Padrões de imunofluorescência do fator antinuclear (FAN) em células HEp-2 de soros reagentes para anti-SSA/Ro

Antinuclear antibodies (ANA) immunofluorescent pattern’s in HEp-2 cells on samples positive for anti-SSA/Ro

ARTIGO ORIGINAL ORIGINAL ARTICLE

Padrões de imunofluorescência do fator antinuclear (FAN) em células HEp-2 de soros reagentes para anti-SSA/Ro

Antinuclear antibodies (ANA) immunofluorescent pattern’s in HEp-2 cells on samples positive for anti-SSA/Ro

Priscila Schmidt Lora^I; Claudia Cilene Fernandes Correia Laurino^II; Adriana Estigarribia de Freitas^III; João Carlos T. Brenol^IV; Odirlei Montecielo^V; Ricardo Machado Xavier^VI

^IFarmacêutica bioquímica, Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, Faculdade de Medicina /UFRGS

^IIFarmacêutica, Ph.D. em Ciências Aplicadas à Pediatria, Serviço de Reumatologia HCPA/UFRGS

^IIIEstudante de Farmácia UFRGS

^IVProfessor adjunto, médico reumatologista, Ph.D. em Clínica Médica, Chefe do Serviço de Reumatologia, HCPA/UFRGS

^VMédico, Residente do Serviço de Reumatologia, HCPA/UFRGS

^VIProfessor adjunto, Ph.D. em Imunologia, médico reumatologista, Serviço de Reumatologia, HCPA/UFRGS

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

OBJETIVO: avaliar os padrões de imunofluorescência do fator antinuclear (FAN) em soros reagentes para anticorpos anti-SSA/Ro e sua associação clínica.

MÉTODO: foi realizado um estudo transversal retrospectivo, no qual foram revisadas as solicitações de anticorpos antiantígenos nucleares extraíveis (anti-ENA) encaminhadas ao SPC/HCPA no período de dois anos. Das solicitações com resultado positivo para anti-ENA identificou-se qual ou quais auto-anticorpos estavam envolvidos (anti-SSA/Ro, anti-SSB/La, anti-RNP, anti-Sm, anti-Scl-70), bem como os padrões de imunofluorescência do FAN e os quadros clínicos dos pacientes anti-SSA/Ro positivo. As técnicas usadas para detecção e identificação foram FAN por imunofluorescência indireta (IFI) em células HEp-2 e anti-ENA por hemaglutinação.

RESULTADOS: das 392 solicitações analisadas 90 eram anti-ENA positivo. Houve um predomínio do sexo feminino (94%) (86/91) e a idade média foi de 42 anos. O anti-SSA/Ro foi o mais freqüente (67,8%) (61/90), sendo que todas as amostras anti-SSA/Ro positivas eram positivas para o FAN. O padrão de imunofluorescência nuclear pontilhado fino foi o predominante (68,9%) (42/61) nos pacientes com anti-SSA/Ro positivo, e o quadro clínico mais encontrado foi de lúpus eritematoso sistêmico, em 50,8% (31/61) dos pacientes.

CONCLUSÃO: o teste de FAN por IFI utilizando células HEp-2 é um bom método de triagem para detecção de auto-anticorpos anti-SSA/Ro, apresentando maior associação com o padrão nuclear pontilhado fino. Diferente do que tem sido descrito na literatura, não encontramos nenhuma amostra de pacientes com anti-SSA/Ro que tenham apresentado FAN falso-negativo na IFI. Pelo menos na nossa experiência, esses dados questionam o custo-efetividade da solicitação de rotina desse exame em pacientes FAN negativo pelo teste de IFI.

Palavras-chave: auto-anticorpo, fator antinuclear, anticorpos anti-SSA/Ro, anti-ENA.

ABSTRACT

OBJECTIVE: to evaluate the pattern at immunofluorescence of the antinuclear antibodies (ANA) detected by the indirect immunofluorescence (IIF) technique in positive samples for anti-SSA/Ro autoantibody and the clinical associations.

METHODS: a retrospective transversal study was performed in a period of two years where the all the solicitations of testing for the presence of anti-extractable nuclear antigen (anti-ENA) antibodies delivered to the SPC/HCPA were analyzed. We selected the positive samples and identified which autoantibodies were involved (anti-SSA/RO, anti-SSB/La, anti-RNP, anti-Sm and anti-Scl70) as well as the immunofluorescence patterns by ANA testing and the clinical associations found in the patients presenting anti-SSA/Ro positive serum. IIF was used for ANA using HEp-2 cells and hemagglutination for anti-ENA antibodies detection.

RESULTS: 90 out of the 392 solicitations analyzed were anti-ENA positive, with a predominance of women (86/91 – 94%) and the mean age was 42 years old. The most frequent autoantibody was anti-SSA/Ro (61/90 – 67.8%) and all samples that were anti-SSA/Ro positive were also ANA positive. Speckled nuclear immunofluorescence was the most frequent ANA pattern (42/61 – 68.9%) among the anti-SSA/Ro positive samples and systemic lupus erythematosus was the most common clinical diagnosis (31/61 – 50.8%).

CONCLUSION: ANA testing by IIF using HEp-2 cells proved to be a good screening test for the detection of anti-SSA/Ro antibodies, that showed a strong positive association to the speckled nuclear IIF pattern. As opposed to what has been described in the literature, there was no ANA negative among the anti-SSA/Ro positive samples. At least in our experience, these data question the cost-effectiveness of performing routine screening for anti-SSA/Ro antibodies in ANA negative samples by IIF testing.

Keywords: autoantibody, antibodies antinuclear, anti-SSA/Ro autoantibody, ENA.

INTRODUÇÃO

Nas doenças reumáticas, uma das principais características é a produção de auto-anticorpos, com alta afinidade contra constituintes intracelulares e extracelulares, fazendo com que estes sejam marcadores específicos dessas doenças. No entanto, esses auto-anticorpos somente possuem significado clínico quando estão associados a outras manifestações de doença⁽¹⁾.

A detecção dos auto-anticorpos tem prestado importante contribuição em diferentes aspectos: como marcadores diagnósticos, indicadores de prognóstico e na monitorização da atividade das doenças auto-imunes^(1-3).

O desenvolvimento da técnica de imunofluorescência indireta (IFI) permitiu a detecção de diversos auto-anticorpos⁽³⁾. Hoje, a pesquisa do fator antinuclear (FAN), usando como substrato células HEp-2 é a metodologia de escolha para rastreamento e identificação dos padrões de imunofluorescência à qual os diversos auto-anticorpos se associam. No entanto, o teste de FAN deve ser complementado pela pesquisa e identificação de auto-anticorpos e auto-antígenos específicos, muitos dos quais apresentam grande utilidade clínica⁽⁴⁾.

Apesar de FAN positivo ser um dos 11 critérios estabelecidos pelo Colégio Americano de Reumatologia para a classificação de lúpus eritematoso sistêmico (LES)⁽⁵⁾, sua presença não necessariamente indica um estado patológico. Tal situação foi demonstrada em um estudo feito em doadores de banco de sangue, em que 22,6% (113/500) dos doadores apresentavam FAN positivo e 20,4% destes com título de 1:80⁽⁶⁾.

A pesquisa de antígenos nucleares extraíveis (ENA) é usada para identificação de um grupo de auto-anticorpos específicos que inclui o anti-SSA/Ro, anti-SSB/La, anti-RNP, anti-Sm, anti-Scl-70 e anti-Jo-1. Esses auto-anticorpos podem ser detectados por diversas metodologias, como contra-imunoeletroforese, immunoblot, imunodifusão, Elisa (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) e hemaglutinação⁽²⁾. Entretanto, podemos encontrar variações nos resultados, pois essas técnicas divergem em sensibilidade e especificidade⁽⁷⁾.

O auto-antígeno SSA/Ro é uma ribonucleoproteína, composta de uma porção polipeptídica e outra de quatro pequenas moléculas de RNA. A junção dessas duas porções forma o complexo SSA/Ro RNAs, conhecido com hY RNAs, sendo a porção antigênica desse complexo molecular a parte polipeptídica⁽⁸⁾.

A maior importância clínica do anti-SSA/Ro está relacionada à sua associação com o lúpus neonatal, o bloqueio congênito cardiovascular, em crianças nascidas de mães com esse auto-anticorpo, e lúpus eritematoso cutâneo subagudo^(9-11). Esse auto-anticorpo é um dos critérios de diagnóstico dos pacientes com síndrome de Sjögren, sendo encontrado em 50-90% dos pacientes, geralmente também associado com outro complexo antigênico, o SSB/La. No LES é encontrado em cerca de 20-80% dos casos⁽³⁾.

Mesmo o FAN por IFI, que utiliza células HEp-2 como substrato, possuindo uma alta sensibilidade para a detecção de auto-anticorpos anti-ENA, incluindo anti-SSA/Ro, podemos encontrar pacientes com anti-SSA/Ro positivo, características de doença auto-imune e FAN negativo, conforme demonstrou Hoffman et al ⁽¹²⁾ .

Esse trabalho pretende avaliar de forma retrospectiva a correlação dos soros anti-SSA/Ro positivo com os padrões de imunofluorescência do FAN, bem como os dados clínicos desses pacientes.

PACIENTES E MÉTODOS

CASUÍSTICA

Neste trabalho foi realizado um estudo transversal retrospectivo. Foram revisadas todas as solicitações de pesquisa de anti-ENA encaminhadas ao Serviço de Patologia Clínica (SPC) do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), no período de janeiro de 2004 a março de 2006. Em seguida, foram selecionadas as solicitações com resultados de anti-ENA positivo, e destas se pesquisou nos prontuários qual ou quais auto-anticorpos estavam envolvidos, anti-SSA/Ro, anti-SSB/La, anti-RNP, anti-Sm e anti-Scl 70, bem como sua associação com os padrões de IFI do FAN e os dados demográficos e quadros clínicos dos pacientes anti-SSA/Ro positivo. Os diagnósticos das doenças auto-imunes foram estabelecidos conforme os critérios do Colégio Americano de Reumatologia (American College of Rheumatology)^(13-17).

IFI

A IFI para células HEp-2 (Wama Diagnóstica, Brasil) foi realizada de acordo com o protocolo proposto pelo fabricante. As células foram incubadas com os soros diluídos nas seguintes titulações 1:80, 1:160, 1:320, 1:640, 1:1280 em tampão salina fosfato pH 7,2 (PBS) por 30 minutos em câmara úmida à temperatura ambiente. Em seguida, as lâminas foram lavadas duas vezes por 10 minutos em PBS e incubadas por 30 minutos com anticorpos secundários anti-IgG humana conjugada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) em câmara escura à temperatura ambiente. Após a incubação, as lâminas foram lavadas em PBS e montadas com glicerina tamponada e lamínula. A leitura foi feita em microscópio de fluorescência, modelo Olympus BX 50 sob aumento de 500 vezes⁽³⁾.

ENA POR HEMAGLUTINAÇÃO

O teste do ENA foi realizado de acordo com o protocolo proposto pelo fabricante (Virgo/Hemagem, EUA). As hemácias foram previamente sensibilizadas com os antígenos RNP, Sm, SSA/Ro, SSB/La e Scl-70; e incubadas com soros diluídos 1:50 (50µl) em solução salina por 90 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, foi feita a interpretação dos resultados. Para os soros que apresentaram reação positiva nessa primeira etapa de rastreamento, foi feita a identificação dos auto-anticorpos específicos, individualmente, para os diferentes ENA.

ESTATÍSTICA

Utilizamos a estatística descritiva para apresentação dos dados demográficos e proporções de testes positivos em uma planilha Excel (Microsoft, versão 2003).

RESULTADOS

Foram analisados 392 soros de pacientes com solicitações para anti-ENA no período de janeiro de 2004 a março de 2006. Encontramos nessa amostra 90 pacientes com anti-ENA positivo e 302 negativo.

Os pacientes com resultado de anti-ENA positivo apresentaram uma faixa etária de 10 a 84 anos, com média de 42 e desvio-padrão de 18,6 anos, havendo um evidente predomínio do sexo feminino de 94% (86/90).

Na Tabela 1, mostramos a relação entre os testes de anti-ENA positivo e o FAN. Encontramos associação entre anti-ENA positivo e FAN positivo em 97,7% (88/90). Todos os pacientes com anti-SSA/Ro positivo apresentaram FAN positivo. Somente dois pacientes apresentaram anti-ENA positivo e FAN negativo. O quadro clínico de um desses pacientes era paniculite, nódulos subcutâneos e alopecia (paciente anti-RNP positivo), e o do outro era LES em remissão (paciente anti-RNP e anti-Sm positivos) em tratamento com glicocorticóide.

Os padrões de imunofluorescência do FAN e as freqüências dos auto-anticorpos ENA específicos estão dispostos na Tabela 2. O auto-anticorpo anti-SSA/Ro apresentou a maior freqüência do grupo, com 67,7% (61/90), sendo 31 soros exclusivos para anti-SSA/Ro e 30 com associação com outros auto-anticorpos. Nessas 30 associações, foram encontrados os seguintes anticorpos concomitantemente ao anticorpo anti-SSA/Ro: anti-SSB/La (26,6%); anti-RNP (26,6%); anti-SSB/La e anti-RNP (6,6%); anti-RNP e anti-Sm (16,6); anti-SSB/La e anti-Sm (10%); anti-SSB/La, anti-RNP e anti-Sm (6,6%); e anti-SSB/La, anti-RNP, anti-Sm e anti-Scl-70 (6,6%). O segundo auto-anticorpo mais freqüente foi anti-RNP, representando 48,8% da amostra, seguido por anti-SSB/La (17,7%), anti-Sm (16,6%) e anti-Scl-70 (1,1%).

Os padrões de imunofluorescência do FAN apresentados pelas amostras anti-SSA/Ro positivo foram: nuclear pontilhado fino, nuclear pontilhado grosso, nuclear homogêneo e nuclear pontilhado pontos isolados (< 10 pontos). E, em oito soros anti-SSA/Ro positivo, observamos a presença de mais de um padrão, estes foram identificados como padrão misto. O padrão de imunofluorescência mais freqüente para anti-SSA/Ro positivo foi nuclear pontilhado fino (42/61).

Os quadros clínicos dos pacientes anti-SSA/Ro positivo estão demonstrados na Tabela 3; LES foi o quadro clínico mais encontrado em 33 dos 61 pacientes. Somente três pacientes não apresentavam características de doença auto-imune, nestes, os quadros clínicos associados eram neoplasia de mama, neoplasia de útero e quadro inflamatório.

DISCUSSÃO

Usualmente, o teste anti-ENA é solicitado para identificação de auto-anticorpos específicos, após o paciente com quadro clínico de doença auto-imune sistêmica ter apresentado um teste de FAN positivo. Muitos trabalhos têm relatado uma sensibilidade inferior a 100% das células HEp-2 na detecção de anticorpos anti-SSA/Ro^(18-22). Bossuyt et al ⁽²⁰⁾ sugere que esse fato possa acontecer por uma possível perda desse auto-antígeno durante o processo de fixação dessas células, usado na produção dos kits de FAN com células HEp-2.

No período de dois anos, identificamos 90 pacientes com anticorpos anti-ENA positivos testados no Serviço de Patologia Clínica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, maioria de mulheres (94%), com idade média de 42 anos (desvio-padrão de 18 anos), em concordância com os achados prévios^(23,24).

Nessa amostra, o anticorpo anti-SSA/Ro foi o de maior prevalência, tendo sido identificado em 67,7% (61/90) dos pacientes anti-ENA reagente, dados semelhantes aos relatados por Sanchez-Guerrero J et al ⁽¹⁹⁾, que encontraram anti-SSA/Ro positivo em 40% de sua amostra, e por Pollock and Toh⁽²¹⁾, que encontraram em sua amostra 65% de anti-SSA/Ro nos anti-ENA positivos.

Observamos que, dos 61 pacientes positivos para anti-SSA/Ro, 30 possuíam associação com outros auto-anticorpos. A coexistência em uma mesma doença auto-imune de diversos auto-anticorpos contra distintos constituintes de um mesmo complexo molecular já foi estudada anteriormente por Tan⁽²⁵⁾, sugerindo que esse fato pode ser explicado pela formação de complexos supramoleculares como SSA/SSB e Sm/RNP.

Nossos resultados mostram que 97% dos pacientes anti-ENA reagentes eram também reagentes para FAN. Todos os pacientes positivos para o auto-anticorpo anti-SSA/Ro foram positivos também para o teste FAN com células HEp-2, mostrando 100% de sensibilidade desse teste para a detecção de anti-SSA/Ro. Sendo assim, concordamos com Kavanaugh et al ⁽⁷⁾, sugerindo que, aos pacientes com FAN negativo, não há indicação de outro teste. Contudo, encontramos dois pacientes com FAN negativo e anti-ENA positivo. Um desses pacientes apresentava anti-RNP positivo e tinha evidências de doença auto-imune, e o outro apresentava anti-RNP e anti-Sm positivos com um diagnóstico de LES em remissão com uso de glicocorticóides. Encontramos na literatura um caso em que um paciente com LES apresentava anti-RNP positivo e FAN negativo⁽¹²⁾.

No entanto, no passado, quando o substrato utilizado para o FAN era tecido de animal (fígado e rim de ratos), podia-se verificar FAN negativo em pacientes anti-SSA/Ro positivo devido à diminuída expressão desse antígeno quando comparado às células HEp-2⁽¹³⁾. Porém Hoffman et al ⁽¹²⁾ realizaram um estudo com 494 amostras, no qual foram utilizados dois substratos para FAN por IFI, células HEp-2 e células HEp-2 geneticamente modificadas, com superexpressão do auto-antígeno SSA/Ro (HEp-2000^® Immunoconcepts, EUA), encontrando três pacientes com anti-SSA/Ro positivo que só apresentaram positividade para FAN por IFI quando o substrato utilizado era células HEp-2 geneticamente modificadas⁽¹⁹⁾.

Apesar de a sensibilidade do FAN para LES ser de 95-100%^(7,25), podem-se encontrar pacientes com esse diagnóstico sem um teste de FAN positivo. Ainda não se sabe se esses pacientes formariam um subgrupo de LES ou se isso seria um resultado falso-negativo de FAN⁽²⁶⁾.

O padrão de imunofluorescência do FAN predominante dos pacientes anti-ENA positivos foi o nuclear pontilhado fino, tanto naqueles com anti-SSA/Ro positivos (68,9%) (42/61) quanto nos outros auto-anticorpos. A correlação encontrada entre anticorpos anti-SSA/Ro e o padrão nuclear pontilhado fino já foi demonstrada por outros autores^(3,19,27) e não deve ser usada como único parâmetro, pois esse padrão também foi o mais prevalente nas amostras sem a presença desse anticorpo, o que pode ser explicado talvez pela coexistência do anticorpo anti-SSB/La, que também costuma apresentar esse padrão de imunofluorescência.

Os quadros clínicos mais encontrados nos pacientes anti-SSA/Ro positivos foram o LES e a síndrome de Sjögren, condizendo com o que se esperava encontrar, pois essas patologias estão fortemente relacionadas com a presença desse auto-anticorpo^(22,27,28).

É importante ressaltar que em nosso trabalho foi utilizada hemaglutinação para a detecção de anticorpos anti-ENA, podendo assim diferir na sensibilidade e especificidade de outros métodos (Elisa, contra-imunoeletroforese, imunodifusão etc.), como já foi relatado por inúmeros autores^(26,29-33). Novas pesquisas sobre essas diferentes metodologias que não só comparem técnicas de detecção dos auto-anticorpos, mas que também analisem os pacientes quanto aos seus dados clínicos e acompanhem o curso das doenças nos pacientes, são necessárias para uma melhor utilização das tecnologias disponíveis hoje⁽³⁴⁾.

O teste de FAN em células HEp-2 por IFI mostrou ser um bom método de rastreamento para a detecção de auto-anticorpos anti-SSA/Ro, apresentando maior associação com o padrão nuclear pontilhado fino e com os quadros clínicos de LES e síndrome de Sjögren.

AGRADECIMENTOS

Agradecemos aos funcionários do Serviço de Reumatologia e do Serviço de Patologia Clínica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, especialmente às bioquímicas Marta Bergman Senger, Maria Clara Medina Correa e Dra. Carolina Sichinger Moura de Souza.

Declaramos a inexistência de conflitos de interesse.

Recebido em 03/10/06.

Aprovado, após revisão, em 22/11/06.

Serviços de Reumatologia e Serviço de Patologia Clínica (SPC), Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Fundo de Incentivo à Pesquisa e Eventos (Fipe).

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  10 Maio 2007
• Data do Fascículo
  Fev 2007

Histórico

• Aceito
  22 Nov 2006
• Recebido
  03 Out 2006