Análise do gene PTEN por hibridização in situ fluorescente no carcinoma de células renais

Resumos

OBJECTIVE: To evaluate the frequency of deletion of the PTEN gene in renal cell carcinoma (RCC) and its impact on the rates of overall and disease-free survival. METHODS: We analyzed 110 patients with renal cell carcinoma who underwent radical or partial nephrectomy between 1980 and 2007. In 53 cases it was possible to analyse the PTEN gene by the method of fluorescent in situ hybridization using the technique of tissue microarray. For statistical analysis, patients were classified in two groups according to the presence or absence of the deletion. RESULTS: The mean follow-up time was 41.9 months. Hemizygous deletion was detected in 18 patients (33.9%), while the homozygous one was present in three (5.6%). Deletion was present in approximately 40% of the analyzed cases. Monosomy and trisomy were detected in nine (17%) and two patients (3.8%), respectively. In 21 patients (39.6%) the analysis of the PTEN gene by in situ hybridization was normal. There were no statistically significant differences in overall (p = 0.468) and disease-free (p = 0.344) survival rates between patients with or without deletion. Factors which were independent for overall survival: TNM clinical stage, symptoms at diagnosis, high Fuhrmann grade, performance status (ECoG) and tumor recurrence. Disease-free survival was influenced only by the clinical TNM stage. CONCLUSION: Deletion of the PTEN gene in RCC was detected with a frequency of approximately 40% and its presence was not determinant of lower survival rates, the traditional prognostic factors remaining as determinants of outcome.

Gene deletion; PTEN phosphohydrolase; In situ hybridization, fluorescence; Carcinoma, renal cell; Survival rate

ARTIGO ORIGINAL

Análise do gene PTEN por hibridização in situ fluorescente no carcinoma de células renais

Eurico Cleto Ribeiro de Campos, TCBC-PR^I; Francisco Paulo da Fonseca^II; Stênio de Cássio Zequ, ACBC-SP^II; Gustavo Cardoso Guimarães, TCBC-SP^III; Fernando Augusto Soares^IV; Ademar Lopes, TCBC-SP^V

^IProfessor Adjunto de Cirurgia Geral da Universidade Estadual de Ponta Grossa (UEPG)

^IIMédico Titular do Núcleo de Urologia do Hospital A. C. Camargo Cancer Center

^IIIChefe do Núcleo de Urologia do Hospital A. C. Camargo Cancer Center

^IVDiretor do Departamento de Anatomia Patológica do Hospital A. C. Camargo Cancer Center

^VVice-presidente do Hospital A. C. Camargo Cancer Center

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

OBJETIVO: avaliar a frequência de deleção do gene PTEN no carcinoma de células renais e o impacto da deleção nas taxas de sobrevida global e livre de doença.

MÉTODOS: foram analisados 110 pacientes portadores de carcinoma de células renais submetidos à nefrectomia radical ou parcial entre os anos de 1980 e 2007. Em 53 casos foi possível a análise do gene PTEN pelo método de hibridização in situ fluorescente através da técnica de "tissue microarray". Para a análise estatística, os pacientes foram classificados em dois grupos, de acordo com a presença ou ausência de deleção.

RESULTADOS: o tempo médio de seguimento foi de 41,9 meses. Deleção hemizigótica foi identificada em 18 pacientes (33,9%), ao passo que deleção homozigótica esteve presente em três (5,6%). Em aproximadamente 40% dos casos analisados havia deleção. Monossomia e trissomia foram detectadas, respectivamente, em nove (17%) e dois pacientes (3,8%). Em 21 pacientes (39,6%), a análise por hibridização in situ do gene PTEN foi normal. Não houve diferenças estatisticamente significativas nas taxas de sobrevida global (p=0,468) e livre de doença (p=0,344) entre os pacientes portadores ou não de deleção. Foram fatores independentes para a sobrevida global: estádio clínico TNM, sintomatologia ao diagnóstico, alto grau de Fuhrmann performance status (Ecog) e recorrência tumoral. A livre de doença foi influenciada unicamente pelo estádio clínico TNM.

CONCLUSÃO: deleção do gene PTEN no CCR foi detectada com frequência de aproximadamente 40% e sua presença não foi determinante de menores taxas de sobrevida, permanecendo os fatores prognósticos tradicionais como determinantes da evolução dos pacientes.

Descritores: Deleção de genes. PTEN Fosfo-hidrolase. Hibridização in situ fluorescente. Carcinoma de células renais. Taxa de sobrevida.

INTRODUÇÃO

O carcinoma de células renais (CCR) classifica-se entre as dez neoplasias mais frequentes nos EUA¹. Apesar do aumento no diagnóstico de tumores renais cada vez menores e assintomáticos, cerca de 30% dos pacientes apresentam metástases ao diagnóstico e outros 30% irão desenvolver metástases durante o curso da doença, mesmo com ela localizada^1-4.

Fatores biomoleculares têm sido estudados para auxiliar no estadiamento clínico e patológico, identificando diferentes genes e proteínas capazes de predizer o risco de progressão ou morte pela doença e identificar os pacientes que possam ter melhor resposta a tratamentos baseados nestas alterações moleculares presentes³.

Entre os genes estudados destaca-se o PTEN (phosphatase with tensin homology deleted in chromosome 10) que é um gene supressor tumoral localizado no cromossomo 10q23 e que pode ser inativado em decorrência de mutações e deleções em diversas neoplasias sólidas². No CCR, a presença de deleção ou mutação do PTEN, assim como a hipoexpressão imunohistoquímica, associam-se ao fenótipo invasivo e metastático da neoplasia^2,4-8.

O objetivo deste estudo é analisar o gene PTEN através de tissue microarray (TMA) pela técnica de hibridização in situ fluorescente, determinando a frequência de deleção, e o impacto da deleção nas taxas de sobrevida global e sobrevida livre de doença (SLD).

MÉTODOS

Foram avaliados retrospectivamente 53 pacientes portadores de carcinoma de células renais, metastáticos ou não ao diagnóstico, e submetidos a tratamento cirúrgico exclusivo da neoplasia renal, entre 1980 e 2007. A pesquisa de hibridização in situ fluorescente do gene PTEN foi realizada inicialmente em 110 pacientes que constavam no TMA; porém, somente em 53 amostras (48,2%) foi possível analisar a reação proposta. Diferentes fatores, como a presença de artefatos na lâmina obtida do TMA ou a insuficiência celular, foram determinantes para que não ocorresse a reação proposta.

A classificação de Fuhrman et al.⁹ foi utilizada, sendo que tumores graus I e II foram considerados como tumores de baixo grau e os graus III e IV como de alto grau. Para definição do subtipo histológico, foi utilizada a classificação da Organização Mundial da Saúde¹⁰. Os pacientes foram analisados em dois grupos: estádio I e II (doença localizada) versus III e IV (doença localmente avançada ou metastática) de acordo com o TNM 2004¹¹. As taxas de sobrevida foram calculadas pela técnica de Kaplan-Meier e as comparações entre elas pelo teste do Log Rank. Para a análise múltipla das sobrevidas foi empregado o modelo de riscos proporcionais de Cox. Para a análise da SLD, pacientes portadores de metástases ao diagnóstico ou com margens cirúrgicas positivas, foram excluídos do estudo.

Tissue microarray (TMA)

Os 53 tumores designados por seus números de registro de laudo anatomopatológico correspondentes, previamente selecionados e classificados, foram incluídos na construção de um bloco-receptor de parafina de TMA (Beecher Instruments, Silver Spring, MD), a partir de amostras colhidas do bloco-doador original, com agulha de 1mm de diâmetro (TMArrayer punch MP10-1,0mm), após a prévia escolha e marcação de área representativa da neoplasia, a partir da lâmina de hematoxilina e eosina original.

Foram realizadas punções em duplicata (dois fragmentos de cada caso) do bloco de parafina doador e do receptor, contendo assim, duas áreas diferentes da neoplasia em cada caso. Cortes histológicos com 3 a 4µ de espessura do bloco de parafina receptor também foram efetuados, até todo o seu desgaste, obtendo-se um total de 110 lâminas numeradas sequencialmente a partir de 01. Para representar de maneira mais significativa a heterogeneidade tumoral, foram utilizadas mais de uma lâmina com amostras em duplicada.

Hibridização in situ fluorescente

A pesquisa de alterações estruturais ou em relação ao número de cromossomos ocupando o locus foi realizada mediante reações de hibridização in situ fluorescente através de um probe de 368kb com afinidade específica para a região 10q23 do cromossomo 10, contendo sequências que identificam as porções 5' e 3' do gene PTEN. O gene PTEN foi considerado normal pela presença de dois sinais vermelhos (10q23/PTEN locus) e dois sinais verdes (CEP 10).

A presença de deleção hemizigótica foi definida quando um dos alelos estava alterado parcial ou completamente, estando o gene selvagem presente, ou seja, quando havia mais de 24% do tumor contendo somente um locus do gene PTEN e pela presença do sinal no controle. A deleção homozigótica foi definida na leitura das lâminas, quando estavam ausentes os locus do gene PTEN e estava presente o sinal do grupo controle em mais de 30% das células.

Em relação ao número, definiu-se trissomia quando além da presença dos dois cromossomos e seus respectivos alelos, havia um cromossomo a mais, ou seja, durante leitura havia mais de 15% do tumor contendo três locus PTEN e pela presença de três sinais no controle. A monossomia foi definida, quando estava presente apenas um cromossomo ocupando o locus 10 e havia à leitura mais de 23% de tumor contendo um sinal no locus PTEN e pela presença de um sinal no controle.

Para a análise estatística da sobrevida global e sobrevida livre de doença, dois grupos de pacientes foram definidos de acordo com os resultados obtidos à reação de hibridização in situ fluorescente. Os pacientes que demonstraram deleção hemizigótica, homozigótica ou monossomia à hibridização, foram considerados no grupo de deleção. Reação de hibridização in situ com achados de trissomia ou normalidade, definiram o outro grupo como sem deleção.

RESULTADOS

A média de idade foi 54,9 anos, predominando pacientes do sexo masculino (61,8%). Ao término do estudo, havia 68 pacientes (61,8) vivos e sem doença, sete (6,4%) vivos com doença, 35 óbitos (31,7%) e quatro pacientes (3,6%) perdidos de vista. A tabela 1 demonstra os principais fatores epidemiológicos, clínicos e anatomopatológicos dos 110 pacientes analisados.

Entre as amostras positivas para deleção, 18 (33,9%) demonstravam deleção hemizigótica e 3 (5,6%) deleção homozigótica. Em 21 amostras (39,6%) não foi encontrada deleção do PTEN. Monossomia e trissomia do gene foram detectadas em 11 amostras (20,7%), sendo nove casos de monossomia (17%) e dois de trissomia (3,8%). Entre as 53 amostras positivas para o Fish, 30 (56,6%) apresentavam deleção e 23 (43,4%) não apresentavam. A figura 1 demonstra os achados à reação de hibridização in situ por fluorescência.

As taxas de sobrevida global em cinco anos não foram influenciadas pela presença ou ausência de deleção, e foram respectivamente de 75,7% e 82,8% (p=0,468). Assim como a sobrevida global, não houve diferenças estatisticamente significativas quanto a presença ou ausência de deleção em relação à sobrevida livre de doença e respectivamente de 70,3% e 84,7% (p=0,344), embora se tenha observado tendência de maior sobrevida global e sobrevida livre de doença para os pacientes que não apresentaram deleção à reação de hibridização in situ. A figura 2 demonstra a curva de sobrevida global de acordo com hibridização in situ do PTEN.

Pela análise múltipla, a sobrevida global dos pacientes foi influenciada, independentemente, pelas seguintes variáveis: estádio clínico IV (HR=7,095; p=0,011), ECOG 1 e 2 (HR=0,28; p=0,01), sintomatologia ao diagnóstico (HR=3,380; p=0,037), alto grau de Fuhrman (HR=2,421; p=0,057) e recorrência tumoral (HR=3,380; p=0,029). A sobrevida livre de doença foi influenciada unicamente pelos estádios clínicos II e III (HR=4,34 e 12,85; p=0,02 e 0,01, respectivamente).

DISCUSSÃO

Apesar do uso rotineiro de critérios clínicos e anatomopatológicos na avaliação do prognóstico de pacientes portadores de CCR, muitos desenvolvem metástases durante o seguimento, demonstrando a necessidade de se identificar novos fatores capazes de melhor predizer a evolução destes pacientes^1,3.

O gene PTEN/MMCA1 está localizado no cromossomo 10q23, atuando no controle da migração, proliferação e apoptose celular, agindo por mecanismo de "down regulation" do PI3K (phosphatidylinositol 3-OH kinase) e da proteína Akt. No CCR, a hipoexpressão imunoistoquímica do PTEN tem sido associada aos tumores de alto grau e a menores taxas de sobrevida^1,7.

A técnica de hibridização in situ fluorescente permite a avaliação de genes mediante a adição de sondas específicas marcadas com material fluorescente, identificando alterações numéricas (ganhos ou perdas cromossomais, amplificações, deleções) ou alterações estruturais (translocação), demonstrando superioridade a outras técnicas por não sofrer influência da heterogeneidade tumoral.

Como limitações da técnica, fatores como insuficiência celular, concentração da sonda, lavagem pós-hibridização e origem do material emblocado em parafina¹², podem interferir na análise dos resultados, e interfiram nas reações de hibridização no presente estudo, causando a exclusão de 57 casos, a partir de casuística inicial de 110 casos.

Há poucos estudos na literatura analisando o status do gene PTEN quanto há alterações genômicas e detectadas por hibridização in situ, A metodologia empregada pelos estudos diferem entre si, assim como as casuísticas são reduzidas. Neste estudo, foi utilizada a mesma metodologia proposta por Korshunov et al.¹³ e Ventura et al.¹⁴, utilizando-se de valores de corte superiores para deleção homozigótica, para demonstrar com precisão os casos em que o gene estava realmente ausente a hibridização in situ fluorescente.

Monossomia do PTEN foi encontrada com frequência de 17% e superior à descrita na literatura, cuja frequência chega a 5%¹⁵. Para Speicher et al.¹⁶, a monossomia no PTEN é um evento raro no subtipo de células claras, mas podendo ser detectada em até 40% casos no subtipo cromófobo. Assim, a inclusão de subtipos diferentes do carcinoma de células claras renais no estudo pode justificar a maior frequência encontrada. Na metodologia, o emprego de um valor de cut-off mais elevado e de 23% para a detecção de monossomia, permitiu a detecção de casos que realmente apresentavam monossomia, evitando assim a ocorrência de casos falso-positivos.

Considerando o CCR, Dal Clin et al.¹⁷ avaliaram através de reação de hibridização in situ, a frequência de trissomia do PTEN em 17 amostras de CCR provenientes de pacientes submetidos à nefrectomias. Trissomia foi encontrada em cinco pacientes (30%). Nos 53 analisados com a hibridização neste estudo, trissomia foi alteração infrequente e presente em somente dois pacientes (3,8%).

Em 41 amostras analisadas por hibridização in situ, Presti et al.¹⁸, demonstraram que as anormalidades cromossômicas no CCR são mais frequentes no cromossomo 3 e que corresponderam a 29% das amostras analisadas. Os cromossomos 8, 10 e 14q estavam alterados em 20% dos casos analisados. O impacto da deleção nas taxas de sobrevida não foi avaliado, porém, os autores demonstraram que a deleção dos genes não estava associada aos tumores de alto grau de Fuhrmann.

Em gliobastoma multiforme, deleção do PTEN foi detectada com frequência de 61% e determinante de menor sobrevida global em 44 casos¹³. Neste estudo, foi identificado aproximadamente 40% de deleção, observando-se menores taxas de sobrevida global e sobrevida livre de doença para os pacientes portadores da alteração molecular a hibridização. Considerando as dificuldades técnicas inerentes a reação de hibridização in situ, casuísticas maiores são necessárias para poder demonstrar com maior significância as diferenças observadas e assim o impacto negativo da presença de deleção do PTEN na evolução dos pacientes portadores de CCR.

Em conclusão, deleção do gene PTEN no CCR foi detectada com frequência de aproximadamente 40% e sua presença não foi determinante de menores taxas de sobrevida, permanecendo os fatores prognósticos tradicionais como determinantes da evolução dos pacientes.

Recebido em 05/09/2012

Aceito para publicação em 10/11/2012

Conflito de interesse: nenhum.

Fonte de financiamento: Nenhuma.

Trabalho realizado no Departamento de Anatomia Patológica e Núcleo de Urologia do Hospital A. C. Camargo Cancer Center – São Paulo – Brasil.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  24 Fev 2014
• Data do Fascículo
  Dez 2013

Histórico

• Recebido
  05 Set 2012
• Aceito
  10 Nov 2012