Resumos
Com o objetivo de isolar e identificar os sorotipos de enterovírus, agentes etiológicos mais freqüentes da síndrome de meningite asséptica, foram estudadas amostras de líquor de pacientes da unidade de saúde de referência da Cidade de Belém-PA, do período de março de 2002 a março de 2003. As amostras foram inoculadas em cultivos celulares RD e HEp-2, e as positivas identificadas por neutralização ou imunofluorescência indireta. De 249 amostras, 33 (13,2%) foram positivas sendo 57,6% (n=19) em pacientes menores de 11 anos (p<0,03) e predominantemente (72,7%) naqueles do sexo masculino (p<0,008). Os sorotipos isolados foram: Echovírus 30 (n=31), Coxsackievírus B5 (n=1) e Echovírus 30 e 4. Em conclusão, estudos deste tipo servem também para melhor compor o quadro nacional, ainda pouco definido, sobre os agentes enterovirais mais prevalentes em casos de SMA.
Enterovírus; Meningite asséptica; Líquor
With the objective of isolating and identifying enteroviral serotypes, which are the most frequent etiologic agents of aseptic meningitis syndrome, cerebrospinal fluid samples were studied from patients referred to the health unit in the City of Belém (State of Pará, Brazil), from March 2002 to March 2003. The samples were inoculated in RD and HEp-2 cells line, and the positive were identified by neutralization test or indirect immunofluorescence. Out of 249 samples, 33 (13.2%) were positive 57.6% (n = 19) in patients under 11 years of age (p <0.03) and predominantly (72.7%) in males (p <0.008). The serotypes isolated were: Echovirus 30 (n = 31), Coxsackievirus B5 (n = 1) and Echovirus 30 and 4. In conclusion, this type of study also serves to determine the national picture, which is still little defined, regarding the most prevalent viral agents in AMS cases.
Enterovirus; Aseptic meningitis; Cerebrospinal fluid
ARTIGO ARTICLE
Pesquisa de enterovírus em casos de síndrome de meningite asséptica de Belém, PA
Investigation of enterovirus in cases of aseptic meningitis syndrome of Belém, PA
Letícia Martins LamarãoI; Maria de Lourdes Contente GomesII; Lauze Lee Alves FerreiraIII; Cleide Mara FonsecaIV; Lia C.B. AraújoIV; Marquete B. SantanaIV; José Tavares-NetoV
ICurso de Pós-graduação em Medicina e Saúde da Faculdade de Medicina da Universidade Federal da Bahia, Salvador, BA
IIInstituto Evandro Chagas, Belém, PA
IIIUniversidade Federal do Pará, Belém, PA
IVUnidade Básica de Saúde do bairro da Pedreira da Secretaria-executiva de Estado da Saúde do Pará, Belém, PA
VFaculdade de Medicina da Universidade Federal da Bahia, Salvador, BA
Endereço para correspondência Endereço para correspondência Profª Maria de Lourdes Contente Gomes Seção de Virologia/IEC Av. Almirante Barroso 492 66090-000 Belém, PA Tel: 55 91 214-2018 E-mail: llamarao@uol.com.br
RESUMO
Com o objetivo de isolar e identificar os sorotipos de enterovírus, agentes etiológicos mais freqüentes da síndrome de meningite asséptica, foram estudadas amostras de líquor de pacientes da unidade de saúde de referência da Cidade de Belém-PA, do período de março de 2002 a março de 2003. As amostras foram inoculadas em cultivos celulares RD e HEp-2, e as positivas identificadas por neutralização ou imunofluorescência indireta. De 249 amostras, 33 (13,2%) foram positivas sendo 57,6% (n=19) em pacientes menores de 11 anos (p<0,03) e predominantemente (72,7%) naqueles do sexo masculino (p<0,008). Os sorotipos isolados foram: Echovírus 30 (n=31), Coxsackievírus B5 (n=1) e Echovírus 30 e 4. Em conclusão, estudos deste tipo servem também para melhor compor o quadro nacional, ainda pouco definido, sobre os agentes enterovirais mais prevalentes em casos de SMA.
Palavras-chaves: Enterovírus. Meningite asséptica. Líquor.
ABSTRACT
With the objective of isolating and identifying enteroviral serotypes, which are the most frequent etiologic agents of aseptic meningitis syndrome, cerebrospinal fluid samples were studied from patients referred to the health unit in the City of Belém (State of Pará, Brazil), from March 2002 to March 2003. The samples were inoculated in RD and HEp-2 cells line, and the positive were identified by neutralization test or indirect immunofluorescence. Out of 249 samples, 33 (13.2%) were positive 57.6% (n = 19) in patients under 11 years of age (p <0.03) and predominantly (72.7%) in males (p <0.008). The serotypes isolated were: Echovirus 30 (n = 31), Coxsackievirus B5 (n = 1) and Echovirus 30 and 4. In conclusion, this type of study also serves to determine the national picture, which is still little defined, regarding the most prevalent viral agents in AMS cases.
Key-words: Enterovirus. Aseptic meningitis. Cerebrospinal fluid.
A síndrome de meningite asséptica (SMA) é definida pela inflamação do espaço subaracnóide, caracterizada por pleocitose de células mononucleares, e causada por agentes químicos, biológicos e farmacológicos12. Todavia, a maioria dos casos tem etiologia viral, destacando-se os enterovírus (EV) que nos Estados Unidos são responsáveis por 80% dos casos de SMA com etiologia definida10.
Os enterovírus pertencem à família Picornaviridae, possuem de 28-30hm de diâmetro, genoma de RNA de fita simples e polaridade positiva e replicam-se no citoplasma das células hospedeiras (em complexos associados à membrana)10. Esses vírus possuem como características favoráveis à transmissão, principalmente feco-oral, a estabilidade em ambientes ácidos (ausência do envelope lipídico) e a resistência aos desinfetantes comuns, além de persistirem viáveis por dias à temperatura ambiente22. Como causa de doença em humanos, já foram descritos os seguintes EV: poliovírus (3 sorotipos); coxsackievírus A (Cox A, 24 sorotipos); coxsackievírus B (Cox B, 6 sorotipos), echovírus (echo, 31 sorotipos); e os enterovírus (EV) 68-7122. Mais recentemente, a nova classificação para a família Picornaviridae propõe aquela divisão em cinco grupos: poliovírus (PV); e enterovírus humanos (EH) distribuídos em 4 tipos (A, B, C e D)19.
Os echovírus (Echo) têm sido descritos como o tipo de EV mais freqüentemente associado aos casos de SMA. Estudo realizado num período de 10 anos (1988-1997), por Trallero cols27, mostrou que os Echo foram responsáveis por 90% dos 727 casos identificados como EV não-pólio, sendo os sorotipos mais prevalentes os Echo 30, 9, 6 e 4. Chomel cols9 encontraram 3 sorotipos de Echo (30, 13 e 6) durante surto ocorrido em 2000 na França. Atkinson cols2, em Londres, destacaram como os mais prevalentes os Echo (19, 11, 9, 7) e o coxsackievírus (Cox) A9. Em Cuba, Bello cols4 identificaram o Cox B5 como responsável pelo surto ocorrido no ano de 1995. Nos Estados Unidos, segundo os dados publicados pelo Center for Disease Control and Prevention (CDC), há ocorrências de surtos atribuídos ao Echo 9 e 30, durante o ano de 2003, e também por outros sorotipos (Cox B1, B4, A9; Echo 9, 7, 5 e EV-71)7.
Embora a faixa etária mais atingida pelos EV seja até a idade de 15 anos1 20, existem relatos de casos em pessoas na idade adulta18 23. No Brasil, ainda são poucos os estudos sobre a etiologia viral em casos de SMA. Em 1967, a partir de 40 casos clínicos de SMA em hospital da Cidade de São Paulo, foi descrito o poliovírus como o agente etiológico11. Na Cidade do Rio de Janeiro, Bedoya cols3 também descreveram a etiologia pelos EV em 21,8% das 188 amostras de líquor provenientes de pacientes com SMA do Hospital São Sebastião, no período de 1996 a 1997. Em 1998, ocorreram 2 surtos de SMA atribuídos ao Echo 30, um na Cidade de São Paulo26 e outro em Londrina-PR14, sendo esse vírus isolado, respectivamente, em 57% e 43% das amostras de líquor dos pacientes. Na Cidade de Salvador-BA, Silva cols25 relataram o provável envolvimento dos EV em 112 casos de SMA, com comprovação sorológica em 60% dos mesmos e pelos seguintes sorotipos: Echo (4 e 9), Cox B (2, 3 e 6) e EV-71.
Também, considerando-se a relevância para o sistema nacional de vigilância virológica em se obter mais informações sobre os EV no Brasil, especialmente na região Norte do País, este estudo teve por objetivo caracterizar quais os EV envolvidos em casos de SMA, provenientes de unidade de saúde de referência da Cidade de Belém, PA.
MATERIAL E MÉTODOS
Neste estudo transversal, foram utilizadas amostras de líquor de pacientes com suspeita clínica de SMA, atendidos no período de março de 2002 a março de 2003, na Unidade Básica de Saúde (UBS) do bairro da Pedreira, em Belém-PA, credenciada pela Secretaria de Estado da Saúde como referência para os casos suspeitos de infecção do sistema nervoso central (SNC), e procedentes de todos os municípios da região metropolitana de Belém. Os pacientes, ou seus responsáveis legais, receberam informações sobre a SMA, assim como do objetivo da pesquisa a ser realizada, sendo incluídos no estudo somente aqueles que concordaram em participar e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.
Os seguintes dados clínico-epidemiológicos foram extraídos da ficha de investigação do Sistema Nacional de Agravos de Notificação (SINAN): sexo; idade; cidade da residência e, se em Belém, o bairro; duração do quadro clínico que motivou a consulta na UBS-Pedreira; quadro clínico apresentado no primeiro atendimento na unidade de saúde (cefaléia, febre, vômito, convulsão, rigidez de nuca, sinais de irritação meníngea, abaulamento de fontanela e caracterização do exantema); e se houve hospitalização.
O líquor, após coletado por médico da UBS-Pedreira, foi separado em duas alíquotas, sendo uma delas encaminhada ao Laboratório da própria UBS-Pedreira para a realização dos exames: bioquímica (glicose e proteínas); celularidade (número de células/mm3 e a porcentagem de linfo-mononucleares e polimorfonucleares) e microbiológicos (Gram, tinta da China e culturas para bactérias piogênicas e o Mycobacterium tuberculosis). A segunda alíquota foi congelada, de imediato, em uma ampola de nitrogênio líquido e enviada, sob congelamento, para o laboratório da Seção de Virologia do Instituto Evandro Chagas (IEC) em Ananindeua-PA, onde foram conservadas a 70ºC. Posteriormente, só foram utilizados os espécimes com todos aqueles exames microbiológicos negativos e o diagnóstico enteroviral foi realizado pelo método "padrão-ouro" (gold-standard), de isolamento viral em cultivo celular e identificação por neutralização com soros sorotipos-específicos13.
Isolamento viral. Para cada amostra, foi inoculado 0,1ml de líquor em tubo contendo cultivo celular de linhagem contínua e sensível aos EV13: RD (rabdomiossarcoma embrionário humano); e HEp-2 (carcinoma epidermóide de laringe humana). Ambos os meios de cultivos foram mantidos em meio enriquecido com 1,5g/l de bicarbonato de sódio, 2% de glutamina 200mM, 1% de hepes 1M, 10% de soro bovino fetal, 0,1% de penicilina (100.000u/ml) e estreptomicina (100.000mg/ml). Esse meio, no momento da inoculação do espécime, foi trocado por outro de composição semelhante exceto pela concentração de soro bovino (2%) e o acréscimo de 0,06% de anfotericina B (Fungison®) na concentração de 5.000mg/ml. Após esse procedimento, os tubos foram mantidos em estufa (37ºC) e o cultivo observado no microscópio de inversão durante nove dias, buscando alterações celulares morfológicas, e quando presentes, caracterizadas como efeito citopático (ECP) provocado por EV. As culturas positivas, foram congeladas antes da total destruição (aproximadamente 70% de ECP) da camada celular para a posterior etapa de titulação e identificação viral ou preparação de lâminas para a imunofluorescência indireta (IFI); quando negativas (sem ECP), foram congeladas e descongeladas três vezes para a destruição celular e liberação de possíveis partículas virais, sendo a suspensão inoculada novamente em cultivo celular (segunda passagem, seguindo os mesmos procedimentos anteriores).
Identificação viral. Os EV isolados foram inicialmente titulados (diluições seriadas de 10x) para conhecimento da dose ideal (±100TCD50/ml) a ser utilizada no teste de neutralização em cultivo celular13. As amostras foram testadas com soros imunes para poliovírus e posteriormente com soros sorotipos-específicos para EV não-pólio. Para as amostras não-tipadas nesse teste, sugestivo da presença de mais de um sorotipo15, utilizou-se a imunofluorescência indireta (IFI; "kit" CHEMICON®), seguindo-se as orientações do fabricante.
Análise estatística. O banco de dados foi elaborado e analisado no programa SPSS (versão 9.0). Para as variáveis não-paramétricas utilizou-se o teste do qui-quadrado ou teste de Mann-Whitney, e nas variáveis quantitativas com distribuição normal, o teste t de Student. Nessas análises, estabeleceu-se o intervalo de confiança (IC) de 95% e os resultados foram considerados estatisticamente significativos quando o valor da probabilidade (p) de alfa (erro I) foi <0,05 (5%).
RESULTADOS
No período do estudo, a UBS-Pedreira investigou 1.046 pacientes com suspeita de infecção do SNC, dos quais 23,6% tiveram o agente etiológico identificado (bactérias ou fungos). Dos 799 (76,4%) pacientes com exames microbiológicos negativos, foram excluídos aqueles com residência em municípios não pertencentes à região metropolitana de Belém (37,2%); e dados clínicos incompletos ou amostra de líquor com quantidade insuficiente (31,7%). Foram incluídos no estudo 249 (31,1%) amostras de pacientes, com limites de idade de 1 mês e 75 anos (média de 15,3 ± 14,4 e mediana de 10,5 anos) e proporção sexual de 49% (n=122) do sexo feminino e 51% (n=127) do masculino. Nos 249 casos, a duração do quadro clínico que justificou o exame do líquor variou de 1 a 20 dias (média de @ 3 e mediana de 1 dia), e 25 casos (10%) foram hospitalizados. Em relação ao local de residência: 172 (69,1%) moravam em bairros centrais de Belém; 66 (25,5%) em bairros periféricos e 11 (4,4%) em outros municípios da região metropolitana de Belém. Os dados clínicos mais freqüentemente observados ou referidos foram: cefaléia (96,5%; n=201), febre (89,2%), vômito (71,5%), rigidez de nuca (49,4%) e, nos menores de 12 meses de idade (n=17), o abaulamento da fontanela (47%).
Na análise dos dados liquóricos, foram excluídos 2 pacientes por falta de informações conclusivas. De 247 pacientes, foi constatado que 126 (50,6%) apresentavam alguma anormalidade no líquor, na bioquímica e/ou na celularidade: a glicose variou de 10 a 110mg/dl (média de 54,5 ± 20,8); proteínas de 4 a 127mg/dl (média de 29,7± 20,8); média de celularidade de 109,7 células por mm3, com limites de 1 e 2.133 e ampla variação em torno da média (desvio padrão de ± 243,4); e só 9 (3,6%) pacientes tiveram percentual de polimorfonucleares acima de 50%, mas em 96,4% (n=238) houve predominância (>50%) de linfo-mononucleares.
A pesquisa de EV foi positiva em 33 (13,2%) amostras, sendo os sorotipos identificados: Echo 30 (n=31); Cox B5 (n=1); e uma amostra com dois sorotipos de Echo (30 e 4, pelo método da imunofluorescência indireta). A maioria (78,8%; n=26) dos Echo 30 provocou ECP nas duas linhagens celulares; os outros 5 casos de Echo 30, em 3 ocorreu ECP só na HEp-2 e em 2 na RD. Também, a amostra com Echo 30 e 4 provocou ECP em ambas as linhagens, enquanto o caso com Cox B5 só na HEp-2.
Quanto ao isolamento de EV, os pacientes foram divididos em dois grupos: positivo (se presente o EV) e negativo. Na Tabela 1, observa-se que houve significativamente mais casos (p<0,008) positivos nas pessoas do sexo masculino (72,7%) e em menor proporção (p<0,03) na faixa etária de 22 a 75 anos (9,1%). Foi semelhante (p>0,08) a distribuição espacial dos EV-positivos e negativos, mas ao comparar aqueles residentes nos bairros centrais versus bairros periféricos mais o de outros municípios, houve predominância de EV-positivo entre os primeiros (p<0,04). A duração da doença, relatada no primeiro atendimento na UBS-Pedreira, dos casos positivos foi semelhante a dos negativos (p>0,24), apesar dos EV-positivos (66,7%) serem mais freqüentes entre aqueles com duração de até 24 horas, mas sem significado estatístico (p>0,09). A hospitalização foi significativamente (p<0,05) mais freqüente entre os casos EV-positivos (21,2%) do que nos EV-negativos (8,3%).
As freqüências dos dados clínicos (cefaléia, febre, rigidez de nuca, etc), mostradas na Tabela 2, foram semelhantes em ambos os grupos, exceto a história de vômitos que foi mais freqüente (p<0,03) nos pacientes EV-positivos.
No líquor, o número de células >5 células/mm3 ocorreu mais significativamente (p<0,00005) nos casos EV-positivos (75,8% vs. 37,9%), sendo mais predominante (p<0,0002) a proporção >50% de linfo-mononucleares nos casos EV-negativos (98,6% vs. 81,8%), como mostra a Tabela 3, e a maior freqüência (18,2%; n=6) daqueles com polimorfonucleares >50% entre os EV-positivos. A concentração de proteínas (p>0,57) e glicose (p>0,26) não diferiu entre os casos de SMA com EV-positivo e negativo.
DISCUSSÃO
A freqüência de positividade de EV, observada neste estudo, de 13,3%, e em período não-epidêmico, foi inferior à freqüência encontrada por Silva cols25 na Cidade de Salvador (BA), onde o envolvimento dos EV foi comprovado em 26,7% dos casos de SMA, sendo 30,7% identificados pelo método da RT-PCR, enquanto pelo método de isolamento em cultivo celular, utilizado no presente estudo, apenas 7,5% das amostras virais foram identificadas. Aqueles dados25 indicaram a maior sensibilidade da RT-PCR como método de identificação viral, também mencionada em outros estudos8 24, atualmente bastante utilizado no diagnóstico das enteroviroses. Não obstante, na amostra de Salvador o congelamento e as condições de transporte dos espécimes podem não ter sido satisfatórios, o que possa melhor explicar a baixa freqüência de isolamento viral (J Tavares-Neto: comunicação pessoal).
Os sorotipos de EV encontrados no presente estudo (Echo 30, 4 e Cox B5) são semelhantes aos descritos em casos de SMA2 4 25 27. A predominância encontrada de Echo 30 (78,8%) reforça as observações de outros estudos como sendo um dos sorotipos etiológicos principais da SMA7 8 17 20. No Brasil, o Echo 30 foi responsável pela ocorrência de 2 surtos: um na Cidade de São Paulo e outro em Londrina-PR, de acordo com os achados, respectivamente, de Timenetsky cols26 e Jóia cols14.
Quanto à predominância observada (72,7%), de pacientes do sexo masculino entre os EV-positivos, Bernit cols5 também constataram resultado semelhante (64,4%) em um surto de SMA atribuído ao Echo 30, assim como Ozkaya cols17 (66%). Isso pode ser em decorrência da maior exposição das crianças do sexo masculino a fatores ambientais que favorecem a infecção por EV. Não obstante, esse achado necessita ser mais adequadamente investigado.
A predominância observada (90,9%) de pacientes EV-positivos com idade até 21 anos é concordante com outros relatos da literatura6 10 12 22. Apesar da mais baixa freqüência de EV (9,1%) nas pessoas com mais de 21 anos, Nowak cols16 verificaram em 43 pacientes adultos com SMA a proporção de 44% tendo como agente etiológico algum EV.
Gomes cols12 também assinalaram a inespecificidade do quadro clínico da SMA, como também observado neste estudo. O encontro da maior freqüência de relato de vômitos nos pacientes EV-positivos (87,8%) pode ser um resultado casual em decorrência do maior número de crianças menores de 11 anos, grupo sabidamente com mais relatos de queixas gastro-intestinais no curso de síndrome febril.
Em relação aos dados liquóricos, embora a proporção >50% de linfo-mononucleares apresentar-se em maior predominância nos casos EV-negativos (98,6% vs 81,8%), constatou-se que dentre os pacientes EV-positivos houve maior proporção daqueles com polimorfonucleares >50% (18,2% vs 1,4%). No entanto, outros estudos10 12 descrevem a pleocitose da meningite enteroviral constituída pela maior proporção de células linfo-mononucleares. Porém, como a maioria (66,7%) dos pacientes EV-positivos, deste estudo, estava entre aqueles com a amostra de líquor coletada durante as primeiras 24 horas da doença, a celularidade na fase inicial do processo patológico pode ter sofrido a influência de alguma característica não investigada. Nesse sentido, Sawyer cols24 e Rice cols21 descrevem que a maior porcentagem de polimorfonucleares no líquor de pacientes com SMA é inversamente proporcional ao tempo de doença antes da punção lombar.
A maior taxa de hospitalização entre os pacientes EV-positivos pode evidenciar a presença de indicadores clínicos de maior gravidade nestes casos, mesmo considerando ser a meningite enteroviral tipicamente benigna, de curso clínico autolimitado e raramente associada ao pior prognóstico12 18.
A identificação de EV em amostras de pacientes com SMA e os sorotipos isolados (Echo 30, 4 e Cox B5), são achados relevantes não só por confirmar a circulação dos mesmos na região Norte do País, como ao constatar que o sorotipo Echo 30 é o mais freqüente, agente etiológico da SMA, à semelhança das observações em outras regiões do País14 26.
Recebido para publicação em 30/9/2004
Aceito em 27/6/2005
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Datas de Publicação
-
Publicação nesta coleção
12 Set 2005 -
Data do Fascículo
Out 2005
Histórico
-
Aceito
27 Jun 2005 -
Recebido
30 Set 2004