Análise da contaminação fúngica em amostras de Cassia acutifolia Delile (sene) e Peumus boldus (Molina) Lyons (boldo-do-Chile) comercializadas na cidade de Campinas, Brasil

Analysis of the fungal contamination in Cassia acutifolia Delile (sene) and Peumus boldus (Molina) Lyons (boldo-do-Chile) sold in Campinas, Brazil

TRABALHOS ORIGINAIS

Análise da contaminação fúngica em amostras de Cassia acutifolia Delile (sene) e Peumus boldus (Molina) Lyons (boldo-do-Chile) comercializadas na cidade de Campinas, Brasil

Analysis of the fungal contamination in Cassia acutifolia Delile (sene) and Peumus boldus (Molina) Lyons (boldo-do-Chile) sold in Campinas, Brazil

Liliana de O. Rocha; Maria Magali S. R. Soares; Cristiana Leslie Corrêa

Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Pontifícia Universidade Católica de Campinas

^{Correspondência}

RESUMO

A sociedade atual tem buscado a fitoterapia como um importante recurso terapêutico, sendo a avaliação da qualidade microbiológica destes produtos um requisito essencial, considerando a sua origem. Deste modo, o objetivo da pesquisa foi realizar a contagem e a identificação de fungos filamentosos em 20 amostras de folhas de Cassia acutifolia Delile (sene) e de Peumus boldus (Molina) Lyons (boldo-do-Chile) comercializadas em farmácias de manipulação e mercados da cidade de Campinas, Brasil, usando as técnicas microbiológicas clássicas. Os resultados obtidos evidenciaram que 45% das amostras analisadas se situavam fora dos padrões estabelecidos pela Organização Mundial da Saúde (OMS). Não foram observadas diferenças significativas na análise quantitativa da contaminação fúngica entre amostras comercializadas em farmácias de manipulação e mercados, tanto para o boldo-do-Chile como para a sene. Os fungos identificados nestas amostras foram: Aspergillus, Penicillium, Phoma, Cladosporium, Trichoderma, Rhizopus, Mucor, Aureobasidium pullulans, Mycelia sterilia, Acremonium e Monilia sitophila. Estes resultados demonstraram o baixo nível de qualidade desses fitoterápicos, pois, além do elevado número de amostras contaminadas, foram identificados fungos de gêneros produtores de micotoxinas, como o Aspergillus e o Penicillium. Verifica-se a urgência na realização de adequado controle de qualidade microbiológico dos fitoterápicos e de implantação de fiscalização efetiva, para garantir a segurança e eficácia destes produtos.

Unitermos: Produtos fitoterápicos. Controle de qualidade microbiológico. Fungos. Cassia acutifolia. Peumus boldus.

ABSTRACT

The consumption of medicinal plants has increased during the last years. The purpose of this study was to evaluate and identify fungi specimens present in samples of Cassia acutifolia Delile (20) (sene) and Peumus boldus (Molina) Lyons (Boldo-do-Chile) (20), that were purchased in drugstores and markets of Campinas, Brazil, by usual methods. The results showed that 45% of samples did not fit the minimum quality standards recommended by the World Health Organization (WHO). No differences were observed in the quantitative analysis between the samples sold at the drugstores and at the markets. The identified genera and species of fungi were: Aspergillus, Penicillium, Phoma, Cladosporium, Trichoderma, Rhizopus, Mucor, Aureobasidium pullulans, Mycelia sterilia, Acremonium and Monilia sitophila. Considering the level of contamination and the presence of Aspergillus and Penicillium, which are able to produce mycotoxins, there is an urgent need for quality control of the phytotherapic products in order to assure their efficacy and safety.

UNITERMS: Medicinal plants. Quality control. Moulds. Cassia acutifolia Delile. Peumus boldus(Molina) Lyons.

INTRODUÇÃO

A sociedade atual tem buscado na natureza hábitos mais saudáveis de vida. Essa tendência, associada ao alto custo dos medicamentos, tem levado ao aumento progressivo da produção e utilização de medicamentos fitoterápicos e, conseqüentemente, à preocupação em relação a qualidade destes produtos, já que as contaminações, as falsificações e as adulterações são freqüentes (Araújo, Ohara, 2000; Brandão et al., 2001).

A prática da fitoterapia segura encontra uma série de dificuldades, que vão, desde a identificação correta do material botânico utilizado, à inexistência de estudos de segurança, eficácia e qualidade de grande parte das plantas. A qualidade implica controle e nele estão envolvidos experimentos nos quais se insere o controle microbiológico, cujo principal objetivo é analisar a contaminação por microrganismos, entre os quais se encontram os fungos filamentosos (Brandão et al., 1998; Bugno et al., 2002; Santos et al., 1995).

Como os fungos podem ser dispersos pelo ar atmosférico, pode ocorrer contaminação das plantas, antes e após sua colheita, como também durante o processamento. Entre os principais gêneros detectados no Brasil, destacam-se: Cladosporium, Fusarium, Aspergillus, Penicillium e Rhizopus. A presença destes fungos em fitoterápicos pode ser prejudicial à saúde humana, uma vez que estes podem causar micotoxicoses, quando introduzidos por via oral, ou outras doenças, quando inalados (Corrêa, 1998; Kneifel et al., 2001; Lacaz et al., 2002).

De acordo com a RDC n^o 48 de 16 de março de 2004, os medicamentos fitoterápicos devem ser registrados conforme as normas da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), sendo a pesquisa de contaminantes microbiológicos também contemplada nas recomendações da Organização Mundial da Saúde (OMS) (ANVISA, 2004; Garcia et al., [ entre 1993 e 2003] ; WHO, 1992).

Os objetivos deste trabalho foram: avaliar a presença, quantificar, isolar e identificar fungos filamentosos em amostras de folhas de sene e boldo-do-Chile obtidos de mercados e farmácias de manipulação na cidade de Campinas, visando contribuir para a melhoria do perfil de qualidade destes fitoterápicos.

MATERIAL E MÉTODOS

Amostragem

Foram adquiridas 20 amostras de folhas inteiras de Cassia acutifolia Delile (sene) e 20 de Peumus boldus (Molina) Lyons (boldo-do-Chile) nas suas embalagens originais, em farmácias de manipulação (n=10/espécie) e em mercados (n=10/espécie) da cidade de Campinas, São Paulo, Brasil.

Determinação quantitativa e identificação dos contaminantes fúngicos

Pesaram-se 10 g de cada amostra, que foi macerada em gral, previamente esterilizado. Posteriormente, esta foi diluída em 90 mL de tampão fosfato pH 7,0, e submetida aos processos de agitação e filtração em gaze. Em seguida, foram pipetados 10 mL do filtrado para erlenmeyer contendo 90 mL de tampão fosfato pH 7,0, realizando 3 diluições decimais sucessivas (Pinto et al., 2000; Santos et al.,1995).

Foram transferidos 0, 1mL de cada diluição para placas de Petri contendo meio de cultura Ágar Sabouraud Dextrose (ASD) (Merck KgaA, Alemanha). Incubaram-se as placas à temperatura de cerca de 25 ^oC, por 5 dias (Pinto et al.,2000; Santos et al.,1995). Após este período, realizou-se a contagem de colônias (UFC/g). Posteriormente, estas foram repicadas em tubos de ensaio contendo Ágar Sabouraud Dextrose(ASD) e incubadas a 25 °C, por 5 dias. Após o crescimento, os fungos foram identificados macro e microscopicamente, de acordo com técnicas clássicas de Microbiologia (Lacaz et al., 2002; Larone, 2002).

Análise estatística

Foi utilizado o teste t pareado para comparar a quantidade de amostras contaminadas nos mercados e nas farmácias de manipulação e a contaminação (quantitativa) encontrada nos fitoterápicos boldo-do-Chile e sene. O nível de significância adotado foi de 10% (p<0,10). Utilizou-se o programa Instat^® (GraphPad Software), versão 3.05.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Em fitoterápicos, o limite máximo permitido, pela Organização Mundial da Saúde, para a carga de fungos filamentosos é de 5x10² UFC/g (Santos et al.,1995).

De acordo com os resultados encontrados, 92,5% das amostras apresentaram contaminação fúngica, sendo que, 45% (18 amostras) apresentaram níveis acima do limite preconizado e 47,5% (19 amostras) mostraram-se dentro do limite (Tabela I).

Observou-se elevado número de amostras de fitoterápicos contaminadas tanto em farmácias de manipulação como nos mercados municipais. Em relação às folhas de sene, a contaminação foi maior nas amostras provenientes de farmácias de manipulação (50%) e, para o boldo-do-Chile, o crescimento fúngico foi maior nas amostras comercializadas em mercados (60%) (Tabela I). Em adição, nas amostras de sene e boldo-do-Chile provenientes de mercados, os níveis de contaminação variaram de 1,0x10¹ UFC/g a 7,37x10³ UFC/g (Tabela II) e de 5,0x10¹ UFC/g a 1,9x10³ UFC/g (Tabela III), respectivamente. A carga fúngica para amostras de sene obtidas de farmácias de manipulação variaram de 1,1x10² UFC/g a 6,2x10⁴ UFC/g e para boldo-do-Chile variaram de 1,0x10¹ UFC/g a 5,0x10³ UFC/g (Tabelas II e III). Alguns bolores encontrados nestas amostras apresentam-se, comumente, dispersos no ar (Kneifel et al., 2001), desempenhando papel importante na etiologia das alergias respiratórias e intoxicações por micotoxinas, como a aflatoxina produzida pelo gênero Aspergillus (Corrêa, 1998; Lacaz et al., 2002).

Os resultados referentes às 10 amostras de folhas de sene provenientes de mercados, demonstraram que 30% estavam acima do limite máximo (Santos et al., 1995). Na análise realizada, foram encontrados fungos dos gêneros: Rhizopus, Aureobasidium, Mucor e Mycelia (Tabelas I e II, Figura 1). Nas amostras de sene obtidas de farmácias de manipulação, foram detectados fungos dos gêneros Rhizopus, Aspergillus e Penicillium e as espécies Aureobasidium pullulans, Mycelia sterilia e Monilia sitophila (Tabelas I e II, Figura 2).

Dentre as amostras de boldo-do-Chile, provenientes de mercados, 60% apresentaram contaminação acima do limite permitido pela OMS (WHO, 1992), sendo identificados os contaminantes dos gêneros: Mucor, Penicillium, Cladosporium, Phoma, Acremonium e Aspergillus, e as espécies: Aureobasidium pullulans e Mycelia sterilia (Tabelas I e III, Figura 3). No entanto, a partir das amostras obtidas de farmácias de manipulação, verificou-se que 40% apresentaram contaminação acima do preconizado, tendo-se isolado: Rhizopus, Aspergillus, Mycelia sterilia, Aureobasidium pullulans, Penicillium, e Trichoderma (Tabelas I e III, Figura 4).

Para as duas espécies vegetais, verificou-se que 12 (60%) amostras de sene e 10 (50%) de boldo-do-Chile apresentaram carga fúngica inferior a 5x10² UFC/g (Tabelas II e III).

Considerando o parâmetro da OMS (5,0x10² UFC/g), pode-se dizer que 8 amostras de sene (40%) estão acima do mesmo, sendo que 5 (25%) adquiridas em farmácias de manipulação e 10 (50%) amostras de boldo-do-Chile se encontram na mesma situação, sendo 6 (30%) provenientes de mercados (Tabelas II e III).

Em apenas uma amostra de sene o nível de contaminação foi superior a 10⁴ UFC/g, sendo que os gêneros e as espécies fúngicas encontradas nesta amostra foram: Monilia sitophila; Rhizopus e Aureobasidium pullulans.

Entretanto, de acordo com a análise estatística (Tabela I) verificou-se que não houve diferença significativa nos níveis de contaminação fúngica (análise quantitativa) entre os locais de aquisição de amostras (p>0,10), assim como entre as duas espécies vegetais estudadas (p>0,10).

Os fitoterápicos, de maneira geral, são suscetíveis à contaminação fúngica durante o processo de plantio e colheita. Além disso, a manipulação e o armazenamento inadequado destes produtos, que podem ocorrer tanto nas farmácias de manipulação como nas indústrias que produzem os fitoterápicos, podem ser fonte de contaminação secundária.

Os resultados demonstram o baixo nível de qualidade destes fitoterápicos, pois além do número considerável de amostras contaminadas (92,5%), foram identificados bolores, que podem produzir micotoxinas, destacando-se os gêneros Aspergillus (10% das amostras) e Penicillium (7,5% das amostras). Estes foram encontrados em folhas de sene provenientes de farmácias de manipulação e em folhas de boldo-do-Chile obtidas tanto de farmácias de manipulação como de mercados. É importante ressaltar que o boldo-do-Chile é um fitoterápico amplamente utilizado pela população e neste houve maior contaminação por fungos toxigênicos. Foram identificados os gêneros: Phoma, Cladosporium e Trichoderma, que também são capazes de produzir micotoxinas. Deste modo, a utilização desses fitoterápicos apresenta risco adicional ao consumidor, que pode estar ingerindo micotoxinas (Corrêa, 1998).

As micotoxinas podem ocasionar intoxicações agudas ou crônicas quando da ingestão de produtos contaminados por bolores, mesmo na forma de chá, pois são termoestáveis. É importante ressaltar que as aflatoxinas produzidas pelo gênero Aspergillus possuem elevado ponto de fusão (ao redor de 269 °C) e apresentam potencial carcinogênico (WHO, 1979). São classificadas, segundo o IARC (International Agency for Research on Cancer), no grupo 1, definido como carcinogênico para o homem (Abou-Arab et al.,1999; Araújo, Ohara, 2000; Corrêa, 1998; IARC, 1993).

Alguns bolores encontrados, neste estudo (espécies de Aspergillus e Penicillium), podem causar doenças, como alergias, além de problemas graves em imunossuprimidos. Também, representam risco para quem manipula tais fitoterápicos, tendo em vista a possível inalação durante o processo produtivo (Lacaz et al., 2002; Marques, 1998).

Os demais contaminantes fúngicos encontrados nas amostras são considerados, principalmente, contaminantes saprófitas; no entanto, também podem causar doenças, como o Rhizopus e o Mucor, mais preocupantes em indivíduos imunossuprimidos, e o Acremonium, que está associado a doenças como micetomas (Lacaz et al., 2002; Larone, 2002; Marques, 1998).

As publicações referentes à identificação e quantificação de fungos em fitoterápicos, no Brasil, são escassas. Santos et al. (1995) e Bugno et al. (2002), igualmente constataram contaminação por Aspergillus e Penicillium, entre outros, em chás para infusão, pós (guaraná), extrato fluido, comprimidos e cápsulas (Bugno et al., 2002; Santos et al., 1995). No entanto, mostram perfis semelhantes àqueles de outros países.

Em Portugal, Martins et al. (2001) verificaram a presença de fungos filamentosos, como: Aspergillus, Penicillium, Absidia, Mucor, Cladosporium e Paecilomyces, em 62 amostras de 7 diferentes fitoterápicos. Resultados semelhantes foram vistos por Abou-Arab et al. (1999), no Egito, e por Efuntoye (1996), na Nigéria.

Os objetivos e resultados deste estudo reforçam a necessidade do controle microbiológico de qualidade em fitoterápicos, em concordância com a legislação atual (ANVISA, 2004), que visa garantir a segurança, eficácia e qualidade destes medicamentos.

Recebido para publicação em 24 de agosto de 2004

Aceito para publicação em 24 de dezembro de 2004

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  29 Nov 2005
• Data do Fascículo
  Dez 2004

Histórico

• Recebido
  24 Ago 2004
• Aceito
  24 Dez 2004