Detecção e análise da variabilidade de seqüências do Banana streak virus (BSV) em bananeiras no Brasil

Detection and analysis of Banana streak virus (BSV) sequences variability of banana from Brazil

ARTIGOS

Detecção e análise da variabilidade de seqüências do Banana streak virus (BSV) em bananeiras no Brasil

Detection and analysis of Banana streak virus (BSV) sequences variability of banana from Brazil

Daniel Figueiredo^I,*,**; Paulo Meissner Filho^II; Sebastião Silva Neto^III; Paulo Brioso^I,**

^ILaboratório de Virologia Vegetal e Viróides/DenF/IB/UFRRJ, Caixa Postal 74585, 23851-970, Seropédica, RJ, <[e-mail]>

^IIEMBRAPA/CNPMF, Caixa Postal 007, 44380-000, Cruz das Almas, BA; ^IIICAMPO Biotecnologia Vegetal Ltda. Caixa Postal 250, 38600-000, Paracatu MG

RESUMO

A técnica de PCR utilizando-se "primers" degenerados para o gênero Badnavirus foi utilizada para a detecção e análise da variabilidade de seqüências do Banana streak virus (BSV) provenientes de bananeiras. A partir desta metodologia seqüências do vírus puderam ser detectadas em cultivares diplóides (AA), triplóides (AAA; AAB) e tetraplóides (AAAB). Foram encontrados quatro padrões de seqüência do BSV (estirpes BSVBR-1, BSVBR-2, BSVBR-3 e BSVBR-4), diferenciadas através da análise do perfil eletroforético das amostras amplificadas. A estirpe BSVBR-1 prevalece nos estados do Acre, Amazonas, Bahia, Ceará, Goiás, Minas Gerais, Piauí, Rio de Janeiro, Rondônia, Santa Catarina, e São Paulo, enquanto que, a estirpe BSVBR-2 foi encontrada em amostras oriundas do Amazonas e do Ceará. As estirpes BSVBR-3 e BSVBR-4 foram encontradas apenas no Ceará. Este trabalho revela a presença de diferentes estirpes do BSV no Brasil, bem como a existência de cultivares de bananeiras sadias e livres de seqüências virais do BSV integradas ao seu genoma.

Palavras-chave adicionais:Musa spp., "Polymerase Chain Reaction", PCR.

ABSTRACT

PCR assay using degenerate primers, designed to Badnavirus genus, was used to detect and analyse the variability of BSV strains sequences from banana. The virus was detected in diploid (AA), triploids (AAA; AAB) and tetraploids (AAAB) banana cultivars. Four BSV sequences patterns (BSVBR-1, BSVBR-2, BSVBR-3 and BSVBR-4 strains) were found, and distinguished by eletrophoresis. The strain BSVBR-1 was found in the states of Acre, Amazonas, Bahia, Ceará, Goiás, Minas Gerais, Piauí, Rio de Janeiro, Rondônia, Santa Catarina and São Paulo, while BSVBR-2 strain was detected in the states of Amazonas and Ceará. BSVBR-3 and BSVBR-4 strains were found only in the state of Ceará. This work demonstrated the presence of different BSV strains in Brazil and the existence of health banana cultivars as well as cultivars free of BSV integrated sequences.

Additional keywords: Musa spp., "Polymerase Chain Reaction", PCR.

A bananeira(Musa spp.) é uma das fruteiras mais cultivadas nos países tropicais e seus frutos representam a quarta mais importante mercadoria comercializada no mundo (8). O Brasil destaca-se como o segundo produtor mundial (11).

O Banana streak virus (BSV) tem se tornado um dos mais importantes vírus em bananeiras e plátanos por ser distribuído em mais de 40 países da África, Ásia, Europa, Oceania e Américas do Sul e Central (10) e pelo fato de evidências indicarem a integração de seqüências do genoma de Musa, causando problema no intercâmbio de germoplasma (6, 7, 12).

O Banana streak virus pertence ao gênero Badnavirus, estando atualmente classificado na família Caulimoviridae (14). É disseminado na natureza de forma não circulativa pelas cochonilhas Planococcus citri Russo e Saccharicoccus sacchari Ckll (Hemiptera: Pseudococcidae). As partículas virais são baciliformes, não envelopadas, medindo de 120 a 150 nm de comprimento por 23 a 30 nm de diâmetro, contendo um dsDNA circular de aproximadamente 7,4 kpb (14).

As bananeiras infectadas com o BSV podem apresentar sintomas de riscas foliares, lesões foliares cloróticas, mosaico, má formação dos frutos e diminuição do cacho (10). Tais sintomas podem ser confundidos com aqueles causados pelo Cucumber mosaic virus (CMV), e aparecem esporadicamente, podendo estarem ausentes por muitos meses (9).

Segundo Lockhart & Olszewski (9), os principais métodos disponíveis para a indexação de vírus em bananeiras e em plátanos são a inspeção visual, baseada na observação de sintomas; detecção por microscopia eletrônica das partículas virais em extratos; indexação biológica; detecção do dsRNA viral por eletroforese e métodos sorológicos. Entretanto, tais metodologias podem levar a resultados falsos negativos quando aplicadas na detecção do BSV. Além disto, o BSV apresenta um alto grau de heterogeneidade genômica e sorológica entre seus isolados (9). Tal heterogeneidade impõe uma séria restrição quanto a utilização de técnicas sorológicas e moleculares para a sua detecção em germoplasma de Musa.

No mundo, o BSV foi descrito infectando bananeiras dos grupos AA, AB, AAA, AAB, AABB e AAAB. No Brasil, o BSV só foi relatado nas cultivares Mysore e Pacovan (AAB) e, até o momento, nenhuma técnica molecular de diagnóstico tem sido empregada para a detecção e controle deste vírus no território nacional (2, 10). Em vista disso, este trabalho teve por objetivo detectar e analisar a variabilidade de seqüências do BSV amplificadas por PCR, provenientes de onze estados brasileiros.

MATERIAL E MÉTODOS

Coleta de amostras

Amostras foliares de bananeira de diferentes cultivares, oriundas do campo e de cultura de tecido, com ou sem sintomas, foram coletadas em diferentes localidades dos estados do Acre, Amazonas, Bahia, Ceará, Goiás, Minas Gerais, Piauí, Rio de Janeiro, Rondônia, Santa Catarina e São Paulo, sendo acondicionadas em sacos plásticos, etiquetadas e mantidas à temperatura de -20ºC até uso.

Como controle positivo foi utilizado um isolado do BSVoriundo de folhas infectadas de bananeira 'Mysore', proveniente de Piracicaba (SP), em infecção mista com o Cucumber mosaic virus (2).

Extração do DNA total de bananeira

Na purificação do DNA total das amostras coletadas foi utilizado o produto DNAzol (Life Technologies do Brasil Ltda), e a metodologia do processo foi realizada conforme a recomendação do fabricante. Na quantificação do DNA total extraído foi adotado o coeficiente de densidade ótica (DO), onde 1 DO corresponde a 50 µg DNA/ml ao comprimento de onda de 260 nm (13). O produto extraído foi visualizado através de eletroforese, à voltagem constante de 80 volts por 30 minutos, à temperatura ambiente, em gel de agarose a 1 % (p/v) contendo brometo de etídio (5 mg/ml).

Teste de PCR

Para a reação de PCR foram adicionados em um tubo de polipropileno (0,2 ml) 5 ml de tampão 10X PCR da enzima Taq DNA polimerase, 3 ml da mistura de dNTP (2,5 mM dATP + 2,5 mM dCTP + 2,5 mM dGTP + 2,5 mM dTTP), 50 pmoles do oligonucleotídeo "BADNA 2" (1) e 50 pmoles do oligonucleotídeo "MYS 3'" (1), 2 ml de MgCl2 50 mM, 1.25 U DNA polimerase (Taq DNA pol, Life Technologies do Brasil Ltda), 100 ng de DNA e água destilada estéril para 50 ml de volume final. O tubo foi colocado no termociclador programável PTC-200 (MJ Research), realizando um ciclo inicial de 94 ºC/5 minutos, 42 ºC/2 minutos, 72 ºC/3 minutos; 25 ciclos de 94 ºC/1 minuto, 42 ºC/2 minutos, 72 ºC/3 minutos e, um ciclo final de 94 ºC/1 minuto, 42 ºC/2 minutos, 72 ºC/10 minutos.

Os produtos amplificados foram visualizados através de eletroforese em gel de agarose a 1,0 % (p/v), contendo brometo de etídeo.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

No levantamento nacional parcial foram coletadas 95 amostras foliares de bananeiras, com ou sem sintomas de infecção viral (Tabela 1). De todas as amostras analisadas foi possível extrair o DNA total a partir das folhas de bananeira, sendo estes visualizados em gel de agarose 1% (p/v), corado com brometo de etídio. Este DNA foi utilizado para as reações de PCR.

Das 95 amostras coletadas, 59 foram positivas no teste de PCR (Tabela 1). Entretanto, apenas 35 apresentavam sintomas foliares de infecção pelo BSV na época da coleta (Tabela 1). Os dados apresentados demonstraram que a ausência de sintomas não se correlaciona, por vezes, com os resultados obtidos na reação de PCR. Isto pode ser explicado devido a esporadicidade dos sintomas causados pelo BSV, sendo algumas vezes mais pronunciados durante a estação fria do ano (4). Além disso, os sintomas causados pelo CMV são muito semelhantes àqueles causados pelo BSV (9).

As amostras positivas provenientes do Acre, do Amazonas, da Bahia, do Ceará, ('Prata Anã' e 'Maçã'), de Goiás, do Piauí, do Rio de Janeiro de Rondônia e de São Paulo que foram amplificadas utilizando os "primers" degenerados (BADNA 2 e MYS 3'), mostraram um padrão de amplificação contendo fragmentos de aproximadamente 750 pb (Figura 1A). O mesmo padrão foi obtido a partir do controle positivo (Figura 1A). Entretanto, três amostras tetraplóides, oriundas do Ceará e uma triplóide do Amazonas (Tabela 1) apresentaram produtos amplificados com padrões distintos daqueles observados nas demais amostras (Figura 1B).

A partir do perfil eletroforético dos produtos amplificados observou-se a presença de, pelo menos, quatro padrões de seqüências amplificadas para o BSV no território nacional, e desta forma correspondentes a quatro estirpes do vírus. Estas estirpes foram denominadas de BSV-BR1, de BSV-BR2, de BSV-BR3 e de BSV-BR4 (Figura 1B).

A estirpe BSV-BR1 foi encontrada nas amostras do Acre, Amazonas, Bahia, Ceará ('Prata Anã' e 'Maçã'), Goiás, Minas Gerais, Piauí, Rio de Janeiro, Rondônia e São Paulo. A BSV-BR2 foi detectada em amostras provenientes do Amazonas ('Prata Zulu') e Ceará ('Pacovan Apodi'). Já BSV-BR3 e BSV-BR4 foram encontradas somente nas amostras provenientes do Ceará, nas cultivares FHIA-21 e PV-03-44, respectivamente.

A análise destes resultados demonstra que os padrões eletroforéticos do BSV nas amostras da Bahia são similares aqueles do Acre, Goiás, Minas Gerais, Piauí, Santa Catarina, São Paulo, Rio de Janeiro e Rondônia, o que reforça a idéia de que as cultivares de bananeiras infectadas com o BSV nesses estados têm, possivelmente, a mesma origem. Contudo, pode-se inferir que os estados do Amazonas e do Ceará tenham recebido cultivares de bananeiras de outras localidades.

Relatos recentes vêm demonstrando que, quando alguma Musa spp. (bananeiras ou plátanos) é propagada por cultura de tecido, as plantas resultantes podem desenvolver infecções com o BSV (7, 12). O seqüenciamento e clonagem do DNA genômico da cultivar de plátano Obino I'Ewai revelou uma interface entre as seqüências do BSV e Musa, e um complexo BSV integrante denominado EPRV ("Endogenous pararetrovirus sequences") (7). A comparação entre o DNA do vírion presente em infecções naturais e o DNA "episomal" de infecções associadas à cultura de tecidos de diferentes Musa spp. revelou que ambos foram altamente similares, se não idênticos (12). Relatos adicionais demonstram que as seqüências capazes de originar infecção episomal estão integradas somente no genoma B e que seqüências integradas no genoma A aparentemente não se expressam (5).

Estes trabalhos sugerem que todas as bananeiras híbridas, portadoras do genoma B, estariam potencialmente infectadas com o BSV, e que a única maneira de diagnosticar a presença do BSV em infecção episomal, ou seja, detectar a presença de vírions que poderiam ocasionar sintomas, seria através de PCR de imunocaptura. Entretanto, tais trabalhos não levam em consideração a grande variação antigênica existente entre os isolados do BSV. A mesma variação que levou os pesquisadores Lockhart & Olszewski (9) a afirmarem que técnicas sorológicas seriam ineficientes no diagnóstico do BSV podendo revelar resultados falsos negativos. Além do mais, estes trabalhos não se baseiam em grandes amostragens de diferentes localidades, para realmente poderem afirmar que todas as bananeiras portadoras do genoma B apresentam EPRVs.

Em nossos resultados encontramos 36 amostras de diferentes localidades que apresentaram resultado PCR negativo, sendo um considerável número destas bananeiras híbridas, triplóides e tetraplóides (Tabela 1). Este resultado sugere que a integração das EPRVs no genoma de Musa,provavelmente, não se deu em momentos iniciais da história evolutiva da planta e que há possibilidade de que matrizes livres de BSV ainda sejam encontradas.

Neste trabalho, o DNA utilizado foi extraído diretamente das folhas das bananeiras, dispensando etapas de purificação ou semi-purificação viral. Tal procedimento garante um diagnóstico mais preciso de seqüências do BSV, pois deste modo seqüências integradas no genoma de Musa e procedentes de infecção "episomal" ou natural, poderão ser detectadas. Porém, apresenta a desvantagem de não se poder distinguir entre o que é originário do vírion ou de seqüências integradas. Os "primers" utilizados para a reação são degenerados, ou seja, desenhados a partir de seqüências consenso conservadas para o gênero Badnavirus, o que sobrepõe os problemas associados a variabilidade genômica encontrada entre os isolados do BSV (1).

No Brasil, até então, o BSV só havia sido detectado em bananeiras do grupo genômico AAB ('Mysore' e 'Pacovan') (2, 3). Nos resultados obtidos detectou-se, molecularmente, seqüências do BSV pela primeira vez no país nos grupos genômicos AA, AAA, ABB e AAAB (Tabela 1). Isto demonstra que o vírus e/ou seqüências do BSV podem estar amplamente distribuídos no território nacional devido ao modo de propagação da bananeira. No entanto, a ausência do vírus em diferentes amostras, indica que existe a possibilidade de se obter mudas livres de vírus desde que se intensifique um programa de certificação de mudas de bananeira.

Assim, a metodologia empregada neste trabalho se mostra uma poderosa ferramenta, que poderá ser utilizada para garantir o movimento seguro de germoplasma e diagnosticar a presença em potencial do BSV em bananeiras oriundas de campo ou de cultura de tecidos. Esta medida poderia contribuir para o aumento do plantio de mudas sadias e, conseqüentemente, para o aumento da produção, atendendo tanto ao mercado interno quanto ao externo.

Data de chegada: 23/03/2004. Aceito para publicação em: 20/09/2004.

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Parte da dissertação de Mestrado do primeiro autor, Pós-Graduação em Biotecnologia Vegetal/UFRJ;

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Bolsista do CNPq.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  23 Out 2006
• Data do Fascículo
  Jun 2006

Histórico

• Recebido
  23 Mar 2004
• Aceito
  20 Set 2004