Relevância clínica e frequência de padrões citoplasmático e pontilhado fino denso observados em FAN-HEp-2

Resumos

OBJETIVOS: O presente estudo procurou determinar a frequência e relacionar o título sorológico dos padrões de imunofluorescência para citoplasma celular e nuclear pontilhado fino denso com possível correlação clínica. MÉTODOS: No período entre 2007 a 2009 foram avaliados os resultados de 2.788 testes sorológicos para pesquisa de autoanticorpos pela técnica de imunofluorescência indireta (IFI), utilizando como substrato células HEp-2, realizados no LAC-HUSM/UFSM. RESULTADOS: Entre as amostras analisadas, 1.998 resultaram não reagentes para a pesquisa de autoanticorpos. Entre as amostras reagentes (n = 790) foram encontradas 57 (7,2%) amostras apresentando padrão de reatividade descrita como pontilhado fino denso (SFD) (3,8%) ou fluorescência citoplasmática (Cit) (3,4%). Nas amostras com padrão SFD (n = 29), nove apresentaram título < 1/160, onde apenas um paciente apresentava doença autoimune (DAI). Entre os pacientes com título > 1/160 apenas um não apresentava DAI. Entre as amostras com padrão Cit (n = 27), 20 apresentavam título < 1/160, onde apenas oito não tinham DAI associada. Todos os outros 7 pacientes com título > 1/160 tinham relato de DAI. CONCLUSÃO: Os resultados encontrados ratificam o valor de 1/160 como melhor ponto de corte para definição de presença de DAI, para qualquer um dos padrões de fluorescência avaliados. Contudo, deve-se prestar atenção a títulos inferiores, principalmente para IFI Cit, uma vez que apenas 40% não apresentavam relato de DAI presente

anticorpos; autoimunidade; técnica indireta de fluorescência para anticorpo


OBJECTIVES: This study aimed to determine the frequency and antibody titers of nuclear dense fine and cytoplasmic patterns with possible clinical correlation. METHODS: From 2007 to 2009, the results of 2,788 autoantibody serological tests were assessed by indirect immunofluorescence (IIF) at LAC-HUSM/UFSM, using as substrate HEp-2. RESULTS: Among the analyzed samples, 1,998 of them were negative for autoantibodies. Among the positive samples (n = 790), we found 57 (7.2%) showing reactivity pattern described as dense fine speckled (DFS) (3.8%), or cytoplasmic (Cit) fluorescence (3.4%). In samples with standard DFS (n = 29), nine had titers of 1/160, and only one patient had autoimmune disease (AID). Among patients with titers > 1/160, only one patient did not have AID. Among samples with standard Cit (n = 27), 20 had titers of 1/160, and only eight were not associated with AID. The other seven patients with titers > 1/160 reported AID. CONCLUSION: The results confirm the value of 1/160 as the best cut-off point for defining AID presence, for any of the fluorescence assessed patterns. However, attention should be given to lower titers, especially for Cit IIF, since only 40% did not report the presence of AID

antibodies; fluorescent antibody technique; autoimmunity


ARTIGO ORIGINAL

Relevância clínica e frequência de padrões citoplasmático e pontilhado fino denso observados em FAN-HEp-2

Andréia Martini PaziniI; Juliana FleckII; Rosane Souza dos SantosII; Sandra Trevisan BeckIII

IGraduanda do Curso de Farmácia da UFSM

IIMestre em Bioquimica Toxicológica pela UFSM; Farmacêutica-Bioquímica

IIIDoutora em Ciências Farmacêuticas pela Universidade de São Paulo; Professora Adjunta da UFSM

Correspondência para

RESUMO

OBJETIVOS: O presente estudo procurou determinar a frequência e relacionar o título sorológico dos padrões de imunofluorescência para citoplasma celular e nuclear pontilhado fino denso com possível correlação clínica.

MÉTODOS: No período entre 2007 a 2009 foram avaliados os resultados de 2.788 testes sorológicos para pesquisa de autoanticorpos pela técnica de imunofluorescência indireta (IFI), utilizando como substrato células HEp-2, realizados no LAC-HUSM/UFSM.

RESULTADOS: Entre as amostras analisadas, 1.998 resultaram não reagentes para a pesquisa de autoanticorpos. Entre as amostras reagentes (n = 790) foram encontradas 57 (7,2%) amostras apresentando padrão de reatividade descrita como pontilhado fino denso (SFD) (3,8%) ou fluorescência citoplasmática (Cit) (3,4%). Nas amostras com padrão SFD (n = 29), nove apresentaram título < 1/160, onde apenas um paciente apresentava doença autoimune (DAI). Entre os pacientes com título > 1/160 apenas um não apresentava DAI. Entre as amostras com padrão Cit (n = 27), 20 apresentavam título < 1/160, onde apenas oito não tinham DAI associada. Todos os outros 7 pacientes com título > 1/160 tinham relato de DAI.

CONCLUSÃO: Os resultados encontrados ratificam o valor de 1/160 como melhor ponto de corte para definição de presença de DAI, para qualquer um dos padrões de fluorescência avaliados. Contudo, deve-se prestar atenção a títulos inferiores, principalmente para IFI Cit, uma vez que apenas 40% não apresentavam relato de DAI presente.

Palavras-chave: anticorpos, autoimunidade, técnica indireta de fluorescência para anticorpo.

INTRODUÇÃO

A pesquisa de anticorpos antinúcleo (ANA) pela técnica de imunofluorescência indireta (IFI), também conhecido como fator antinuclear (FAN), em soro de pacientes com suspeita de doença autoimune (DAI), trata-se de um excelente exame de rastreamento de autoanticorpos. No início da década de 1950, realizava-se a IFI tendo como substrato corte ou imprint de fígado de roedores para a triagem de FAN no soro de pacientes com suspeita de DAI.1 A pesquisa positiva passou a indicar a possível presença de alguns autoanticorpos em pacientes com suspeita de lúpus eritematoso sistêmico (LES) e de outras DAI, como esclerose sistêmica (ES) e síndrome de Sjögren. Essa técnica, ao longo das últimas décadas, foi modificada de forma a conferir sensibilidade progressivamente maior 3.

Na atualidade, a IFI utilizando célula de Epitelioma de Laringe Humana - HEp-2 (epitelioma humano tipo 2 - clone CCl 23ATCC) praticamente substituiu a IFI utilizando imprint de células de roedores, devido a múltiplos fatores, entre o quais, a possibilidade de padronização universal, já que os vários laboratórios em todo o mundo passaram a utilizar o mesmo tipo de substrato. Atualmente, diversos fabricantes fornecem lâminas comerciais com células HEp-2 fixadas com excelente qualidade2,3 contribuindo para a aplicação técnica uniforme entre os laboratórios de análises clínicas.4 Outro fator importante nesta substituição é a excelente visibilidade de múltiplos padrões de fluorescência5 e a oferta de uma diversidade de autoantígenos inerente a esse substrato. Como consequência, o teste de FAN passou também a apresentar maior sensibilidade e menor especificidade.4

Ultimamente, porém, têm sido reportados laudos laboratoriais com grande número de informações, que nem sempre traduzem de forma objetiva ou auxiliam determinar a condição de saúde de um paciente. O aumento na sensibilidade, no entanto, resultou em diminuição substancial na especificidade até mesmo para o diagnóstico de doença reumática autoimune, pois alguns indivíduos aparentemente hígidos (2% a 4%) passaram a apresentar resultados positivos pela técnica de FAN-IFI,2 o que era extremamente raro com o teste das células LE.

Um dos principais padrões de imunofluorescência presente em amostras de indivíduos sadios é o pontilhado fino denso (SFD). Sua alta frequência em indivíduos com patologias não autoimunes torna o seu reconhecimento importante para que se possa apreciar adequadamente os achados do teste de FAN-HEp-2.6 Está bem demonstrada que a presença de autoanticorpos pode ser desencadeada transitoriamente por infecções, medicamentos e neoplasias. O padrão citoplasmático (Cit), que passou a ser relatado recentemente, na maioria dos casos, ainda não tem sua relevância clínica definida.

O presente trabalho teve por objetivo determinar a frequência e título de anticorpos do padrão de fluorescência nuclear fino denso e citoplasmático relacionando com a presença de DAI, determinando a relevância clínica dos resultados.

MATERIAIS E MÉTODOS

Casuística

Foram revisados os resultados de pesquisa de FAN por IFI realizada no Laboratório de Análises Clínicas (LAC) do Hospital Universitário de Santa Maria (HUSM) e analisados os prontuários dos pacientes que apresentaram positividade para os padrões SFD e Cit no período de janeiro de 2007 a março de 2010.

Imunofluorescência indireta (IFI)

A pesquisa de FAN por IFI em células HEp-2 (Hemagen Diagnóstica, Inc- Virgo® Products Division Columbia, Maryland 21045 USA) é realizada no LAC-HUSM de acordo com o seguinte protocolo: as células são incubadas com os soros dos pacientes diluídos em tampão salina fosfato pH 7,2 (PBS) por 30 minutos em câmara úmida à temperatura ambiente. Em seguida, as lâminas são lavadas duas vezes por 10 minutos em PBS e incubadas por 30 minutos com anticorpo secundário antigamaglobulina humana conjugada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) em câmara escura à temperatura ambiente. Após a incubação, as lâminas são lavadas em PBS e montadas com glicerina tamponada e lamínula. A leitura é feita em microscópio de fluorescência, modelo Olympus BX 50 sob aumento de 500 vezes. A cada rotina de realização dos testes FAN são realizados controles internos negativos e positivos.

Os dados foram analisados utilizando-se estatística descritiva (média e frequencia [%]). O presente estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFSM sob o número CAAE 0196.0.243.000-09.

RESULTADOS

Entre os resultados FAN-HEp-2 avaliados (n = 2.788) entre janeiro/2007 e março/2010 no LAC/HUSM, 1.998 (71,66%) resultaram negativos para a pesquisa de autoanticorpos e 790 (28,33%) tiveram resultados reagentes.

Dos 790 que tiveram positividade, 734 (92,92%) apresentaram os seguintes padrões de fluorescência: nuclear homogêneo, nuclear pontilhado grosso, nuclear pontilhado fino, nuclear tipo membrana nuclear, nucleolar homogêneo, nucleolar pontilhado, nucleolar pontilhado pontos isolados, nucleolar pontilhado centromérico, nucleolar aglomerado e 56 (7,1%) resultaram nuclear SFD ou Cit. Sendo que 29 amostras revelaram padrão nuclear SFD e 27 revelaram padrão Cit (Figura1).

Verificou-se que em 74% dos pacientes que apresentaram padrão Cit, os títulos encontrados foram baixos (1/40 e 1/80). Já aproximadamente metade (55,2%) dos pacientes que demonstraram padrão SFD apresentou títulos elevados (1/320 e 1/640). À medida que os títulos aumentaram, diminuiu a prevalência do padrão citoplasmático, ao contrário do padrão SFD que predominou em pacientes com títulos mais elevados. (Figura 2)

Ao ser relacionado o título de IFI encontrado com evidência de DAI, pode ser observado que a prevalência de DAI ocorreu nos dois padrões em estudo, porém com diferentes níveis de reatividade (Tabela 1).

Os resultados relatados como padrão de fluorescência SFD, foram estratificados em conformidade com o título encontrado no soro de 29 pacientes classificados de acordo com a presença e ausência de evidência de autoimunidade (Figura 3).

Em relação ao padrão Cit foi possível verificar que em baixos títulos (1/40) foi encontrado um número significativo de DAI (Tabela 1). Contudo, pode ser observada uma menor especificidade nos títulos inferiores a 1/160, presentes nos soros de indivíduos sem evidência de DAI (Figura 4).

DISCUSSÃO

A detecção de autoanticorpos no soro tem um papel prognóstico nas DAI, pois reflete a presença, a natureza e a intensidade da resposta autoimune. Existem mais de 100 diferentes tipos de doenças reumatológicas, sendo frequente a necessidade de diagnóstico diferencial entre as tais doenças.7

Houve uma acentuada evolução na interpretação dos padrões de IFI para detecção de autoanticorpos em células HEp-2 no transcorrer dos últimos anos. Essa metodologia apresenta a capacidade de rastrear uma grande variedade de anticorpos, proporcionando a localização e provável identidade do autoantígeno, porém apresenta como limitação variações na interpretação dos padrões de fluorescência.8 Tempos atrás, a maioria dos estudos estavam focados principalmente nos ANA, mas hoje acredita-se que anticorpos contra citoplasma, superfície celular, espaço intercelular e componentes da célula também são importantes no contexto das DAI.9

Conforme, o 3º Consenso Nacional de Padronização de Laudos de FAN, estão descritas mais de 25 possibilidades de padrões de fluorescência. Cada um pode refletir uma dada expressão antigênica reconhecida pelo seu autoanticorpo.10-12

Estudo pioneiro relacionado ao padrão SFD foi realizado por Ochs et al.13 e conforme já relatado por Laurino et al.14 há uma baixa prevalência deste padrão de fluorescência com placa metafásica positiva comparado aos outros existentes. Leser et al.15 demonstraram que o padrão SFD apresentou alta taxa de associação com ausência de autoimunidade em títulos baixos, médios e altos.

Entre os padrões encontrados no presente estudo, a frequência do padrão SFD (3,7%) e Cit (3,4%) foi inferior ao relatado em outro serviço, onde a frequência foi de 6,3% e 9%, respectivamente.14 Provavelmente isso acontece devido à solicitação desse exame estar embasada no contexto clínico de cada paciente, tendo sido solicitado principalmente por reumatologistas do HUSM, o que levou a um número menor de detecção do padrão vinculado a inespecificidade. Tampoia et al.16 observaram que os reumatologistas solicitavam o FAN com uma maior frequência para pacientes que apresentavam dois ou mais critérios para classificação de DAI, ao contrário dos médicos de outras especialidades, que solicitavam esse exame para pacientes que apresentavam somente quadros inflamatórios.

Todos os indivíduos apresentam certo grau de autoimunidade fisiológica, a qual pode variar dependendo das sobrecargas a que o sistema imunológico seja exposto. Elevações transitórias dos títulos de FAN podem ocorrer em indivíduos com processos infecciosos agudos e com certos medicamentos como hidralazina, carbamazepina, hidantoína, procainamida, isoniazida, metildopa, dentre outros.12 Provavelmente por este fator, alguns indivíduos com outras condições não autoimunes possam ter apresentado pesquisa de FAN reagente como demonstrado na Tabela 1. Não foi possível considerar a baixa reatividade exclusivamente como um fator normal, uma vez que a amostra analisada foi composta por soro de indivíduos que procuraram atendimento no HUSM, tendo seu exame realizado pelo laboratório central deste hospital, não podendo então ser excluída a presença de alguma enfermidade presente. Sabe-se que apesar da sensibilidade do teste de ANA ser bastante alta (quase 100%) principalmente para o LES, sua especificidade pode ser baixa, principalmente quando a intensidade da reação é pequena (baixos títulos), fazendo com que seja detectado também em diferentes condições clínicas.17

O padrão nuclear SFD com placa metafásica positiva é descrito na literatura como tendo uma maior prevalência em pacientes sem evidências clínicas de DAI.18 Assim, Leser et al.15 observaram que os padrões nuclear SFD, nuclear pontilhado reticulado e nuclear pontilhado fino associaram-se predominantemente a indivíduos sem qualquer evidência de DAI. Por outro lado, ao se conjugarem as informações de padrão de fluorescência e título, observaram que, para os padrões pontilhado fino e pontilhado grosso reticulado, a associação com ausência de DAI foi real apenas em títulos baixos. O mesmo não foi absolutamente verdadeiro para o padrão SFD, que apresentou alta taxa de associação com ausência de DAI em títulos baixos, médios e altos.15

Watanabe et al.6, em estudo sobre a frequência e o padrão do FAN por IFI em trabalhadoras hígidas de uma hidrelétrica, revelaram que o padrão SFD foi frequentemente encontrado naquelas com FAN positivo, aparecendo em títulos baixos, médios e altos. Esses resultados também puderam ser verificados no presente estudo, contudo, como pode ser observado na Figura 3, apesar de em títulos menores que 1/80 haver predomínio de outras condições não autoimunes, não é possível excluir totalmente a probabilidade, uma vez que cinco pacientes com DAI apresentaram título 1/40 com esse padrão de fluorescência. Apenas em títulos maiores ou iguais a 1/640 não foram observados pacientes sem evidência de DAI.

Um segundo ponto a ser considerado é o título do FAN-HEp-2, muito embora seu valor seja relativo. Em geral, os portadores de DAI tendem a apresentar títulos moderados (1/160 e 1/320) e elevados (> 1/640), enquanto os indivíduos sadios com FAN-HEp-2 positivo tendem a apresentar baixos títulos (1/80).2 Entretanto, é importante ter em mente que exceções de ambos os lados não são infrequentes.15 Dessa maneira, se faz relevante mencionar um estudo multicêntrico de reconhecida importância, realizado por Tan et al.2 com indivíduos entre 20 e 60 anos. Entre os indivíduos hígidos, as seguintes percentagens de testes positivos foram encontradas: 1/40 em 31,7% dos indivíduos, 1/80 em13,3%, 1/160 em 5,0% e 1/320 em 3,3%.

A relevância clínica do padrão Cit não se encontra ainda totalmente estabelecida. Segundo os pesquisadores Massabki et al.19 e Eystathioy et al.20, o padrão citoplasmático quando em títulos baixos ou moderados podem não ter relevância clínica definida. No entanto, o presente estudo verificou que pacientes com DAI como artrite reumatoide, LES, ES, poliomiosite apresentam esse padrão de fluorescência em baixos títulos.

Em conclusão, a minuciosa interpretação dos padrões de IFI exerce um papel fundamental na valorização dos resultados encontrados. O titulo do FAN-HEp-2 é um parâmetro de valor relativo, enquanto o padrão de fluorescência pode ter impacto mais decisivo. Os resultados encontrados no presente estudo ratificam o valor do título 1/160 como melhor ponto de corte para definição de presença de DAI, para qualquer um dos padrões de fluorescência avaliados. Contudo, deve-se prestar atenção a títulos inferiores, principalmente para fluorescência com padrão Cit, uma vez que apenas 40% não apresentavam relato de DAI presente.

Submetido em 01/10/2010.

Aprovado, após revisão, em 23/11/2010.

Declaramos a inexistência de conflito de interesse.

Comitê de Ética nº 0196.0.243.000-09.

Universidade Federal de Santa Maria - UFSM.

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  • Correspondência para:
    Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Centro de Ciências da Saúde - Prédio 26, sala 1205
    Universidade Federal de Santa Maria, Campus Universitário - Camobi
    Santa Maria, RS. CEP: 971059-00
    E-mail:

Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    07 Jan 2011
  • Data do Fascículo
    Dez 2010

Histórico

  • Recebido
    01 Out 2010
  • Aceito
    23 Nov 2010
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