20 carbonos (Figura 1A), que aumenta o caráter hidrofóbico da molécula. A hidrofobicidade do FS é uma característica importante, uma vez que aumenta a interação dos compostos fotoativos com a membrana celular. Por outro lado, a alta hidrofobicidade resulta no fenômeno de autoagregação em meio aquoso.⁶ A autoagregação em ambientes aquosos leva à menor solubilidade do fotossensibilizador, diminuição do tempo de vida de seu estado triplete e, consequentemente, diminuição do rendimento de ¹O₂.⁷

O uso de surfactantes é conhecidamente efetivo na formulação de moléculas hidrofóbicas em meio aquoso, tais como fotossensibilizadores mantidos na forma de monômeros. Para aplicações farmacêuticas é interessante utilizar surfactantes poliméricos não iônicos, como polímeros em bloco do tipo oxi-alquílicos. Tem-se especial interesse nos triblocos da classe dos Pluronics, devido à baixa toxicidade em comparação aos surfactantes convencionais.⁸ Além disso, as micelas poliméricas favorecem para que os fármacos possam ser adequadamente absorvidos e incorporados pelos sistemas celulares, com menor toxicidade e efeitos colaterais.⁹

As micelas de Pluronics possuem grupos oxipropilênicos (PPO) na parte interna mais hidrofóbica e oxietilênicos (PEO) nas extremidades mais hidrofílicas.¹⁰ Essas micelas são amplamente aplicadas na solubilização de moléculas lipofílicas através de interações hidrofóbicas e de van der Waals ao bloco hidrofóbico das micelas. O balanço de hidrofobicidade das micelas poliméricas é controlado pela combinação da quantidade de monômeros hidrofílicos e hidrofóbicos, resultando na grande versatilidade desses compostos.¹¹ A utilização de sistemas micelares de surfactantes poliméricos tem sido constante, como carregadores para direcionar o princípio ativo à região alvo, de maneira eficiente e rápida.^12,13 Estes sistemas apresentam maior solubilização, prevenção da agregação e manutenção das propriedades fotofísicas dos compostos hidrofóbicos.⁹

Possíveis fotossensibilizadores para a terapia fotodinâmica podem ser testados no laboratório de forma simples, avaliando-se a atividade sobre o microcrustáceo Artemia salina. Esse é utilizado em ensaios biológicos por apresentar resultados rápidos, não exigir técnicas assépticas e ser de baixo custo, podendo ser encontrado facilmente no comércio.^14-16 Proposto por Michael e colaboradores,¹⁷ o bioensaio é amplamente utilizado correlacionando estudos em microcrustáceos com atividade biológicas, tais como toxinas fitoquímicas,^18-20 toxinas fúngicas,²¹ atividade antitumoral²² e antimicrobiana.²³

Em várias linhas de pesquisa, a utilização de ferramentas estatísticas no planejamento experimental e otimização de processos está bastante difundida.^24-26 A aplicação da quimiometria permite respostas mais rápidas através de um número menor de experimentos, extraindo dados e informações, considerando vários parâmetros experimentais. O planejamento fatorial, por exemplo, permite estudar a correlação entre as variáveis de interesse de uma forma simplificada. Investigações em dois níveis utilizando-se da combinação de k fatores, geram 2^k experimentos, sendo que estes fatores podem ser tanto qualitativos, quanto quantitativos.²⁷

Assim, neste trabalho, utilizaram-se os surfactantes poliméricos F-127 e P-123 (Figura 1B) para formulação da Pheo na forma monomérica e aplicação dos formulados resultantes sobre o microcrustáceo Artemia salina. Os efeitos referentes aos fatores que influenciam a mortalidade da Artemia salina utilizando-se a TFD (concentração de Pheo, % de surfactante e tempo de iluminação) foram quantificados a partir de planejamento fatorial 2³.

PARTE EXPERIMENTAL

Preparação da Pheo

A Pheo foi obtida pela desmetalação da clorofila (Mg-Chl) com a adição de pequenas alíquotas de HCl 2 mol L^-1 em uma solução etanólica de Mg-Chl. A clorofila foi extraída de espinafre, seguindo-se metodologia da literatura.²⁸

Formulação da Pheo em sistemas micelares de F-127 e P-123

As soluções de surfactantes F-127 (MM = 12600 g mol^-1, cmc = 0,01%, m/v) e P-123 (MM = 5800 g mol^-1, cmc = 0,03%, m/v)¹¹ foram preparadas nas concentrações de 0,1; 0,2 e 1,0% (m/v), muito acima da cmc, a partir das quais se investigou a monomerização da feofitina decorrente da interação com a micela. Variou-se a concentração de FS de 1,00 x 10^-6 a 5,00 x 10^-6 mol L^-1, mantendo-se constante a concentração de surfactante. Os estudos foram conduzidos por espectrofotometria UV-Vis (espectrofotômetro Varian, modelo Cary 50). Todos os experimentos foram realizados a 30,0 ºC.

Cinéticas de incorporação da Pheo em micelas de P-123

Investigou-se a cinética de incorporação da Pheo (4,42 x 10^-6 mol L^-1) em P-123 (0,2%, m/v) no comprimento de onda de 667 nm, registrando-se a sobreposição espectral, a 30,0 ºC com o tempo. As cinéticas de incorporação foram ajustadas pelo modelo exponencial de primeira ordem com duas etapas consecutivas:

onde A₁ e A₂ são as amplitudes de absorção na primeira e na segunda etapa, respectivamente, enquanto k₁ e k₂ são as constantes de velocidade de incorporação de suas respectivas etapas.

Ensaios sobre Artemia salina

Para a verificação da atividade fotodinâmica da Pheo, o teste com Artemia salina²⁹ foi adaptado para TFD. Os ovos do microcrustáceo foram deixados em água salina (NaCl 0,1 mol L^-1), a temperatura de aproximadamente 25 ºC num recipiente retangular, constituído por duas partes interligadas (uma iluminada e outra mantida no escuro). Os ovos foram adicionados na parte protegida da luz. O outro lado, iluminado com lâmpada branca de 9 W (AG 6400 K Branca), foi utilizado para atrair as artemias.

Após 48 h, transferiram-se cerca de 20 larvas com água salina para cada tubo de ensaio, utilizando uma pipeta do tipo Pasteur. Posteriormente, adicionaram-se quantidades conhecidas de formulados de Pheo em P-123 para obter as concentrações desejadas em um volume total de 3 mL. Para avaliação da ação fotodinâmica realizou-se a iluminação com sistema de LED (emissão na região de 600-700 nm, potência de 5 mW), com máximo em 663 nm, sem incubação prévia. Ensaios controles foram realizados para analisar a toxicidade do surfactante e da luz sobre a Artemia salina. A contagem dos microcrustáceos vivos e mortos em cada tubo foi feita 1 h após a finalização da iluminação. Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Os resultados estão apresentados em termos de porcentagem de morte, cujos valores estão corrigidos pela morte natural. A fim de verificar a influência das variáveis experimentais sobre a morte dos microcrustáceos, trabalhou-se com o planejamento fatorial 2³. Avaliaram-se os efeitos das variáveis concentração de Pheo ([Pheo]), porcentagem de P-123 (%P) e o tempo de iluminação (t) em dois níveis. Utilizaram-se 1,0 x 10^-6 (-) e 2,0 x 10^-6 (+) mol L^-1 como concentração de feofitina inferior e superior, respectivamente. A porcentagem de P-123 foi de 0,1 (-) e 0,2 (+) %. O tempo de iluminação foi de 1 (-) e 2 (+) h. O cálculo dos efeitos foi realizado com o auxílio do programa Stat-ease (Design-expert^® 6.0.6 Trial).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Formulação de Pheo em micelas poliméricas para aplicação em TFD

A Pheo possui características adequadas como FS para a TFD, assim como o Pheid, seu derivado obtido pela retirada da cadeia fitil, com caráter hidrofílico potencializado, que vem sendo aplicado com êxito sobre várias linhagens de células cancerígenas.^30-35 Dessa maneira, a aplicação limitada da Pheo em TFD é associada à intensa agregação em meio aquoso.³⁶ Logo, esse problema pode ser resolvido por formulações da Pheo mantendo suas características fotoquímicas adequadas à técnica.

A monomerização da Pheo em surfactantes poliméricos foi investigada. Os espectros eletrônicos de absorção da Pheo em F-127 e P-123 são apresentados na Figura 2. Com o surfactante F-127 observou-se a presença de um ombro adicional na região da banda Q (690 nm), o que caracteriza a autoagregação da Pheo.³⁷ Além disso, verificou-se uma diminuição significativa na banda característica de monômeros (667 nm) em F-127. Essas alterações espectrais da Pheo foram observadas em toda a faixa de concentração estudada (1,00 x 10^-6 a 5,00 x 10^-6 mol L^-1) em todas as porcentagens de F-127 (0,1; 0,2 e 1,0% (m/v)). Por outro lado, nos sistemas de P-123 apenas uma banda característica de monômeros foi observada em toda faixa de concentração estudada, semelhante à observada em solvente orgânico. A semelhança entre os espectros da Pheo em sistema micelar aquoso de P-123 e em etanol mostra que esse surfactante é adequado para monomerização da Pheo.

O valor de HLB de cada surfactante representa seu balanço hidrofílico-lipofílico.

O valor de HLB relativamente menor do P-123 (HLB = 8) em relação ao F-127 (HLB = 22)¹¹ mostra um maior balanço lipofílico do P-123. Assim, a maior capacidade de monomerização da Pheo no surfactante P-123 pode ser explicada em termos da composição estrutural de cada surfactante. O F-127 possui um maior número de unidades hidrofílicas (EO) em relação ao P-123, levando a micelas com uma camada interna hidrofóbica menor para o primeiro surfactante, limitando a capacidade de acomodar moléculas hidrofóbicas grandes como a Pheo.

Uma vez que as micelas de P-123 foram mais eficazes na monomerização da Pheo comparativamente às micelas de F-127, as primeiras são mais adequadas para formulações desse FS nos ensaios posteriores sobre Artemia salina.

Cinética de incorporação da Pheo em micelas de P-123

A monomerização da Pheo em micelas de P-123 apresentou dependência temporal, observando-se uma cinética de incorporação relativamente lenta. Modelos cinéticos de primeira e segunda ordem foram testados e não apresentaram ajustes. A cinética de incorporação da Pheo em P-123 ajustou-se a um modelo exponencial de primeira ordem com duas etapas consecutivas (Figura 3).

Quanto à primeira etapa, a constante de velocidade desta (k₁ = 1,14 x 10^-2 s^-1), muito rápida, é atribuída à entrada do FS na camada externa das micelas. A segunda etapa, relativamente lenta (k₂ = 1,08 x 10^-3 s^-1), é devida à incorporação do composto na parte interna da micela. As interações hidrofóbicas entre o FS e a região interna da micela atuam como uma força propulsora para incorporação.

Ação fotodinâmica da Pheo sobre Artemia salina

O teste de toxicidade sobre Artemia salina vem sendo usado como modelo para atividade antitumoral, apresentando boas correlações.²⁹ Mediante a simplicidade desses ensaios, foram utilizados na avaliação da atividade fotodinâmica da Pheo formulada em P-123. Nos bioensaios controles foi verificado que isoladamente o surfactante e a luz não apresentaram efeito tóxico sobre esse microcrustáceo.

A princípio, para se avaliar a magnitude dos parâmetros experimentais de modo otimizado na porcentagem de morte das artemias aplicou-se o planejamento fatorial 2³. As variáveis experimentais concentração de feofitina [Pheo], porcentagem de P-123 (%P) e tempo de iluminação (t) foram analisadas em dois níveis. A estratégia mostrada na Tabela 1 para o planejamento fatorial 2³ foi a combinação de todos os níveis, de acordo com a matriz de planejamento. Na Tabela 1 são incluídas as respostas (média das porcentagens de morte real). A partir desses dados calcularam-se as magnitudes dos fatores para cada parâmetro investigado, juntamente com suas interações, apresentadas na Tabela 2.

Os valores de mortalidade média mostram que o parâmetro que mais influenciou no extermínio dos microcrustáceos foi o tempo de iluminação. Os demais parâmetros experimentais investigados apresentaram efeitos semelhantes na mortandade destes organismos. Todos os resultados indicam que ao passar do nível inferior (-) para o nível superior (+) há aumento na morte das artemias. As interações de segunda ordem apresentam valores significativos, demonstrando a presença de efeitos cooperativos, com destaque para a interação %P x t. As interações de terceira ordem foram insignificantes.

Analisando-se o efeito da concentração da Pheo na ação fotodinâmica sobre as artemias, observa-se uma pequena contribuição deste fator. A elevação da concentração desta de 1,0 x 10^-6 mol L^-1 (-) para 2,0 x 10^-6 mol L^-1 (+) acarreta aumento da mortalidade dos micro-organismos de 4,58 ± 1,56%, que pode ser justificado pela maior quantidade de fotossensibilizador monomerizado no sistema. Estudos de monomerização da Pheo realizados previamente mostraram que as porcentagens de surfactantes empregadas são suficientes para monomerizar a Pheo em meio aquoso. Uma possível explicação para a pequena influência da concentração da Pheo na mortalidade dos microcrustáceos é o aumento da força iônica devido à presença de NaCl nos ensaios de Artemia salina, aumentando a tendência de autoagregação do FS.³⁸ Esse processo diminui a ação fotodinâmica do FS, uma vez que leva à autossupressão de energia, fenômeno que diminui o tempo de vida do estado excitado e, consequentemente, a formação de oxigênio singlete.

Em relação ao efeito da porcentagem de surfactante sobre a morte das artemias observa-se novamente pequena contribuição (7,92 ± 1,56%). Essa pequena influência na letalidade dos microcrustáceos deve ser creditada à incorporação de mais moléculas de Pheo nas micelas poliméricas ao passar do nível inferior (-) para o superior (+), uma vez que o surfactante polimérico P-123 é atóxico.

O efeito exercido pelo tempo de iluminação foi o mais significativo na mortalidade das artemias (22,92 ± 1,56%). A exposição do FS durante um maior período resulta em uma maior quantidade de fótons absorvidos, levando a um aumento na quantidade de Pheo no estado excitado capaz de transferir energia para o oxigênio, formando espécies ativas responsáveis pela morte das artemias.

A interação dos efeitos principais também foi significativa na inativação fotodinâmica das artemias. Analisando-se a Figura 4A onde se tem a interação dos efeitos [Pheo] x %P, no nível inferior de P-123 tem-se uma inclinação muito menor do que no nível superior do surfactante; essa diferença da inclinação das retas ilustra a forte interação entre os fatores, relacionada ao processo de monomerização do FS.³⁹

A interação dos fatores [Pheo] x t é um ponto essencial para a eficácia da TFD que, por sua vez, depende diretamente da ativação do FS pela luz. Considerando o sistema de P-123 0,2% (Figura 4B), observa-se uma pequena inclinação da reta no nível inferior de iluminação (1 h) com o aumento da concentração de Pheo em relação ao nível superior de iluminação (2 h). Esse fato evidencia a interação entre os efeitos principais [Pheo] x t.

A interação de segunda ordem % P x t mostrou-se muito significativa, embora não possua uma explicação química, visto que o surfactante não possui interação fotoquímica com a luz aplicada (660 nm). O alto valor observado deve ser decorrente de processos paralelos referentes à cinética de incorporação da Pheo nas micelas de P-123. Nos experimentos sobre Artemia salina, realizados com o tempo de iluminação de 1 h, tem-se o processo de incorporação da Pheo durante grande parte do experimento. Dessa maneira, a ação fotodinâmica limitada deve-se ao fato de que o FS não se encontra completamente monomerizado. Por outro lado, quando o tempo de iluminação foi de 2 h, teve-se uma etapa inicial em que o FS estava se incorporando à micela e outra etapa em que a Pheo estava efetivamente incorporada e monomerizada. Assim, o valor encontrado para a interação dos efeitos % P x t não representa uma interação real, mas um efeito adicional decorrente de uma etapa paralela que está ocorrendo e que afeta diretamente a ação fotodinâmica do FS sobre as artemias.

Adicionalmente, para melhor visualização da magnitude de cada parâmetro, calcularam-se as porcentagens de variações para os fatores e para as interações cooperativas. Os efeitos médios da % de morte (%) nos níveis inferior (-) e superior (+) foram calculados por Σ(%_-/4) e Σ(%₊/4) para cada parâmetro. A porcentagem de variação (Figura 5) foi obtida pela diferença entre a % de morte média (Tabela 2) e os efeitos médios calculados. Os resultados obtidos, assim como os discutidos anteriormente, mostraram que todos os efeitos principais e secundários foram significativos, e o tempo de iluminação é o fator que mais influenciou a morte dos microcrustáceos.

CONCLUSÃO

Os sistemas micelares de P-123 foram mais eficientes na formulação da Pheo do que os de F-127, sendo essa diferença atribuída ao menor balanço hidrofílico-lipofílico do primeiro. A formulação da Pheo em P-123 soluciona o problema de solubilidade desse FS em meio aquoso, mais adequado para aplicações clínicas, com manutenção das suas propriedades fotofísicas.

A cinética de incorporação da Pheo às micelas de P-123 ajustou-se ao modelo cinético de primeira ordem, com duas etapas consecutivas. A primeira etapa (rápida) é atribuída à partição da Pheo à interface micelar, seguida da incorporação lenta da mesma ao interior hidrofóbico da micela.

A utilização do planejamento fatorial 2³ no bioensaio com Artemia salina mostrou a correlação entre os três fatores estudados. Os efeitos de [Pheo], %P e t foram significativos na ação fotodinâmica do FS, bem como a interação de segunda ordem entre eles, mostrando a importância desses fatores na otimização da ação fotodinâmica do sistema formulado para aplicação em TFD.

AGRADECIMENTOS

À Fundação Araucária (SETI/PR), CAPES/NanoBiotec e CNPq.

Recebido em 27/4/12; aceito em 7/8/12; publicado na web em 28/11/12

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  15 Fev 2013
• Data do Fascículo
  2013

Histórico

• Recebido
  27 Abr 2012
• Aceito
  07 Ago 2012