Atividades antimicrobiana e leishmanicida das sementes de Pterodon emarginatus Vogel

Antimicrobial and leishmanicidal activities of seeds of Pterodon emarginatus

ARTIGO

Atividades antimicrobiana e leishmanicida das sementes de Pterodon emarginatus Vogel

Antimicrobial and leishmanicidal activities of seeds of Pterodon emarginatus

Rafael C. Dutra^I; Fernanda G. Braga^II; Elaine S. Coimbra^II; Adilson D. Silva^III; Nádia R. Barbosa^{I, *}

^IDepartamento de Alimentos e Toxicologia, Faculdade de Farmácia e Bioquímica, Universidade Federal de Juiz de Fora, Martelos, 36036-330 Juiz de Fora-MG, Brasil

^IIDepartamento de Parasitologia, Microbiologia e Imunologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Juiz de Fora, Martelos, 36036-330 Juiz de Fora-MG, Brasil

^IIIDepartamento de Química, Instituto de Ciências Exatas, Universidade Federal de Juiz de Fora, Martelos, 36036-330 Juiz de Fora-MG, Brasil

RESUMO

O presente trabalho investigou as atividades antimicrobiana e leishmanicida das sementes de Pterodon emarginatus Vogel. O potencial antimicrobiano do óleo essencial (OE) obtido das sementes foi avaliado através dos testes de difusão em ágar (10, 25 e 50 mg) e determinação da concentração inibitória mínima e utilizou os microorganismos-padrão: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Streptococcus mutans ATCC 25175, Pseudomonas aeruginosa ATCC 90271, Escherichia coli ATCC 10530 e Candida albicans ATCC 10231. A atividade leishmanicida do OE e frações (6,25 – 100 µg/mL) obtidas das sementes de P. emarginatus foram testadas, in vitro, sobre formas promastigotas de L. amazonensis e L. chagasi. O OE das sementes de P. emarginatus inibiu o crescimento somente de S. aureus (CIM = 2,5 mg/mL). As frações hexânica (IC₅₀ = 50,06 µg/mL) e butanólica (IC₅₀ = 46,65 µg/mL) apresentaram atividade frente às formas promastigotas de L. amazonensis, porém não apresentaram atividade frente a L. chagasi. Os resultados indicam que as moléculas bioativas presentes nas sementes de P. emarginatus podem ser utilizadas como protótipos para o desenvolvimento de fármacos e/ou como fonte de matérias-primas farmacêuticas.

Unitermos: Pterodon emarginatus, Leguminosae, atividade antibacteriana, leishmanicida.

ABSTRACT

The present work investigated the antimicrobial and leishmanicidal activities of seeds of Pterodon emarginatus. The tests of diffusion in agar (10, 25 and 50 mg) and determination of minimum inhibitory concentration (MIC) were performed using essential oil (EO) obtained from seeds using the standard microorganisms: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Streptococcus mutans ATCC 25175, Pseudomonas aeruginosa ATCC 90271, Escherichia coli ATCC 10530 and Candida albicans ATCC 10231. Leishmanicidal activity of the EO and fractions (6.25 – 100 µg/ml) obtained of seeds of P. emarginatus was evaluated in vitro using L. amazonensis and L. chagasi promastigote forms. The EO inhibited the growth of S. aureus (MIC = 2.5 mg/ml). The hexane (IC₅₀ = 50.06 µg/ ml) and butanol (IC₅₀ = 46.65 µg/ml) fractions showed activity against L. amazonensis promastigote forms, but did not against L. chagasi promastigote forms. The results indicate that the bioactive molecules present in the seeds of P. emarginatus can be used as prototype for the development of drug and/or as source pharmaceutical material.

Keywords: Pterodon emarginatus, Leguminosae, antibacterial activity, leishmanicidal.

INTRODUÇÃO

Um dos maiores problemas de Saúde Pública enfrentados nas últimas décadas foi o agravamento da resistência a antimicrobianos em cepas bacterianas, principalmente de origem hospitalar (Oliveira et al., 2006a,b; Coutinho et al., 2008). Atualmente, registra-se um aumento significativo na freqüência do isolamento de bactérias que eram reconhecidamente sensíveis aos fármacos de rotina usados na clínica, mas que se apresentam agora resistentes a quase todos os fármacos disponíveis no mercado, como ocorre com várias bactérias multirresistentes (Shiomori et al., 2002; Sakagami & Kajamura, 2006).

Neste contexto, as plantas representam fontes valiosas de produtos para a manutenção da saúde humana, sendo seu uso mais difundido especialmente nos últimos anos, após numerosos estudos com produtos terapêuticos oriundos de plantas medicinais. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), as plantas medicinais são as melhores fontes para se obter uma variedade de medicamentos, e cerca de 80% da população mundial usa a medicina tradicional na busca de alívio de alguma sintomatologia dolorosa ou desagradável (Nascimento et al., 2000; Caetano et al., 2002; Corrêa et al., 2008; Sousa et al., 2008). A seleção de plantas, a partir de informações da medicina tradicional ou popular, pode conduzir a descoberta de moléculas promissoras com ação terapêutica (Agra et al., 2007).

As leishmanioses são doenças endêmicas causadas por protozoários do gênero Leishmania, ocorrendo em várias partes do mundo sendo responsáveis por elevados índices de morbidade e mortalidade. Essa zoonose compreende formas clínicas variadas e pode, classicamente, ser dividida em dois grupos principais: Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) e Leishmaniose Visceral (LV). As manifestações clínicas são resultantes de complexas interações entre o parasito e a resposta imune do indivíduo infectado (Grevelink & Lerner, 1996; Herwaldt, 1999). No Brasil, a LTA e a LV ocorrem em todo o território nacional e são endêmicas nas regiões Norte e Nordeste, devido principalmente às características econômicas e culturais dessas populações, predominando nos estados da Bahia, Ceará, Piauí e Maranhão (Ministério da Saúde, 2000; Rath et al., 2003).

O tratamento das leishmanioses é feito à base de antimoniais pentavalentes (Sb⁺⁵), anfotericina B e pentamidinas (isotionato e mesilato), quimioterápicos de elevado custo, usados por via parenteral e por prolongado período de administração, causando efeitos adversos, como: alterações cardíacas, renais, pancreáticas e hepáticas (Croft & Yardley, 2002). Porém, desde a descoberta dos Sb⁺⁵, pouco tem sido feito para a descoberta de novos tipos estruturais para o tratamento dessa patologia. Entretanto, as dificuldades em relação à terapêutica atual têm conduzido a estudos com o objetivo de avaliar terapias alternativas, buscando, por exemplo, soluções na privilegiada biodiversidade brasileira, através da descoberta e desenvolvimento de novas moléculas com atividade terapêutica, ou no desenvolvimento de fitoterápicos nacionais para o tratamento das leishmanioses (Phillipson & Wright, 1991a,b; Rocha et al., 2005).

Pterodon emarginatus Vogel (Leguminosae), conhecida popularmente como sucupira branca ou faveiro é uma árvore aromática nativa que mede de 5-10 metros de altura (Lorenzi & Matos, 2002), facilmente encontrada na região do cerrado brasileiro e utilizada na medicina tradicional para o tratamento de reumatismo, dores de garganta, disfunções respiratórias (bronquites e amidalites), além das suas atividades antiinflamatória, analgésica, depurativa e tônica. As sementes são comercializadas em mercados populares por suas propriedades farmacológicas (Leite de Almeida & Gottlieb, 1975; Arriaga et al., 2000; Agra et al., 2008).

Estudos fitoquímicos do gênero Pterodon têm demonstrado a presença de alcalóides nas cascas das árvores (Torrenegra et al., 1989), isoflavonas e alguns triterpenos (Marques et al., 1998) na madeira, e diterpenos (Fascio et al., 1976; Arriaga et al., 2000) e isoflavonas no óleo das sementes (Braz-Filho & Gottlieb, 1971). O diterpeno 14,15-epoxigeranilgeraniol e alguns derivados, isolados de P. pubenscens têm sido associado com atividade protetora contra a penetração de cercárias de S. mansoni, parasito responsável pela esquistossomose, doença tipicamente tropical (Dos Santos Filho et al., 1972). Alguns destes constituintes químicos estão contidos em várias espécies vegetais com efeitos antibacterianos e leishmanicidas (Mathias & Emily, 1993).

Baseado nos usos populares e nos constituintes químicos presentes nas sementes de P. emarginatus que sugerem seu potencial farmacológico, este estudo teve por objetivo avaliar as atividades antimicrobiana e leishmanicida das sementes de P. emarginatus Vogel.

MATERIAL E MÉTODOS

Coleta do material vegetal

Sementes da espécie P. emarginatus foram coletadas em setembro de 2006, no município de Três Marias/MG-Brasil e identificadas pela Dra. Fátima Regina Gonçalves Salimena do Departamento de Botânica, UFJF, Brasil. Uma exsicata da espécie foi depositada no Herbário CESJ da Universidade Federal de Juiz de Fora/MG-Brasil sob o número 48.077.

Extração do óleo essencial

O óleo essencial foi extraído em aparelho de Clevenger pelo método de hidrodestilação durante quatro horas. Foram pesados 30 g de sementes, as quais foram trituradas e adicionadas ao balão contendo 300 mL de água destilada. Após a extração, o óleo foi acondicionado em frasco de vidro âmbar e utilizado imediatamente para a realização das análises.

Preparo das frações

Para o preparo das frações, 30 gramas de sementes foram trituradas e submetidas à extração utilizando aparelho de Soxhlet.Após o acondicionamento das sementes ao cartucho e adaptação do balão de fundo redondo, a amostra foi submetida a extrações sucessivas com hexano, butanol e metanol até atingir o esgotamento do solvente. As frações hexânica (FH), butanólica (FB) e metanólica (FM) foram submetidas a rotaevaporação até eliminação completa do solvente. Tais frações foram utilizadas para avaliação da atividade leishmanicida.

Atividade antimicrobiana

A atividade antimicrobiana foi realizada utilizando os microorganismos-padrão: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Streptococcus mutans ATCC 25175, Pseudomonas aeruginosa ATCC 90271, Escherichia coli ATCC10530 e Candida albicans ATCC 10231, obtidos da American Type of Culture Collection (ATCC). Para a realização desta atividade foram empregados o método de difusão em ágar (Mislivec et al., 1992; Swanson et al., 1992) e a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) (Candan et al., 2003).

Difusão em ágar

A atividade antimicrobiana foi realizada através do método de difusão em ágar estabelecido por Mislivec et al. (1992) e Swanson et al. (1992). Os microorganismos foram cultivados em meio inclinado anti-1 (S. aureus, S. mutans e E. coli), Tryptone Soy Agar (TSA) (P. aeruginosa)e Sabouraud Dextrose Agar (SDA) (C. albicans) por um período mínimo de 24 horas a temperatura de 37°C em estufa bacteriológica. Após este período, uma suspensão microbiana foi padronizada utilizando solução fisiológica estéril (NaCl 9,0 g/L) contendo 10³ -10⁴ UFC/mL. A suspensão foi diluída com solução fisiológica estéril até a obtenção de 25% de transmitância. As placas de Petri (dimensões: 15 mm de altura e 90 mm de diâmetro) foram preparadas com 22 mL de meio de cultura, resultando em um meio de cultura com 3 mm de profundidade. Cilindros (de aço inoxidável) estéreis (dimensões: 10 mm de altura e 6 mm de diâmetro) contendo 10, 25 e 50 mg do OE das sementes de P. emarginatus foram inseridos no meio de cultura. Todas as placas foram incubadas em ambiente aeróbico a temperatura de 37 °C por 24 horas (bactérias) e temperatura de 22 °C por 48 horas (fungo). A inibição do crescimento foi medida, com auxílio de paquímetro, pela formação de halos, expressos em mm. O ensaio foi realizado em triplicata e os resultados expressos como média ± desvio padrão. Penicilina (1 UI/mL) e nistatina (20 UI/mL) foram utilizadas como fármacos de referência.

Determinação da concentração inibitória mínima (CIM)

Para a determinação da CIM, uma suspensão bacteriana (S. aureus ATCC 25923) foi preparada com solução fisiológica estéril (NaCl 9,0 g/L) a 25% de transmitância. A suspensão microbiana padronizada foi submetida à diluição seriada com solução fisiológica estéril e a contagem das unidades formadoras de colônias (UFC) foi realizada utilizando o ágar de contagem (PCA) após um período de 24 horas. O controle positivo foi preparado com 4 mL de caldo caseína inoculado com o S. aureus (10³ -10⁴ UFC/mL ) e 1 mL de solução fisiológica estéril. Para o controle negativo, foram adicionados 4 mL de caldo caseína estéril e 1 mL de solução fisiológica estéril. O procedimento foi realizado em triplicata. No preparo dos tubos-teste foram acrescentados 4 mL de caldo caseína inoculado e 1 mL de cada concentração da amostra-teste utilizada (0,625 -10 mg/mL). Os tubos foram incubados em ambiente aeróbico a temperatura de 37 °C por 24 horas. A CIM foi determinada através da observação de turvação dos meios de cultura, após o período de incubação (Candan et al., 2003).

Atividade leishmanicida

A atividade leishmanicida foi realizada de acordo com Braga et al. (2007). As formas promastigotas utilizadas para a realização do screening foram Leishmania amazonensis (MHOM/Br/75/Josefa isoladas de paciente com leishmaniose cutânea difusa) e Leishmania chagasi (MHOM/Br/74/PP75 isoladas de pacientes com leishmaniose visceral). As formas promastigotas de L. amazonensis foram cultivadas em meio Warren (BD, Estados Unidos da América) e as formas promastigotas de L. chagasi foram mantidas em meio 199 (GIBCO, Bahamas), ambos suplementados com 10% de soro fetal bovino. O screening foi realizado em placas de 96 poços, mantidas a temperatura de 24°C em estufa. Foram adicionados a cada poço da placa 100 µL da suspensão padronizada (L. amazonensis -2 milhões de células/mL e L. chagasi -3 milhões de célula/mL) e as amostras (OE e frações obtidos de P. emarginatus nas concentrações de 6,25 -100 µg/mL) dissolvidas com solução de dimetilsulfóxido 0,08%. O procedimento foi realizado em triplicata. A viabilidade celular de ambas as formas promastigotas foram determinadas, após 24 horas, empregando o método do difenil tetrazólio (MTT) (Mosmann, 1983). Os resultados foram expressos através da determinação da concentração inibitória (CI₅₀) de cada amostra-teste, que representa a concentração molecular que inibe 50 % do crescimento celular. Anfotericina B foi utilizada como droga de referência.

Análise estatística

Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão (n=3). Análises de variância ANOVA seguida pelo teste de Tukey foram utilizadas e o valor de p menor que 0,05 foram utilizados como nível de significância.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A Tabela 1 apresenta os valores das zonas de inibição do crescimento bacteriano (mm) observados para o OE obtido das sementes de P. emarginatus, frente aos microorganismos S. aureus ATCC 25923, S. mutans ATCC 25175, P. aeruginosa ATCC 90271, E. coli ATCC 10530 e C. albicans ATCC 10231. O OE obtido das sementes de P. emarginatus causou inibição no crescimento de S. aureus (CIM = 2,5 mg/mL), demonstrando atividade bactericida. Este microorganismo é responsável por quadros de piodermites, abscessos, pneumonia, meningite e septicemia (Jawetz et al., 2000). Esta atividade pode ser decorrente da presença dos constituintes transcariofileno e α-humuleno, uma vez que já foi relatada tal atividade para estes constituintes (Pichette et al., 2006; Sonboli et al., 2006). O OE não apresentou atividade antimicrobiana contra S. mutans, P. aeruginosa, E. coli e C. albicans.

O entusiasmo em relação ao uso de plantas medicinais e seus extratos na assistência à saúde podem ser entendidos pela sua aceitabilidade, derivada da inserção cultural e pela atual disponibilidade desses recursos, ao contrário do que ocorre com outros medicamentos, que na sua maioria são dependentes de matéria-prima e tecnologias externas (Schenkel et al., 1985; Simões et al., 1986). Segundo Verdi et al. (2005), o uso de plantas para o tratamento de diferentes patologias, incluindo as infecciosas, tem sido extensivamente utilizado pelas pessoas, mesmo estas não tendo comprovação científica. Além disso, a grande incidência de infecções, principalmente em indivíduos imunocomprometidos, justifica a realização de estudos científicos para a descoberta de novos compostos terapêuticos oriundos de material vegetal e/ou por via biotecnológica (Carriconde et al., 1996).

A Tabela 2 apresenta os valores da concentração inibitória (CI₅₀) de cada amostra-teste frente às formas promastigotas de L. amazonensis e L. chagasi, associadas a todas as formas clínicas das leishmanioses e à leishmaniose visceral, respectivamente (Grimaldi & Tesh, 1993). As FH (CI₅₀ = 50,06 µg/mL) e FB (CI₅₀ = 46,65 µg/mL) apresentaram atividade leishmanicida frente ás formas promastigotas de L. amazonensis, sendo que as mesmas não apresentaram atividade frente a L. chagasi. O OE, assim como a FM não apresentaram atividade frente às formas promastigotas de ambas as espécies de Leishmania utilizadas. Os resultados apresentados neste estudo sugerem uma atividade leishmanicida da FH e FB quando comparados com a anfotericina B (CI₅₀= 0,91 µg/mL), utilizado como fármaco de referência, o qual apresentou uma potente atividade leishmanicida confirmando sua aplicação na prática clínica.

Recentes estudos demonstraram a eficácia de algumas plantas medicinais no tratamento de lesões ulceradas da leishmaniose tegumentar e também em modelos in vitro (Akendengue et al., 1999; Bezerra et al., 2006; Paula-Junior et al., 2006). Neste contexto, os produtos naturais têm um grande potencial na pesquisa por novos e seletivos agentes para o tratamento de importantes doenças causadas por protozoários (Phillipson & Wright, 1991a,b).

Compostos químicos isolados de diversos extratos vegetais demonstraram comprovada atividade leishmanicida in vitro sobre formas promastigotas e/ ou amastigotas de Leishmania. Dentre eles, podem ser citados os terpenóides (Yang & Liew, 1992; Camacho et al., 2000), aminoglicosteróides e aminosteróides (Kam et al., 1997), naftoquinonas (Fournet et al., 1992a; Kayser et al., 2000), chalconas (Chen et al., 1993), glicosídios iridóides (Mittal et al., 1998); flavonóides (Araújo et al., 1998), neolignanas (Barata et al., 2000) e os alcalóides (Queiroz et al., 1996; Akendengue et al., 1999; Rodríguez et al., 2008). Diversos autores identificaram alguns destes constituintes nas sementes de P. emarginatus (Braz-Filho & Gottlieb, 1971; Fascio et al., 1976; Torrenegra et al., 1989; Marques et al., 1998; Arriaga et al., 2000), por esta razão, acredita-se que a atividade leishmanicida demonstrada pelas FH e FB possa estar relacionada à presença destes compostos.

Os resultados do presente trabalho demonstraram que o OE obtido das sementes de P. emarginatus inibiu o crescimento de S. aureus ATCC 25923 e as FH e FB apresentaram expressiva atividade in vitro para L. amazonensis. Esses resultados indicam que moléculas bioativas nas sementes de P. emarginatus podem ser utilizadas como protótipos para o desenvolvimento de novos fármacos e/ou como fonte de matérias-primas farmacêuticas antimicrobiana e leishmanicida.

AGRADECIMENTOS

Os autores são gratos pelo suporte financeiro fornecido pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Brasil. R.C.D e F.G.B são alunos bolsista de mestrado pela CAPES. Os autores agradecem a Profª. Drª. Fátima Regina Gonçalves Salimena Pires pela identificação do material vegetal.

Received 30 May 2008; Accepted 29 December 2008

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  01 Set 2009
• Data do Fascículo
  Jun 2009

Histórico

• Aceito
  29 Dez 2008
• Recebido
  30 Maio 2008