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DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA POR ESPECTROFOTOMETRIA NO VISÍVEL PARA QUANTIFICAÇÃO DE TANINOS TOTAIS NA CASCA DO CAULE DE Simarouba amara Aubl.

DEVELOPMENT AND VALIDATION OF ANALYTICAL METHODOLOGY BY SPECTROPHOTOMETRY IN THE VISIBLE FOR QUANTIFICATION OF TOTAL TANNINS IN THE STEM BARK OF Simarouba amara Aubl.

Resumos

As cascas do caule de Simarouba amara Aubl., Simaroubaceae, são amplamente utilizadas pela medicina popular brasileira e de vários países das Américas Central e do Sul para o tratamento de malária, parasitas intestinais, diarreia, anemia e febre. Apesar de os quassinoides serem considerados os marcadores quimiotaxonômicos da espécie, a indisponibilidade de padrões para comercialização tem sido um dos grandes obstáculos à realização de seu controle de qualidade. Diante disso, o propósito deste estudo foi o desenvolvimento e validação de metodologia analítica por espectrofotometria para a quantificação do teor de taninos totais das cascas do caule de S. amara, visto que esta classe de metabólitos é uma das mais abundantes e representativas já descritas para a espécie. O método proposto baseou-se na quantificação a 760 nm, após a adição do reagente Folin-Ciocalteu, e sua validação incluiu todos os parâmetros preconizados pela RE 899. Os resultados indicaram que o método proposto foi adequadamente desenvolvido e validado, constituindo ferramenta analítica útil para o controle de qualidade de S. amara.

Reagente Folin-Ciocalteau; Simaroubaceae; Teor de Taninos


The stem bark of Simarouba amara Aubl., Simaroubaceae, is widely used in Brazilian folk medicine and in many countries of Central and South America for the treatment of malaria, intestinal parasites, diarrhea, anemia and fever. Although quassinoids are considered chemotaxonomic markers of the species, the unavailability of commercialization standards stay as a challenge for its quality control. Therefore, the purpose of this study was the development and validation of an analytical methodology by spectrophotometry to quantify the total tannin content from stem bark of S. amara, since this class of metabolites is one of the most abundant and representative in the species. The proposed method was based on quantification at 760 nm after addition of Folin-Ciocalteu reagent and its validation included all parameters recommended by the RE 899. The results showed that the proposed method was adequately developed and validated, and it is an useful analytical tool for the quality control of S. amara.

Folin-Ciocalteu reagent; Simaroubaceae; Tannin content


1. INTRODUÇÃO

A família Simaroubaceae apresenta distribuição pantropical e é caracterizada pela presença de quassinoides, produtos de degradação de triterpenos altamente oxigenados e estruturalmente complexos, os quais consistem em marcadores quimiotaxonômicos dessa família (ALMEIDA et al., 2007ALMEIDA, M. M. B.; ARRIAGA, A. M. C.; SANTOS, A. K. L.; LEMOS, T. L. G.; BRAZ-FILHO, R.; VIEIRA, I. J. C. Ocorrência e atividade biológica de quassinoides da última década. Quimica Nova, v.30, n.4, p.935-951, 2007.). Suas espécies são amplamente utilizadas na medicina popular por apresentarem atividade antimalárica, anti-helmíntica, antitumoral, anti-inflamatória, antiviral, anorexígena, tônica, inseticida e amebicida (ARRIAGA et al., 2002ARRIAGA, A. M. C.; MESQUITA, A. C.; PULIQUEN, Y. B. M.; LIMA, R. A.; CAVALCANTE, S. H.; CARVALHO, M. G.; SIQUEIRA, J. A.; ALEGRIO, L. V.; BRAZ-FILHO, R. Chemical constituents of Simarouba versicolor. Anais da Academia Brasileira de Ciência, v.74, n.3, p.415-424, 2002.; MUHAMMAD et al., 2004MUHAMMAD, I.; BEDIR, E.; KHAN, S. I.; TEKWANI, B. L.; KHAN, I. A.; TAKAMATSU, S.; PELLETIER, J.; WALKER, L. A. A new antimalarial quassinoid from Simaba orinocensis. Journal of Natural Products, v.62, p.772-777, 2004.; SARAIVA; PINTO, 2006SARAIVA, R. C. G.; PINTO, A. C. Triterpenos e alcaloide tipo cantinona dos galhos de Simaba polyphylla(Cavalcante) W. W. Thomas (Simaroubaceae). Quimica Nova, v.29, n.2, p.264-268, 2006.; CACHET et al., 2009CACHET, N.; HOAKWIE, F.; BERTANI, S.; BOURDY, G.; DEHARO, E.; STIEN, D.; HOUEL, E.; GORNITZA, H.; FILLAUX, J.; CHEVALLEY, S.; VALENTIN, A.; JULLIAN, V. Antimalarial activity of simalikalactone E, a new quassinoid from Quassia amara L. (Simaroubaceae). Antimicrobial Agentsand Chemotherapy, v.53, n.10, p.4393-4398, 2009.; SILVA et al., 2010SILVA, M. A. B.; MELO, L. V. L.; RIBEIRO, R. V.; SOUZA, J. P. M.; LIMA, J. C. S.; MARTINS, D. T. O.; SILVA, R. M. Levantamento etnobotânico de plantas utilizadas como anti-hiperlipidêmicas e anorexígenas pela população de Nova Xavantina-MT, Brasil. Revista Brasileira Farmacognosia, v.20, n.4, p.549-562, 2010.). Entre suas atividades farmacológicas comprovadas, destacam-se as ações antitumoral in vitro (OGURA et al., 1977OGURA, M.; CORDELL, G.A.; KINGHORN, A. D.; FARNSWORTH, N. R. Potential anticancer agents VI.Constituents of Ailanthus excelsa(Simaroubaceae). Lloydia, v.40, n.6, p.579-84, 1977.), antileucêmica (GHOSH et al., 1977GOSH, P. C.; LARRAHONDO, J. E.; LEQUESNE, P. W.; RAFFAUF, R. F. Antitumor plants. IV. Constituents of Simarouba versicolor. Lloydia, v.40, n.4, p.364-369, 1977.; POLONSKY et al., 1978POLONSKY, J.; VARON, Z.; JACQUEMIN, H.; PETTIT, G. R. The isolation and structure of 13,18-dehydroglaucarubinone a new antineoplastic quassinoid from Simarouba amara. Experientia, v.34, n.9, p.1122-1123, 1978.; VALERIOTE et al., 1998VALERIOTE, F.A.; CORBETT, T. H.; GRIECO, P. A.; MOHER, E. D.; COLLINS, J. L.; FLECK, T. J. Anticancer activity of Glaucarubinone analogues. Oncology Research, v. 10, n. 4, p. 201-208, 1998.), antiviral in vitro contra herpes vírus, influenza vírus, poliovírus e vírus vaccínia (KAIJ-A-KAMB, 1992KAIJ-A-KAMB, M.; AMOROS, M.; GIRRE, L. Search for new antiviral agents of plant origin. Pharmaceutica Acta Helvetica, v.67, n.5/6, p.130-147, 1992.), amebicida (WRIGHT et al., 1988WRIGHT, C. W.; O'NEILL, M. J.; PHILLIPSON, J. D.; WARHURST, D. C. Use of microdilution to assess in vitro antiamoebic activities of Brucea javanica fruits, Simarouba amara stem, and a number of quassinoids. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.32, n.11, p.1725-1729, 1988.) e antimicrobiana contra Salmonella typhosa, Shigella flexneri (CACERES et al., 1990CACERES, A.; CANO, O.; SAMAYOA, B.; AQUILAR, L. Plants used in Guatemala for the treatment of gastrointestinal disorders. 1. Screening of 84 plants against enterobacteria. Journal of Ethnopharmacology, v.30, n.1, p.55-73, 1990.), Plasmodium falciparum (KAUR et al., 2009KAUR, K. Antimalarials from nature. Bioorganic & Medicinal Chemistry, v.17, p.3229-3256, 2009.) e Plasmodium berghei (MARIATH et al., 2009MARIATH, I. R.; FALCÃO, H. S.; BARBOSA-FILHO, J. M.; SOUSA, L. C. F.; TOMAZ, A. C. A.; BATISTA, L. M.; DINIZ, M. F. F. M.; ATAHYDE-FILHO, P. F.; TAVARES, J. F.; SILVA, M. S.; CUNHA, E. V. L. Plants of the American continent with antimalarial activity. Revista Brasileira Farmacognosia, v.19, n.1A, p.158-192, 2009.).

Simarouba amara Aubl. é uma árvore tropical de médio porte (cerca de 35 m), fanerófita, útil no processo de recuperação de áreas degradadas, encontrada nas Américas Central e do Sul, bem como nas ilhas do Caribe (LORENZI, 2002LORENZI, H. Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas nativas do Brasil. 5.ed. Nova Odessa: Plantarum, 2002. 324p.; DECLERCQ, 2004DECLERCQ, J. Suspected wood poisoning caused by Simarouba amara (marupá/caixeta) shavings in two dogs with erosive stomatitis and dermatitis. Veterinary Dermatology, v.15, p.188-193, 2004.; NERI et al., 2011NERI, V. A.; SOARES, M. P.; MEIRA NETO, J. A. A.; DIAS, L. E. Espécies de cerrado com potencial para recuperação de areas degradadas por mineração de ouro, Paracatu-MG. Revista Árvore, v.35, n.4, p.907-918, 2011.). No Brasil, está presente na Amazônia e nos Estados do Maranhão, Ceará, de Pernambuco (LOUREIRO et al., 1979LOUREIRO, A. A.; SILVA, M. F.; ALENCAR, J. C. Essências madeireiras da Amazônia. Manaus: INPA, 1979. 432p.), da Bahia, do Espírito Santo e Rio de Janeiro (LORENZI, 2002LORENZI, H. Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas nativas do Brasil. 5.ed. Nova Odessa: Plantarum, 2002. 324p.; PIRANI; THOMAS, 2013PIRANI, J. R.; THOMAS, W. W. Simaroubaceae in Lista de Espécies da Flora do Brasil. Jardim Botânico do Rio de Janeiro. Disponível em: <http://floradobrasil.jbrj.gov.br/jabot/floradobrasil/FB1381>. Acesso em: 11 dez. 2013.
http://floradobrasil.jbrj.gov.br/jabot/f...
). Na medicina tradicional brasileira, é utilizada no tratamento de anemia, febre, diarreia, disenteria, parasitas intestinais e dispepsia (LORENZI; MATOS, 2002LORENZI, H. Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas nativas do Brasil. 5.ed. Nova Odessa: Plantarum, 2002. 324p.; AMARAL et al., 2006AMARAL, F. M. M.; RIBEIRO, M. N. S.; BARBOSA-FILHO, J. M.; REIS, A. S.; NASCIMENTO, F. R. F.; MACEDO, R. O. Plants and chemical constituints with giardicidal activity. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.16, p.696-720, 2006.; SCOLES et al., 2006SCOLES, R. Sabiduria popular y plantas medicinales: elejemplo de lacomunidad negra de Itacoã, Acará, Pará. Boletim do Museu. Pararanaense Emílio Goeldi. Ciências Naturais, v.1, n.2, p.79-102, 2006.; RIBEIRO et al., 2007RIBEIRO, A. S. S.; PALHA, M. D. C.; TOURINHO, M. M.; WHITEMAN, C. W.; SILVA, A. S. L. Utilização de recursos naturais por comunidades humanas do parque ecoturístico do Guamá, Belém, Pará. Acta Amazonica, v.37, n.2, p.235-240, 2007.; SILVA; FRANCO, 2010SILVA, J. M.; FRANCO, E. S. Florística de espécies arbórea-arbustivas do sub-bosque com potencial fitoterápico em fragmento florestal urbano no município de Camaragibe, Pernambuco, Brasil. Caminhos da Geografia, v.11, n.35, p.179-194, 2010.). Quanto à constituição química, investigações prévias resultaram no isolamento de alcaloides (LASSAK et al., 1977LASSAK, E. V.; POLONSKY, J.; JACQUEMIN, H. 5-Hydroxiy-canthin-6-one from Simarouba amara. Phytochemistry, v.16, p.1126-1127, 1977.), quassinoides, triterpenos (POLONSKY et al., 1976POLONSKY, J.; VARON, Z.; JACQUEMIN, H.; PETTIT, G. R. The isolation and structure of 13,18-dehydroglaucarubinone a new antineoplastic quassinoid from Simarouba amara. Experientia, v.34, n.9, p.1122-1123, 1978.; GROSVENOR et al., 2006GROSVENOR, N. J.; MASCOLL, K.; MCLEAN, S.; REYNOLDS, W. F.; TINTO, W. F. Tirucallane, apotirucallane, and octanorapotirucallane triterpenes of Simarouba amara. Journal National Production, v. 69, n.6, p. 1315-1318, 2006.) e polifenóis (GOVINDARAJU et al., 2009GOVINDARAJU, K.; DARUKESHWARA, J.; SRIVASTAVA, A. K. Studies on protein characteristics and toxic constituents of Simarouba glauca oilseed meal. Food and Chemical Toxicology, v.47, n.6, p.1327-1332, 2009.).

Apesar de S. amara apresentar várias atividades farmacológicas já comprovadas, ser extensamente utilizada pela medicina popular do Brasil, ter feito parte da primeira e segunda edições da Farmacopeia Brasileira e constituir notável potencial para pesquisas científicas, ainda não foram desenvolvidos e validados procedimentos analíticos para seu controle de qualidade. A importância do preenchimento dessa lacuna é reforçada pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), por meio da Resolução nº 26/2014, que normatiza o registro de fitoterápicos no Brasil e exige que o controle de qualidade seja realizado em todas as etapas de processamento da droga vegetal, incluindo a análise da matéria-prima (BRASIL, 2014BRASIL, Resolução RDC 26 - Dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos e o registro e a notificação de produtos tradicionais fitoterápicos . ANVISA, Diário Oficial [da] República Federativa do Brasil. Brasília, DF, maio. 2014.).

Nesse contexto, destacam-se as metodologias espectrofotométricas pelo Ultravioleta-Visível, as quais são de baixo custo, fáceis de realizar, rápidas e aplicáveis ao uso de rotina laboratorial (FERNANDES et al., 2012FERNANDES, A. J.; FERREIRA, M. R.; RANDAU, K. P.; SOUZA, T. P.; SOARES, L. A. Total flavonoids content in the raw material and aqueous extractives from Bauhinia monandra Kurz (Caesalpiniaceae). The Scientific World Journal, v.2012, p.1-7, 2012.; MARQUES et al., 2013MARQUES, G. S.; LEÃO, W. F.; LYRA, M. A. M.; PEIXOTO, M. S.; MONTEIRO, R. P. M.; ROLIM, L. A.; XAVIER, H. S.; NETO, P. J. R.; SOARES, L. A. L. Comparative evaluation of UV/VIS and HPLC analyticalmethodologies applied for quantification of flavonoids from leaves of Bauhinia forficata. Revista Brasileira Farmacognosia, v.23, n.1, p.51-57, 2013.). Os metabólitos secundários escolhidos para serem determinados em S. amara foram os taninos, visto que esta classe de compostos é abundante e representativa na referida espécie, conforme verificado em triagem fitoquímica preliminar. Para sua quantificação, o método de Folin-Ciocalteu é amplamente empregado (FOLIN; CIOCALTEU, 1927FOLIN, O.; CIOCALTEU, V. On tyrosine and tryptophan determination proteins. The Journal of Biological Chemistry, v.73, n.2, p.627, 650, 1927.; MONTEIRO et al., 2005MONTEIRO, J. M. M.; NETO, E. M. F. L.; AMORIM, E. L. C.; STRATTMANN, R. R.; ARAÚJO, E. L.; ALBUQUERQUE, U. P. Teor de taninos em três espécies medicinais arbóreas simpátricas da caatinga. Revista Árvore, v.29, n.6, p.999-1005, 2005.; GALLICE et al., 2011GALLICE, W. C.; MESSERSCHIMIDT, I.; PERALTA-ZAMORA, P. Caracterização espectroscópica multivariada do potencial antioxidante de vinhos. Quimica Nova, v.34, n.3, p.397-403, 2011.). Ele se baseia na redução dos ácidos fosfotúngstico (H3PW12O40) e fosfomolíbdico (H3PMo12O40), presentes no reagente, pelos compostos fenólicos presentes na amostra na forma de óxido de tungstênio (W8O23) e óxido de molibdênio (Mo8O23) em meio alcalino. Os óxidos formados apresentam coloração azulada, sendo possível a quantificação da absorvância da solução na região do visível (760 nm). Visto que esse método tem sido considerado eficiente para quantificação de substâncias em várias espécies arbóreas (LOPEZ et al., 2005LOPEZ, C. G.; SANCHES, C. C. A.; NAKAMURA, C. V. Influence of extracts of Stryphnodendron polyphyllum Marth and Stryphnodendron obovatum Benth. On the cicatrization of cutaneous wounds in rats. Journal of Etnopharmacology, v.99, n.2, p.265-272, 2005.; MONTEIRO et al., 2005MONTEIRO, J. M. M.; NETO, E. M. F. L.; AMORIM, E. L. C.; STRATTMANN, R. R.; ARAÚJO, E. L.; ALBUQUERQUE, U. P. Teor de taninos em três espécies medicinais arbóreas simpátricas da caatinga. Revista Árvore, v.29, n.6, p.999-1005, 2005.), optou-se por sua escolha para determinar os taninos totais na casca do caule da matéria-prima vegetal.

Diante do exposto, este trabalho objetivou desenvolver e validar uma metodologia espectrofotométrica na faixa visível para determinação de taninos totais na casca do caule de S. amara, através do método de Folin-Ciocalteu, a qual possa contribuir para o seu controle de qualidade.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. Material Vegetal

As cascas do caule de S. amara Aubl. foram coletadas na Estação Experimental de Silvicultura Tropical (EEST) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), situada na BR-174, km 43, Município de Manaus, Amazonas. A exsicata foi depositada no herbário do INPA, sob o número 181.975. Após a coleta, o material vegetal foi submetido à secagem à temperatura ambiente e, em seguida, pulverizado em triturador industrial.

2.2. Reagentes e Substância de Referência

Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico: água destilada, reagente Folin-Ciocalteu (Dinâmica®), carbonato de sódio anidro (Synth®), pó de pele, polivinilpirrolidona (Basf®) e caseína (Merck®). Pirogalol (Fluka®, Pureza e" 98,0 %) foi utilizado como padrão.

2.3. Determinação Espectrofotométrica de Taninos Totais na Casca de Simarouba amara

2.3.1 Preparo da Solução Extrativa

1,5000 g da droga vegetal foram pesados e transferidos para balão com boca esmerilhada de 250 mL (Falta pedaço de texto). Adicionaram-se 150 mL de água destilada, que foram levados para aquecimento em banho-maria, sob refluxo, por 30 min, a 60 ºC. Em seguida, o balão foi resfriado em água corrente e a solução, transferida para balão volumétrico de 250 mL, com subsequentes lavagens até a remoção total do conteúdo de droga vegetal. Completou-se o volume com água destilada e, após a decantação, o sobrenadante foi filtrado em papel-filtro. Os primeiros 50 mL foram desprezados.

2.3.2. Preparo da Solução para Determinação de Polifenois Totais

Em balão volumétrico de 25 mL, foram adicionados 4,0 mL da solução extrativa, 3,0 mL do reagente Folin-Ciocaulteu e 10,0 mL de água destilada. O volume final foi completado com a solução de carbonato de sódio (Na2CO3) a 10,75% (m/v). Após 30 min, a absorvância foi mensurada em um comprimento de onda de 760 nm, em espectrofotômetro (EVOLUTION 60S, Thermo Fischer Scientific®), utilizando água destilada como solução de compensação. Todas as operações foram protegidas da luz.

2.3.3 Preparo da Solução para Polifenóis Não Adsorvidos por Pó de Pele

Em erlenmeyer de 125 mL foram adicionados 10,0 mL da solução extrativa e 150,0 mg de pó de pele, os quais foram submetidos à agitação mecânica por 60 min e, em seguida, filtrados em papel-filtro. Alíquota de 4,0 mL foi retirada do filtrado e transferida, volumetricamente, para balão volumétrico de 25 mL. Em seguida, foram adicionados 10,0 mL de água destilada, 3,0 mL do reagente Folin-Ciocalteu, sendo o volume completado com solução de carbonato de sódio (Na2CO3) a 10,75% (m/v). Após 30 min, a absorvância foi lida em um comprimento de onda de 760 nm, utilizando-se água destilada como solução de compensação. Todas as operações foram protegidas da luz.

2.3.4. Preparo da Solução-Padrão de Pirogalol

Pirogalol foi escolhido como padrão por já ser utilizado para quantificação de taninos na Farmacopeia Brasileira - 5a edição (ANVISA, 2010AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA - ANVISA. Farmacopeia Brasileira. 5.ed. São Paulo: Atheneu, 2010. 2v.). Foram pesados exatamente cerca de 50,00 mg de pirogalol e dissolvidos em balão volumétrico de 100 mL, com água destilada. Alíquota de 5,0 mL dessa solução foi volumetricamente transferida para balão volumétrico de 100 mL e o volume, completado com água destilada. Em balão volumétrico de 25 mL, foram transferidos 2,0 mL dessa solução, 3,0 mL do reagente Folin-Ciocalteu, 10,0 mL de água destilada e o volume, completado com solução de carbonato de sódio (Na2CO3) a 10,75% (m/v). A absorvância foi determinada em 760 nm após 30 min, utilizando-se água destilada como solução de compensação. Todas as operações foram protegidas da luz.

2.3.5. Cálculo do Teor de Taninos Totais

O teor de taninos totais foi determinado pela seguinte equação:

em que TT representa o teor de taninos totais; A1 e A2 consistem, respectivamente, na absorvância da amostra para polifenóis totais e na absorvância da amostra para polifenóis não adsorvidos em pó de pele; M1 é a massa da amostra utilizada no ensaio, em gramas, considerando-se a perda por dessecação; M2 é a massa de pirogalol, em gramas; e A3 é a absorvância da solução-padrão.

2.4. Desenvolvimento do Método

2.4.1. Quantidade de Droga e Volume do Reagente Folin-Ciocaulteu

Os efeitos da quantidade de droga (0,5000; 1,0000 e 1,5000 g) e volume do reagente Folin-Ciocalteu (1,0, 2,0 e 3,0 mL) sobre a resposta do método foram estudados através de um experimento fatorial do tipo 32 adicionado de dois pontos centrais (1,0000 g de droga e 2,0 mL de Folin). Cada ponto representou uma média de três determinações.

As variáveis independentes para o desenho experimental incluíram quantidade de droga e volume de reagente. A variável dependente estudada (resposta) foi a absorvância. Amatriz experimental está representada na Tabela 1, sendo a reposta estabelecida por um modelo de segunda ordem. A análise estatística do modelo foi realizada através do método dos mínimos quadrados e o modelo matemático obtido, usado para gerar superfícieresposta com o auxílio do programa computacional STATISTICA 6.0 (StatSoft, USA).

Tabela 1
Matriz do planejamento fatorial aplicada para avaliar a influência da quantidade de droga e volume do reagente Folin-Ciocaulteu na resposta do método (absorvância)

Table 1 - Matrix of factorial design applied to evaluate the influence of drug amount and Folin-Ciocaulteu reagent volume on the method response (absorbance).


2.4.2. Concentração de Carbonato de Sódio (Na2CO3)

Após a determinação da quantidade ideal de droga e do volume adequado do reagente, foi avaliada a concentração ótima de carbonato de sódio, comparandose soluções distintas de 10,75; 14; e 29%, m/v. A absorvância foi determinada e o teor de taninos totais, expresso como média de três determinações.

2.4.3. Agente Precipitante

Por fim, foi avaliado o melhor agente precipitante, cujo critério de escolha incluiu a maior absorvância, bem como a quantidade ideal do referido agente. Foram comparados: caseína (150,0, 250,0 e 350,0 mg), polivinilpirrolidona (50,00 100,0 e 200,0 mg) e pó de pele (50,00 100,0 e 150,0 mg). A absorvância foi determinada e o teor de taninos totais, expresso como média de três determinações.

2.5. Validação

Os parâmetros de validação foram analisados de acordo com os requisitos preconizados pelo Guia para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos, disponível na RE 899 (BRASIL, 2003BRASIL, Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Resolução RE N°899, de 29 de Maio de 2003. Diário Oficial [da] República Federativa do Brasil, Brasília, DF, 02 jun. 2003.), e pelo International Conference on the Harmonization of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH, 2005ICH. International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use. In: Q2B(R1): Guideline on validation of analytical procedure- methodology. Brussels: ICH Steering Committee, 2005.). Todos os ensaios de validação foram realizados nas condições espectrofotométricas estabelecidas após o estudo de desenvolvimento.

Os resultados foram apresentados como média ± erro-padrão da média. Também, foram utilizados análise de variância (ANOVA) e teste t, de Student, quando pertinentes, com o auxílio do software Excel (Microsoft Corporation, USA). O limite de significância foi considerado como 5% (p < 0,05).

2.5.1. Linearidade da Amostra e do Padrão

A linearidade da amostra e do padrão foi avaliada através da análise de regressão linear pelo método dos mínimos quadrados, a partir de três curvas de calibração autênticas, usando-se cinco concentrações. Os resultados permitiram definir o coeficiente de determinação (mínimo aceitável R2 = 0,99), o desvio-padrão relativo (DPR) e a equação de regressão. Também foram efetuados testes de falta de ajuste do modelo linear e significância da regressão (PIMENTEL; BARROS, 1996PIMENTEL, M. F.; BARROS, N. B. Calibração: uma revisão para químicos analíticos. Quimica Nova, v.19, n.3, p.268-277, 1996.).

As faixas de concentração utilizadas para o pirogalol e para a amostra foram, respectivamente, de 1 a 5 μg/ mL e de 6 a 30 μg/mL.

2.5.2. Limites de Detecção e de Quantificação

Os limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) foram estimados (em μg/mL) considerando o desvio-padrão (DP) com relação à absorvância da menor concentração e ao coeficiente angular (inclinação da reta - IC), obtidos pela linearidade do padrão e da amostra (equações 2 e 3).

2.5.3. Especificidade

A especificidade foi avaliada pelo método de adição de padrão, no qual foi adicionado 1,0 mL de pirogalol (1μg/mL) em cada uma das cinco concentrações utilizadas no teste de linearidade. O método foi considerado específico quando os coeficientes angulares das equações da reta de linearidade e especificidade foram considerados semelhantes (BLAINSKI et al., 2013BLAINSKI, A.; LOPES, G. C.; MELLO, J. C. P. Application and analysis of the Folin-Ciocaulteu method for the determination of the total phenolic content from Limonium brasiliense L. Molecules, v.18, p.6852-6864, 2013.).

2.5.4. Precisão

A precisão da metodologia espectrofotométrica foi avaliada nos níveis de repetibilidade e precisão intermediária. A repetibilidade foi definida pela análise de seis amostras individuais da solução extrativa a 100% de sua concentração (18 μg/mL). A precisão intermediária foi avaliada em triplicata, em dois dias consecutivos, por dois analistas diferentes. A repetibilidade foi expressa através do desvio-padrão relativo (DPR) e a precisão intermediária, avaliada através de ANOVA, além do DPR (RIBANI et al., 2004RIBANI, M.; BOTTOLI, C. B. G.; COLLINS, C. H.; JARDIM, I. C. S. F.; MELO, L. F. C. Validação em métodos cromatográficos e eletroforéticos. Quimica Nova, v.27, n.5, p.771-780, 2004.).

2.5.5. Exatidão

A recuperação foi calculada pela adição de quantidades conhecidas e crescentes da solução-padrão de pirogalol (1 a 3 μg/mL), em amostras na concentração de análise de 100%. Os testes foram realizados em triplicata para cada nível de concentração, com ensaios realizados em triplicata, sendo calculado o percentual de recuperação. O método foi considerado exato quando o percentual de recuperação atingiu a faixa entre 85 e 115% (BRASIL, 2003BRASIL, Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Resolução RE N°899, de 29 de Maio de 2003. Diário Oficial [da] República Federativa do Brasil, Brasília, DF, 02 jun. 2003.; BLAINSKI et al., 2013BLAINSKI, A.; LOPES, G. C.; MELLO, J. C. P. Application and analysis of the Folin-Ciocaulteu method for the determination of the total phenolic content from Limonium brasiliense L. Molecules, v.18, p.6852-6864, 2013.).

2.5.6. Robustez

A robustez do método foi determinada através de variações na luminosidade (presença ou ausência de luz) e no comprimento de onda (758, 760 e 762 nm). As análises foram realizadas em triplicata, utilizando-se a solução extrativa a 100% de sua concentração. A análise dos resultados foi feita através de ANOVA One-Way.

3. RESULTADOS

3.1. Desenvolvimento do Método

3.1.1. Quantidade de Droga e Volume do Reagente Folin-Ciocaulteu

Os resultados do desempenho do método com diferentes quantidades de droga e, ou, volume de reagente Folin-Ciocalteu encontram-se na Tabela 1. Os dados experimentais foram usados para gerar modelos de segunda ordem para cada variável dependente. Visto que o teste de falta de ajuste não foi significante e as variações experimentais puderam ser atribuídas apenas ao erro aleatório. Diante disso, os modelos ajustados demonstraram aproximação adequada dos valores reais e propiciaram a construção do gráfico superfície-resposta. A análise desse gráfico evidenciou que há influência de ambas as variáveis analisadas: com o aumento do volume do reagente Folin-Ciocalteu, verificou-se aumento na resposta do método, mas esse aumento é muito mais pronunciado quando se eleva a quantidade de droga (Figura 1).

Figura 1
Superfície de resposta obtida através da análise fatorial em valores de absorvância (UA).

Figure 1 – Response surface obtained by factorial analysis in absorbance values (AU).


AANOVA foi significativa para ambas as variáveis, quantidade de droga e volume de reagente, demonstrando que sua variação influencia significativamente a resposta estudada. O gráfico de Pareto, construído a partir do teste t, de Student, revelou importância estatística para os termos lineares de ambas as variáveis independentes, principalmente quantidade de droga. Entre os termos quadráticos, apenas a quantidade de droga foi estatisticamente significativa (Figura 2).

Figura 2
Gráfico de Pareto para as variáveis: quantidade de droga e volume de Folin-Ciocalteu. L = termo linear; Q = termo quadrático; e 1Lby2L = interação volume de Folin x quantidade de droga.

Figure 2 – Pareto graph for the variables: drug amount and Folin-Ciocalteu volume. L = linear term; Q = quadratic term; and 1Lby2L= interaction Folin volume x drug amount.


3.1.2. Concentração de Carbonato de Sódio (Na2CO3) e Agente Precipitante

A mudança nas concentrações de carbonato de sódio levou em consideração dados da literatura: 7,5% (BLAINSKI et al., 2013BLAINSKI, A.; LOPES, G. C.; MELLO, J. C. P. Application and analysis of the Folin-Ciocaulteu method for the determination of the total phenolic content from Limonium brasiliense L. Molecules, v.18, p.6852-6864, 2013.), 10,75% (GLASL, 1983GLASL, H. Zur Photometrie in der drogenstandardisierung. 3. Gehaltsbestimmung von gerbstoffdrogen. Deutscher Apotheker Zeitung,v.123, p.1979-1983, 1983.) e 14% (EUROPE COUNCIL, 2007EUROPE COUNCIL. Determination of tannins in herbal drugs. In: European Pharmacopoeia. 6.ed. Strasbourg: European Directorate for the Quality of Medicines, 2007. p.A286.). A avaliação das três concentrações distintas de carbonato de sódio não revelou nenhuma diferença estatisticamente significativa entre as variações estabelecidas. No que se refere ao agente precipitante, o pó de pele demonstrou melhores resultados para determinação do teor de taninos totais quando comparado com os demais. Além disso, aumento na sua quantidade resultou em incremento da resposta ao método.

3.2. Validação

3.2.1. Linearidade e Limites de Detecção (LD) e Quantificação (LQ)

As curvas de calibração do padrão e taninos totais nas cascas de S. amara por espectrofotometria apresentaram linearidade dentro do intervalo de 80 a 120%, na faixa de concentração estabelecida e no comprimento de onda de 760 nm (Tabela 2). A análise de regressão linear indicou coeficientes de determinação de 0,9992 e 0,9982, respectivamente, para a curva-padrão e de taninos, valores que comprovam que mais de 99% da variabilidade experimental pode ser explicada pelos modelos lineares e que há adequação do método no que concerne à relação entre as concentrações do analito e as respostas espectrofotométricas.

Tabela 2
Curvas de calibração do padrão (pirogalol) e extrato da casca do caule de Simarouba amara

Table 2 – Calibration curves of the standard (pyrogallol) and stem bark extract of Simarouba amara.


Os limites de detecção e quantificação, também descritos na Tabela 2, foram determinados utilizandose o desvio-padrão médio do primeiro ponto da curva de calibração do pirogalol (equações 2 e 3).

3.2.2. Especificidade

A especificidade de métodos espectrofotométricos para matrizes complexas, como matérias-primas vegetais, é de fundamental importância para garantir confiabilidade na quantificação de metabólitos secundários (LANDIN et al., 2012LANDIN, L. P.; FEITOZA, G. S.; COSTA. J. G. M. Development and validation of a HPLC method for the quantification of three flavonoids in a crude extract of Dimorphandra gardneriana. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.23, n.1, p.58-64, 2012.). No caso de matrizes complexas, se a matriz sem o analito não está disponível, os efeitos do sistema matricial podem ser analisados, comparando-se os coeficientes angulares das curvas de linearidade e especificidade. Se as curvas forem paralelas, o método pode ser considerado específico (BLAINSKI et al., 2013BLAINSKI, A.; LOPES, G. C.; MELLO, J. C. P. Application and analysis of the Folin-Ciocaulteu method for the determination of the total phenolic content from Limonium brasiliense L. Molecules, v.18, p.6852-6864, 2013.). A especificidade do método para a solução extrativa foi confirmada, uma vez que os coeficientes angulares das equações lineares foram muito próximos (Figura 3).

Figura 3
Curvas de linearidade e especificidade da solução extrativa de Simarouba amara.

Figure 3 – Linearity and specificity curves of extractive solution of Simarouba amara.


3.2.3. Precisão

Os resultados evidenciaram que, em relação à repetibilidade, o método corrobora os parâmetros exigidos pela legislação vigente, apresentando desviopadrão relativo (DPR) inferior a 5%.

Quanto à precisão intermediária, além do DPR inferior a 5%, a análise estatística demonstrou que o F calculado (3,45) foi menor do que o F tabelado (4,07), o que comprova que não há diferença estatisticamente significativa entre as amostras analisadas em dias distintos por diferentes analistas, no nível de 95% de confiança.

3.2.4. Exatidão

Para as concentrações baixa, média e alta, os resultados evidenciaram percentuais de recuperação iguais a 92,01; 102,21; e 109,33%, respectivamente. Esses percentuais encontram-se dentro da faixa de 85-115%, preconizada pela legislação vigente (BRASIL, 2003BRASIL, Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Resolução RE N°899, de 29 de Maio de 2003. Diário Oficial [da] República Federativa do Brasil, Brasília, DF, 02 jun. 2003.). O DPR foi inferior a 5% em todos os níveis de concentração avaliados, o que demonstra a exatidão do método e a confiabilidade dos resultados.

3.2.5. Robustez

Para avaliação da robustez do método, foram realizadas pequenas e deliberadas variações nos parâmetros de presença/ausência de luz e comprimento de onda. Aluminosidade foi estudada quanto à proteção ou não das amostras contra a luz, desde a adição do reagente Folin-Ciocalteu até o momento de leitura no espectrofotômetro. Já o comprimento de onda foi avaliado nos níveis de 758, 760 e 762 nm. Todos os resultados apresentaram coeficiente de variação inferior a 5%, corroborando a RE 899, e não exibiram diferença estatisticamente significativa entre si, no teste t, de Student, pois o F calculado foi menor que o F tabelado, tanto para a variável luminosidade (F calculado = 2,57; F tabelado = 7,729) quanto para a variável comprimento de onda (F calculado = 0,386; F tabelado = 5,143). Esses resultados confirmam a robustez do método.

4. DISCUSSÃO

No desenvolvimento do método, tanto o gráfico de superfície-resposta, construído a partir da análise fatorial para as variáveis volume do reagente e quantidade de droga vegetal, quanto os ensaios que compararam diferentes concentrações de carbonato de sódio e quantidades distintas de pó de pele permitiram estabelecer parâmetros através dos quais foram alcançadas as condições ótimas para determinação espectrofotométrica de taninos totais em S. amara, pelo método de Folin-Ciocalteu. Esses valores incluíram: 1,5000 g de droga vegetal; 3,0 mL do reagente Folin-Ciocalteu; carbonato de sódio 10,75% e 150,0 mg de pó de pele.

A validação, exigida pela RDC nº 14 (BRASIL, 2010BRASIL, Resolução RDC 26 - Dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos e o registro e a notificação de produtos tradicionais fitoterápicos . ANVISA, Diário Oficial [da] República Federativa do Brasil. Brasília, DF, maio. 2014.) e regulamentada pela RE 899, contribuiu para identificar e controlar fatores de variação, estabelecer limites de aceitação do erro analítico e assegurar a confiabilidade dos resultados (BRASIL, 2003BRASIL, Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Resolução RE N°899, de 29 de Maio de 2003. Diário Oficial [da] República Federativa do Brasil, Brasília, DF, 02 jun. 2003.).

Os resultados obtidos a partir da linearidade demonstraram que a variável dependente (absorvância) é diretamente proporcional à variável independente (concentração do analito) dentro do intervalo estudado e que a equação matemática obtida expressa adequadamente essa relação. Além disso, os valores expressos na Tabela 1 revelaram que a metodologia espectrofotométrica foi sensível para a determinação de taninos na solução extrativa da casca do caule de S.amara, sem sofrer alterações intrínsecas do equipamento.

A especificidade de um método consiste na sua capacidade de distinguir o analito na presença de outros componentes da matriz, os quais podem incluir impurezas, produtos de degradação, entre outros (ICH, 2005ICH. International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use. In: Q2B(R1): Guideline on validation of analytical procedure- methodology. Brussels: ICH Steering Committee, 2005.). O paralelismo das retas confirmou que, nas condições experimentais, foi possível quantificar especificamente o padrão pirogalol, assim como os taninos presentes na solução extrativa, mesmo na presença de outros compostos ou impurezas.

A precisão é considerada uma das análises mais representativas, visto que revela o efeito das variações relacionadas aos dias, analistas ou equipamentos distintos, implicando garantia da reprodutibilidade do método (BUENO, 2012BUENO, F. G.; MACHARETH, M. A. D.; PANIZZON, G. P.; LOPES, G. C.; MELLO, J. C. P.; LEITE-MELLO, E. V. S. Development of a uv/vis spectrophotometric method for analysis of total polyphenols from Caesalpinia peltophoroides Benth. Quimica Nova, v.35, n.4, p.822-826, 2012.). Aexatidão, por sua vez, reflete a proximidade dos resultados obtidos por uma metodologia analítica em relação aos valores verdadeiros (BRASIL, 2003BRASIL, Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Resolução RE N°899, de 29 de Maio de 2003. Diário Oficial [da] República Federativa do Brasil, Brasília, DF, 02 jun. 2003.). Procedimentos exatos devem estar livres de interferências, como condições extrativas e reagentes semelhantes, e as respostas da metodologia devem estar relacionadas com a concentração do analito (ARAÚJO et al., 2013ARAÚJO, L; B. D. C.; SILVA, S. L.; GALVÃO, M. A. M.; FERREIRA, M. R. A.; ARAÚJO, E. L.; RANDAU, K. P.; SOARES, L. A. L. Total phytosterol content in drug materials and extracts from roots of Acanthospermum hispidum by UV-VIS spectrophotometry. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.23, n.5, p.736-742, 2013.). Os resultados expressos em ambos os ensaios demonstraram que o método é preciso e exato, o que contribui para a garantia da sua confiabilidade.

O estudo da robustez, definida como a capacidade do método em resistir a pequenas e deliberadas variações de parâmetros analíticos, sem perder sua exatidão e precisão (ICH, 1995ICH. International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use. In: Q2B(R1): Guideline on validation of analytical procedure- methodology. Brussels: ICH Steering Committee, 2005.), permitiu verificar que a metodologia proposta não sofreu interferências significativas diante de pequenas variações na concentração de carbonato de sódio, presença de luz e comprimento de onda, contribuindo para fornecer indicação de confiança no processo durante seu desenvolvimento usual.

5. CONCLUSÃO

A quantificação de metabólitos secundários exerce importante papel no controle de qualidade da matériaprima vegetal. Nesse contexto, uma metodologia espectrofotométrica na faixa do visível para determinação de taninos totais na casca do caule de S. amara foi adequadamente desenvolvida e validada. O método proposto foi linear, específico, exato, preciso e robusto, sob as condições estudadas, e destacou-se pela facilidade de execução (desde o preparo até a leitura das amostras) e baixo custo, estando em conformidade com os requisitos para o uso analítico e para garantir a confiabilidade dos resultados.

6.AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (475216/2011-3; 483870/2011; 0480128/2012-0; 302113/2012-6); e FACEPE (APQ-12964.03/12), pelo suporte financeiro.

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    Jan-Feb 2015

Histórico

  • Recebido
    26 Jun 2014
  • Aceito
    19 Nov 2014
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