Evidencias microscópicas y moleculares de la presencia de fitoplasmas en plantas de murta (Ugni molinae Turcz: ) afectadas por la enfermedad "escoba de bruja"

Microscopic and molecular evidence of phytoplasma in murta plants (Ugni molinae Turcz: ) affected by witches'-broom disease

SHORT COMMUNICATION COMUNICAÇÃO

Evidencias microscópicas y moleculares de la presencia de fitoplasmas en plantas de murta (Ugni molinae Turcz.) afectadas por la enfermedad "escoba de bruja"

Microscopic and molecular evidence of phytoplasma in murta plants (Ugni molinae Turcz.) affected by witches'-broom disease

Nancy Andrade S.^I; María Villagra H.^I; Nolberto Arismendi S.^II

^IInstituto de Producción y Sanidad Vegetal, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Austral de Chile, Isla Teja s/n, Casilla 567, Valdivia, Chile

^IIEscuela de Graduados, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Austral de Chile, Isla Teja s/n, Casilla 567, Valdivia, Chile

RESUMEN

La murta o murtilla (Ugni molinae Turcz., Myrtaceae), es un arbusto frutal siempre verde, nativo de Chile. Su fruto es una baya globosa muy aromática y sabrosa, de gran potencial en consumo fresco e industrializado. El arbusto presenta en el follaje una enfermedad caracterizada por una incontrolable ramificación conocida como "escoba de bruja", siendo la más común y destructiva, la cual podría estar relacionada con un agente biótico. Se realizaron cortes histológicos en tejidos con y sin síntomas de la enfermedad, los cuales se visualizaron mediante microscopía electrónica de transmisión. Se observó la presencia de microorganismos pleomórficos similares a fitoplasmas en los tejidos del floema en plantas enfermas. Pruebas moleculares mediante PCR permitieron confirmar la presencia de estos procariontes en tejidos enfermos, pero no en plantas asintomáticas, lo cual sugiere que estos microorganismos podrían estar asociados como agentes causales de la enfermedad escoba de bruja en murta. En futuros trabajos se espera obtener la identificación de este fitoplasma, sus vectores y dispersión en el sur de Chile.

Palabras clave: Myrtaceae, molicutes, diagnosis, TEM, PCR.

ABSTRACT

The murta or murtilla (Ugni molinae Turcz., Myrtaceae) is an evergreen shrub fruit native to Chile. Its fruit is an aromatic and tasty globose berry, great potential as a fresh product and for industrialized production. The most common and destructive disease of the foliage of this shrub is characterized by uncontrolled branching and known as "witches'-broom" disease; this could be related to a biotic agent. Histological cuts were made in tissues with and without symptoms of the disease, which were visualized by transmission electron microscopy. Pleomorphic microorganisms similar to phytoplasma in phloem tissue of diseased plants were seen. PCR molecular testing confirmed the presence of these prokaryotes in diseased tissues, but not in asymptomatic plants, suggesting that these microorganisms could be associated as causal agents of witches'-broom disease in murta. Future research is expected to identify this phytoplasma, its vectors and its dispersion in southern Chile.

Keywords: Myrtaceae, Mollicutes, diagnosis, TEM, PCR.

La murta (Ugni molinae Turcz., Myrtaceae), también conocida como murtilla, es una especie nativa de Chile. Es un arbusto frutal siempre verde, que se encuentra distribuido entre las regiones del Maule y Aysen, especialmente en la cordillera de la Costa y parte de la precordillera Andina (Seguel & Torralbo, 2004). Su fruto es una baya globosa muy aromática y sabrosa, por lo cual presenta gran potencial productivo teniendo amplias posibilidades en el mercado interno y externo a través de productos con diferentes grados de industrialización. La industrialización de este arbusto frutal y el cultivo comercial, implica necesariamente, el desarrollo de programas de investigación dirigidos a determinar los factores que favorecen y afectan su producción. Esto último ha permitido observar que uno de los factores más destructivos y común, es la enfermedad denominada "escoba de bruja" (Figura 1A). La cual se caracteriza por una gran reducción en el tamaño de los brotes y en la proliferación excesiva de estos; las hojas se empequeñecen y aprietan adquiriendo una coloración rojiza a amarillenta, no permitiendo el desarrollo de frutos y cuando lo hacen presentan mal sabor. La aparición de esta enfermedad es discutible, pero los primeros reportes se hacen notar a inicio de los 80´s. Novoa (1982), observa una sintomatología común y destructiva, que provoca "enanismo de brotes" o una formación de tipo de "escoba de bruja" en vástagos de murta y que según sus observaciones bajo microscopio, no encontró evidencias de insectos ni de hongos, por lo que supuso ser una infección viral. En realidad, esta sintomatología puede estar relacionada con varios factores bióticos o abióticos, pero comúnmente se la relaciona con infecciones producidas por fitoplasmas, los cuales han sido reportados en diferentes regiones del mundo, ejemplos de esto son los trabajos de Ghosh et al., 1999; Griffiths et al., 1999; Chapman et al., 2001; Montano et al., 2001; Barros et al., 2002; Khan et al., 2002; Marcone et al., 2004, entre otros. Estos microorganismos son procariontes (clase Mollicute) intracelulares y restringidos al floema de las plantas, en donde han sido reportados en cientos de especies, muchas de ellas de importancia agronómica (Lee et al., 2000; Bertaccini, 2007). Los fitoplasmas son parásitos obligados que se desarrollan y reproducen asexualmente en el citoplasma de las células de sus hospederos (insectos y plantas) (Leeet al., 2000; Weintraub & Beanland, 2006). Por esta condición, ha sido difícil su cultivo en condiciones in vitro, lo cual limita su caracterización o identificación (Lee et al., 2000). Una de las formas más comunes en determinar la presencia de fitoplasmas en los tejidos afectados es mediante la microscopía electrónica de transmisión (TEM), la cual permite observar en forma localizada la presencia de fitoplasmas, como también de partículas virales, ritcketsias y bacterias (Fránová et al., 2007). Por otra parte, las técnicas moleculares basadas en la reacción en cadena de polimerasa (PCR) con la utilización de partidores (iniciadores) universales y específicos para fitoplasmas, en función de los genes 16S rRNA, región intergénica y 23S rRNA, que son ampliamente utilizados para la detección de estos procariontes (Smart et al., 1996; Heinrich et al., 2001). De acuerdo con estas herramientas, se planteó como objetivo determinar la presencia de fitoplasmas en plantas de murta afectadas por la enfermedad escoba de bruja.

 

Se recolectaron 30 ramillas de murta con y sin la presencia de síntomas de escoba de bruja (Figura 1A-B), en murtales que crecen en forma natural en los sectores de Los Notros de Curillanco, Arboretum Fundo Teja Norte y Estación Experimental Santa Rosa de la Universidad Austral de Chile, comuna de Valdivia (S 39º49'; O 73º14'), durante los años 1999 y 2000. Las preparaciones para observar en el microscopio electrónico de transmisión (TEM) (Hitachi, H700) se realizaron de acuerdo a la metodología adaptada de Bertaccini et al., (1999). Ramillas, pecíolos y hojas fueron cortadas en trozos de ± 1 cm de largo. Luego, estos trozos se introdujeron en un buffer fijador (buffer fosfato 0.05 M a pH 7.0 y glutaraldehido al 2.5%), los cuales se dejaron reposar por ± 15 h a temperatura ambiente (20ºC). Posteriormente, las muestras se lavaron (3 veces) en el mismo buffer fijador, seguido de un buffer post fijador (buffer fosfato 0,1 M a pH 6.8 y tetraóxido de osmio al 2%) por 4 h. Luego se repitió el lavado de las muestras (3 veces) con el mismo buffer. A continuación, las muestras se deshidrataron por diferentes grados de acetona (70, 90 y 100%) por 10 min cada vez. Después, las muestras fueron sumergidas en resina plástica y seccionadas en cortes finos en ultramicrótomo automático (LKB, Nova). Finalmente, los cortes fueron teñidos con acetato de uranio por 20 min para ser observados a través del TEM, tomándose electromicrografias con distintos aumentos (4000X hasta 21000X).

La extracción de ADN geonómico de plantas y fitoplasmas fue basado en el protocolo de Lodhi et al. (1994), siendo adaptado para esta especie. Se utilizó 1.0 g de cada muestra (con y sin síntomas de escoba de bruja), las cuales fueron molidas en nitrógeno líquido y repartidas en cuatro tubos de 1.5 mL, donde fueron disueltas en 600 µL (pre-calentado a 60ºC) de buffer de extracción CTAB-PVP 1% (Tris-HCl 100 mM, NaCl 1.4 M, EDTA 20 mM a pH 8.0, 2% CTAB p/v; 0.2% 2-mercapetanol v/v y 1% polivinilpirrolidona PVP40-50G p/v) e incubado a 65ºC por 30 min. Se agregaron 600 µL de cloroformo-octanol (24:1) frío (-20ºC) y se centrifugó a 6000 x g por 5 min. Se extrajo la fase superior y de nuevo se agregaron 400 µL de cloroformo-octanol (24:1). Se repitió el centrifugado y otra vez se extrajo la fase superior. Después se agregaron acetato de amonio (7.5 M) a una concentración final de 2.5 M y 380 µL de isopropanol frío. Todo se mezcló por inversión y se dejó precipitar toda una noche a 4ºC. Luego se centrifugó (13600 x g por 20 min) y se lavó dos veces el precipitado de ADN con 500 µL de etanol frío. A continuación, se volvió a centrifugar (13600 x g por 5 min) y el precipitado formado se secó a temperatura ambiente (aprox. 30 min). Finalmente, el ADN fue resuspendido en 100 µL de buffer TE (Tris-HCl 10 mM y EDTA 1 mM a pH 8.0), además de ser cuantificado mediante un espectrofotómetro (Shimadzu, UV-120-12) y almacenado a -20ºC para su posterior utilización. Para determinar la presencia de ADN fitoplasmático se efectuó una primera reacción (PCR-directa) utilizando un par de partidores universales para fitoplasmas (P1/Tint) (Smart et al., 1996). A partir de esta reacción se realizó una PCR-anidada (nested-PCR) utilizando otro par de partidores (iniciadores) (Fu5/Ru3) (Lorenz et al., 1995). La PCR-directa se realizó en un volumen de 30 µL por muestra, dividida en: 3.0 µL de buffer PCR 10x, 1.0 µL de MgCl2 (50 mM), 2.5 µL dNTP (2 mM), 0.5 µL de cada partidor (P1/Tint) (40 pmol/µL), 1.0 taq ADN polimerasa (1 U/µL), 20.5 µL de agua destilada estéril y 1.0 µL de ADN (20 ng/µL). Los parámetros de la PCR en el termociclador (MJ Research, PTC-150) consistieron de 30 ciclos con una desnaturalización de 94ºC por 1 minuto (3 minutos para el primer ciclo), alineamiento a 56ºC por 1 minuto y elongación a 72ºC por 2 minutos (5 minutos para el último ciclo). Para la PCR-anidada se empleó el mismo volumen (30 µL) y reactivos de la PCR-directa por muestra, excepto quando se incluyeron 18.5 µL de agua destilada estéril y 1.5 µL de los partidores (Fu5/Ru3) (10 pmol/µL) que amplifican una región de 900 pares de bases (pb) del gen 16S rRNA. La reacción de esta PCR fue de 30 ciclos a 94ºC por 50 segundos (3 minutos para el primer ciclo), 55ºC por 1:25 minutos y 72ºC por 1:50 minutos (5 minutos para elongación final). Los productos de la reacción de la PCR-anidada se corrieron en geles de agarosa al 0.8% con 0.1 µL/mL de bromuro de etidio en buffer TBE 0.5x (Tris 45 mM, ácido bórico 45 mM y EDTA 1 mM a pH 8.0) a 100 voltios por 40 minutos. Después los productos PCR fueron observados y fotografiados sobre un transiluminador de luz ultravioleta (Vilmer Lourmat, 6x 15W-312 nm). Además, para comparar los productos de PCR obtenidos provenientes del ADN de murta con presencia de escoba de bruja, se utilizaron productos de PCR de especies como: maíz (Zea mays), remolacha (Beta vulgaris var. saccharifera), frijol (Phaseolus vulgaris), papa (Solanum tuberosum) y crisantemo (Chrysanthemum sp.), que estaban contaminadas con fitoplasmas y que fueron amplificados por los partidores previamente mencionados.

En el caso de los cortes de plantas de murta con síntomas, se observaron microestructuras dentro de las células del floema, presentándose en forma irregular en esta región. Estos cuerpos microscópicos estaban limitados casi exclusivamente a los tubos cribosos, circundantes en su mayoría hacia la pared celular de estas células (Figura 1C), sin que se observaran estos elementos en células acompañantes o células parenquimáticas. Lo visto correspondía a cuerpos pleomórficos de un tamaño aproximado de 100 a 600 nm de diámetro, siendo las formas más frecuentes cuerpos esféricos u oblongos (Figura 1E). Estas microestructuras estaban rodeadas por un tipo de membrana rugosa y que ocasionalmente se encontraban con apéndices o constricciones, que podría ser principio de fisión binaria (Figura 1D-E), muy similar a lo observado en plantas afectadas por fitoplasmas (Chapman et al., 2001; Favali et al., 2004; Siddique, 2005). Sus formas, tamaños y contenidos, junto con la ubicación en las células degeneradas del floema de la planta enferma, son características similares a las descritas para fitoplasmas presentes en otras especies de plantas (Bertaccini et al., 1999; Kaminska et al., 1999; Fránová et al., 2003, Favali et al., 2004; Fránová, 2005; Siddique, 2005). En los tejidos control, plantas sin síntomas de escoba, no se observó la presencia de cuerpos pleomórficos de tipo fitoplasmático u otras estructuras similares (Figura 1F). De igual forma, en las células afectadas no se visualizó la presencia de partículas virales, hongos u otro tipo de procariontes (por ejemplo, espiroplasmas) que pudieran estar relacionados con la enfermedad. Por otra parte, la microscopía electrónica tiene la desventaja que cuando la concentración de fitoplasmas es baja, su eficiencia se reduce. Ésta técnica de comprobación visual de la existencia de fitoplasmas, debería ser complementada por técnicas moleculares para obtener un diagnóstico más acertado. En este sentido, el análisis de PCR (PCR-anidada) amplificó ADN utilizando partidores universales para fitoplasma en plantas de murta con síntomas de escoba bruja. Esto permitió la observación de bandas de ADN de aproximadamente 900 pb de longitud, un tamaño similar para el ADN extraído de otras especies vegetales infectadas con fitoplasmas (maíz, remolacha, fríjol, papa y crisantemo), no habiendo amplificación de ADN fitoplasmático en plantas sanas (control) (Figura 2). El hecho que la PCR-anidada permitiera la detección de ADN fitoplasmático y no la PCR-directa, generalmente es atribuido a problemas de concentración de ADN y de inhibición de algunos polisacáridos y compuestos fenólicos (Green et al., 1999; Khan et al., 2004), lo que muchas veces, limita su visualización en geles de agarosa. Situación que es mejorada con una segunda reacción (PCR-anidada) que optimiza las condiciones e incrementa la sensibilidad (Khan et al., 2004). Sin embargo, es necesario mencionar que al menos un 40% de las muestras con síntomas evaluadas (30 ramillas) después de la segunda reacción, no amplificaron ADN fitoplasmático o dichas amplificaciones fueron inconsistentes, lo cual puede estar relacionado con la concentración irregular de ADN fitoplasmático o la presencia de procariontes contaminantes en los tejidos, como ha ocurrido en algunos casos reportados (Skrzeczkowski et al., 2001). En todo caso, estos resultados confirman las evaluaciones preliminares realizadas con microscopía electrónica de transmisión, indicando que la observación de cuerpos pleomórficos en tejidos con síntomas de escoba de bruja coincide con la presencia de fitoplasmas. Este es el primer reporte que asocia a estos procariontes como agentes causales de la enfermedad de escoba de bruja en plantas de murta, por lo que en futuros trabajos se espera que dicho diagnóstico sea confirmado con la identificación de este fitoplasma y los vectores relacionados a su infección y dispersión en el sur de Chile.

AGRADECIMENTOS

Agradecemos a la Dirección de Investigación y Desarrollo (DID UACH S-98-23) de la Universidad Austral de Chile.

Recebido 11 Fevereiro 2009

Acceptado 10 Agosto 2009

Autor para correspondencia: Nancy Andrade S., e-mail: [e-mail]

TPP 9023

Editor de Sección: Mário Lúcio V. de Resende

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Fechas de Publicación

• Publicación en esta colección
  25 Nov 2009
• Fecha del número
  Ago 2009