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Revista do Colégio Brasileiro de Cirurgiões

versão impressa ISSN 0100-6991versão On-line ISSN 1809-4546

Rev. Col. Bras. Cir. vol.41 no.3 Rio de Janeiro maio/jun. 2014

http://dx.doi.org/10.1590/S0100-69912014000300008 

Artigos Originais

Padronização da técnica de ventilação pulmonar utilizando ventiladores com volume controlado em ratos com hérnia diafragmática congênita

Rodrigo Melo Gallindo2 

Frances Lilian Lanhellas Gonçalves2 

Rebeca Lopes Figueira2 

Ana Leda Bertoncini Simões2 

Lourenço Sbragia2 

2Disciplina de Cirurgia Pediátrica, Departamento de Cirurgia e Anatomia - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo - USP - Ribeirão Preto, SP, Brasil

RESUMO

OBJETIVO:

padronizar uma técnica para ventilar fetos de rato com HDC usando um ventilador volume-controlado.

MÉTODOS:

ratas grávidas foram distribuídas em: a) Controle (C); e b) Expostos a Nitrofen com HDC e sem HDC (N-). Fetos dos três grupos foram divididos aleatoriamente em subgrupos ventilados (V) ou não ventilados (NV). Os fetos foram coletados no dia 21,5 da gestação, pesados e ventilados por 30 minutos usando um ventilador volume-controlado. A seguir os pulmões foram coletados para estudo histológico. Nós avaliamos: peso corporal (PC), peso pulmonar total (PPT), peso do pulmão esquerdo (PPE), razão PPT/PC e PPE/PC, histologia morfológica das vias aéreas e as causas das falhas da ventilação.

RESULTADOS:

PC, PPT, PPE, LLW, PPT/PC e PPE/PC foram maiores em C em relação a N- (p<0,05) e a HDC (p<0,05), mas não houve diferenças entre os subgrupos V e NV (p>0,05). A morfologia das vias aéreas pulmonares mostrou hipoplasia nos grupos N- e HDC, não havendo diferença entre V e NV (p<0,05). Os grupos C e N- puderam ser ventilados com sucesso usando o volume corrente de 75ìl, mas a falha de ventilação no grupo HDC só diminuiu quando ventilados com 50ìl. .

CONCLUSÃO:

a ventilação a volume de ratos com HDC por um curto período é possível e não altera a morfologia fetal ou pulmonar.

Palavras-Chave: Hérnia diafragmática/congênita; Ventilação; Modelos animais; Ratos; Nitrofenóis

INTRODUÇÃO

A hérnia diafragmática congênita (HDC) é um defeito raro que acomete entre 1:2000 a 1:4000 recém-nascidos1 - 3. A hipoplasia e a hipertensão pulmonares levam a desconforto respiratório e são as principais responsáveis pelo óbito pós-natal2. A mortalidade era de 50% em pacientes com diagnóstico isolado de HDC e em torno de 80% quando havia anomalias associadas4 - 7, mas, em alguns centros, vem caindo para 20-30% com a instituição de protocolos de tratamento padronizados1 , 3.

Devido à hipoplasia e à hipertensão pulmonares, o paciente com HDC é de difícil manuseio ventilatório, apresentando shunt direita-esquerda, hipóxia, hipercapnia e acidose mista. Com isso, a frequência de lesão pulmonar, barotrauma e pneumotórax nesses pacientes eram muito altas, o que na maioria das vezes causava o óbito7. Wung et al. estabeleceram os parâmetros atualmente utilizados na ventilação mecânica assistida, com baixa pressão e hipercapnia permissiva (a gentle ventilation), além da postergação da correção cirúrgica8.

Para o estudo da HDC utilizam-se modelos congênitos, cirúrgicos ou toxicológicos9. O modelo mais estudado é o toxicológico em ratos por meio do Nitrofen (2,4-diclorofenil 4-nitrofenil éter). O Nitrofen é um teratógeno que, quando administrado no dia gestacional (DG) 9,5 leva a cerca de 40% de fetos com HDC10, sendo que a grande maioria dos estudos experimentais deste modelo avalia o pulmão ao término da gestação. Dessa maneira, não é possível avaliar as modificações morfológicas e bioquímicas que ocorrem após a ventilação pulmonar.

Vários modelos de ventilação de animais de maior porte, como ovelhas11 - 13 e coelhas14 , 15, foram descritos em HDC, porém estas espécies carecem de opções para realização de estudos moleculares. Devido à dificuldade de ventilação do pulmão nestes pacientes, apenas um modelo em animais de pequeno porte foi descrito. Sluiter et al.14, adaptou um modelo de ventilação de coelhos prematuros para neonatos de ratos, além deste, somente mais três outros trabalhos reproduziram este modelo15 - 17, provavelmente devido a dificuldades técnicas, como o uso de um ventilador sofisticado adaptado, além de instrumentos para confirmar que a ventilação está realmente ocorrendo.

Devido à alta mortalidade neonatal decorrente da hipoplasia pulmonar e às complicações decorrentes da ventilação neste defeito, nosso objetivo foi padronizar um modelo de ventilação em fetos de rato com HDC mais facilmente reprodutível, utilizando um ventilador ciclado a volume, além de avaliar as alterações causadas no parênquima pulmonar após a ventilação.

MÉTODOS

O estudo foi aprovado no Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA) da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo (FMRP-USP) sob o número 043/2011.

Fêmeas de ratos Sprague-Dawley, com peso em torno de 250g, foram submetidas a acasalamento durante uma noite. No dia seguinte um esfregaço vaginal foi realizado e quando se observava uma mancha de esperma, o acasalamento era confirmado. Esse dia era determinado como dia zero da gestação (termo = 22 dias). Os animais foram mantidos em gaiolas com oferecimento de água e ração ad libtum, em condições controladas de luminosidade (12 horas de claro/12 horas de escuro), temperatura (média de 23ºC) e umidade relativa do ar (média de 55%).

As ratas gestantes foram distribuídas em dois grandes grupos: Controle (C) e Nitrofen (N). As ratas do grupo C não eram manipuladas. As ratas do grupo N eram expostas a 100mg de Nitrofen, diluído em 1ml de óleo de oliva, no DG 9,5 de acordo com Kluth et al.10. Os fetos expostos ao Nitrofen que desenvolveram HDC formaram o grupo HDC e os que não desenvolveram HDC formaram o grupo N-, que foi subdividido em ventilados (CV, N-V e HDCV) e não ventilados (C, N- e HDC).

No DG 21,5 as ratas gestantes foram submetidas à anestesia geral com injeção intramuscular de Ketamina (50mg/ml) associada a Xilazina (20mg/ml). As ratas anestesiadas foram colocadas em uma mesa térmica com temperatura de 37ºC. Após antissepsia com clorexidina aquosa, as ratas foram submetidas à laparotomia mediana com exposição dos cornos fetais.

Os fetos foram coletados individualmente, no sentido craniocaudal, iniciando pelo corno direito. O útero era clampeado com uma pinça de Halstead para impedir que o próximo feto fosse expelido e retornado para a cavidade abdominal, que era coberta com uma gaze estéril embebida em solução salina. Quando necessário, uma dose complementar de 0,1ml de Ketamina era feito por via intraperitoneal.

O feto foi pesado (peso corporal - PC) e colocado em outra mesa térmica a 37ºC e fixado com fita crepe em decúbito dorsal (Figura 1A); foi realizada uma incisão cervical longitudinal, dissecção traqueal (Figura 1 B e C), secção desta em sua face anterior e aposição de um cateter de Vialon(r) 24G (Figura 1D). O cateter foi conectado a extremidade de um equipo de soro para melhor conexão ao ventilador. Esse conjunto foi conectado a um ventilador volume-controlado e ciclado a tempo (MiniVent type 845, Harvard Apparatus(r)) (Figura 1E), com frequência de ciclagem de 80 ciclagens/minuto, FiO2 1,0, relação I:E de 1:1, PEEP de 0 cmH2O por 30 minutos. Para impedir a extubação, as conexões entre o ventilador e o cateter da traqueostomia foram fixados, à mesa térmica, com massa de modelar. Após o término da ventilação, nos fetos ventilados, ou após a pesagem corporal, nos fetos não ventilados, eles foram sacrificados por decapitação e seus pulmões foram dissecados (Figura 1F), colhidos para pesagem pulmonar (peso pulmonar total - PPT e peso pulmonar esquerdo - PPE) e enviados para processamento histológico.

Figura 1  A) feto posicionado em decúbito dorsal sobre mesa aquecida (em média 38ºC) e fixados com fita adesiva; B) realização de incisão cervical anterior; C) isolamento da traqueia seguida de secção; D) feto intubado com cateter de teflon e ventilado; E) respirador com frequência fixada em 80/min e volume em 75µl; F) sacrifício por decapitação e colocação em mesa de cortiça para coleta. 

Calculamos um volume corrente de aproximadamente 13,5ml/kg nos fetos C (75µl). Volume maior que o utilizado por Kroon et al.18, porém com uma frequência de ciclagem menor (80 ciclos/minuto). Os fetos N- e HDC foram ventilados com volumes decrescentes de: 75, 63, 50 e 30 µl, anotando-se as taxas de falhas, definidas por: pneumotórax (PT), pneumomediastino (PM) identificado pelo vazamento de ar ao redor da traqueia e falha na cateterização traqueal (FCT) e de sucessos definidos pela observação da expansão torácica e coloração rosácea do feto. As taxas de sucesso e complicações foram constantemente analisadas até encontrarmos o volume ideal.

As seguintes variáveis foram aferidas: PC, PPT e PPE. Para retirar a influência do PC sobre o PPT e o PPE, foram calculadas as razões PPT/PC e PPE/PC. Para análise da morfometria fetal foram coletados oito fetos por subgrupo após padronização do volume corrente.

As amostras foram fixadas em formaldeído, desidratadas em álcool, diafanizadas em xilol e incluídas em parafina histológica. Os cortes histológicos foram realizados com espessura de 5µm e posteriormente coletados em lâminas histológicas pré-silanizadas. Os cortes foram corados por Tricrômio de Masson, e as lâminas foram montadas em Permount(r).

Os cortes histológicos foram fotografados em aumento de 100X em fotomicroscópio e as imagens foram analisadas para obtenção da média linear de interceptação (mean linear intercept - Lm) e seus componentes diâmetro interno dos espaços aéreo (internal diameter of the airspaces - Lma) e a relação de comprimento de transecção do parênquima/espaço aéreo (mean transection length - Lmw), de acordo com os métodos descritos por Dunhill19 e modificados por Verbeken et al.20. A análise morfométrica pulmonar foi realizada utilizando seis cortes por feto e quatro fetos por subgrupo.

Os valores obtidos através das pesagens e mensurações do parênquima pulmonar foram analisados pelo método ANOVA com pós-teste de Tukey-Kramer e expressos em média ± desvio padrão. Foram consideradas diferenças significativas para p<0,05.

RESULTADOS

Os dados das falhas nas ventilações estão agrupados na tabela 1.

Tabela 1  Causas de erros na ventilação estratificado por grupo, volume e acidente. 

Volume Causa Controle(n=38) N-(n=68) HDC(n=40)
C (n=38) N- (n=20) HDC (n=15)
75µl PT 5,3% 5,0% 6,7%
PM 15,8% 5,0% 13,3%
FCT 2,6% 25,0% 46,7%
Total 23,7% 35,0% 66,7%
N- (n=11) HDC (n=7)
63µl PT 18,2% 71,4%
PM 9,1% 0,0%
FCT 27,3% 14,3%
Total 54,5% 85,7%
N- (n=35) HDC (n=15)
50µl PT 8,5% 13,3%
PM 0,0% 0,0%
FCT 28,6% 33,3%
Total 37,1% 46,7%
N- (n=2) HDC (n=3)
30µl PT 0,0% 66,6%
PM 0,0% 0,0%
FCT 50,0% 0,0%
Total 50,0% 66,6%

PT: pneumotórax

PM: pneumomediastino

FCT: falha na cateterização traqueal

Verificamos que o melhor volume para ventilar foi 50µl com 53% de sucesso. Com o volume de 30µl foi possível ventilar, mas não foi possível verificar a expansão pulmonar. Não houve diferença no PC entre fetos ventilados e não ventilados do mesmo grupo (p>0,05). Os fetos do grupo C tiveram PC superior aos fetos dos grupos N- e HDC (p<0,001). Não houve diferença no PPT entre fetos ventilados e não ventilados do mesmo grupo (p>0,05). Os fetos do grupo C tiveram PPT superior aos fetos dos grupos N- e HDC (p<0,001) e os fetos do grupo N- apresentaram resultados similares em relação ao grupo HDC (p<0,05). Resultados similares ao PPT foram encontrados na análise do PPE, do PPT/PC e do PPE/PC (Tabela 2).

Tabela 2  Resultados morfométricos fetais (mg) de cada grupo ventilado e não ventilado. 

C(n=8) CV(n=8) N-(n=8) N-V(n=8) HDC(n=8) HDCV(n=8) p<0,05
P C 5640 5530 4947 4683 4683 4632 b,c,d,e
(±223) (±82) (±116) (±87) (±105) (±398)
PPT 150 139 91 101 75 73 b,c,d,e,g,h
(±13) (±9) (±6) (±1) (±1) (±12)
PPE 50 46 33 37 23 24 b,c,d,e,g,h
(±0,1) (±0,3) (±0,5) (±0,6) (±3) (±0,5)
PPT/PC 0,027 0,025 0,018 0,022 0,016 0,016 b,c,d,e,g,
(±0,002) (±0,002) (±0,001) (±0,002) (±0,002) (±0,002)
PPE/PC 0,009 0,008 0,006 0,008 0,005 0,005 c,d,e,g,h
(±0,0013) (±0,0006) (±0,001) (±0,001) (±0,001) (±0,001)

Grupos comparados - a: C x CV; b: C x N-; c: C x HDC; d: CV x N-V; e: CV x HDCV; f: N- x N-V; g: N- x HDC; h: N-V x HDCV; i: HDC x HDCV.

A análise morfométrica pulmonar mostrou hipoplasia progressiva nos fetos N. Dentre estes, a hipoplasia foi mais importante nos fetos HDC. Em geral, a ventilação por 30 minutos não mudou a morfometria pulmonar, exceto no grupo N-, onde observamos um aumento do Lm e do Lmw após a ventilação pulmonar. Os dados morfométricos pulmonares estão agrupados na figura 2. A figura 3 apresenta amostras de pulmões dos diversos grupos onde podemos observar os diferentes graus do desenvolvimento pulmonar.

Figura 2  Dados das análises morfométricas entre grupos ventilados e não ventilados. Lm: média linear de interceptação, Lma: diâmetro interno dos espaços aéreos, Lmw: relação de comprimento de transecção do parênquima/ espaço aéreo. **p<0,001. C: controle; CV: controle ventilado, N-: exposto a nitrofen; N-V: exposto a nitrofen e ventilado; HDC: hérnia diafragmática congênita; HDCV: hérnia diafragmática congênita ventilada. O eixo y corresponde ao resultado dos cálculos específicos de cada parâmetro. C versus HDC - Lmw (p<0,001) e Lma (p<0,05). N- versus HDC - Lm, Lmw (p<0,001) e Lma (p<0,05). CV versus HDCV - Lm e Lmw (p<0,05). N-V versus HDCV- Lma (p<0,05). 

Figura 3  Aspectos do desenvolvimento pulmonar dos fetos - ventilados e não ventilados A) controle, B) exposto a nitrofen, C) hérnia diafragmática congênita. D) controle ventilado, E) exposto a nitrofen e ventilado, F) hérnia diafragmática congênita ventilada. Notar em C e F a hipoplasia pulmonar representada por maior densidade do parênquima e pouco espaço aéreo, mesmo ventilado. 

DISCUSSÃO

Modelos de ventilação em fetos com HDC são mais descritos em animais de grande porte, como ovelhas e coelhos. Em fetos de ovelhas foram utilizados ventiladores pressão-controlados e ciclados a tempo11 - 13. Em fetos de coelhos foram utilizados ventiladores volume-controlados, ciclados a tempo, porém limitados à pressão21 , 22. Nestes animais só existem modelos cirúrgicos de HDC, com o inconveniente de terem uma manutenção mais cara, uma taxa de aborto alta (coelhas) e uma gestação mais prolongada (ovelhas), além da pouca disponibilidade de marcadores para estudos biomoleculares.

No modelo de pequeno animal como em fetos de ratos, o único modelo descrito baseou-se em outro padronizado para ventilação de coelhos prematuros23, usando um ventilador sofisticado, modificado, pressão-controlado e ciclado a tempo, conectado a um tubo especial para ventilação de múltiplos fetos em paralelo, além de outros equipamentos para monitorização de fluxo e pressão, confirmando que todos os fetos estavam sendo ventilados. A adaptação para ventilação em fetos de ratos foi descrita em 199214, porém, esse modelo foi reproduzido em apenas três outros estudos15 - 17. Em nenhum destes artigos foi descrita a taxa de sucesso na cateterização traqueal ou taxa de complicações após a intubação, visto que o procedimento, os materiais utilizados e os próprios fetos são menores e de manuseio mais delicado. Possivelmente a não descrição desta manobra e das complicações possam justificar a baixa reprodutibilidade do modelo de ventilação em ratos. Por outro lado, em todos eles foram observadas mudanças na biologia molecular pulmonar após um período curto de ventilação.

No modelo de ventilação em ratos recém-nascidos normais, utilizando ventiladores mais simples, volume-controlados e ciclados a tempo, podendo ser24 ou não limitados à pressão18 , 25. O volume corrente admitido para a ventilação variou de 3,5 a 40 ml/Kg, com volume considerado mediano entre 8,5 e 12 ml/Kg e com frequência de ciclagem variando entre 20 e 600 ciclos/minuto, tendo como frequência mediana entre 100 e 160 ciclos/minuto. Porém a utilização de ventilação volume-controlado em ratos possui um limitante que é a possibilidade de se ventilar apenas um feto por vez.

Optamos por usar um volume corrente um pouco mais alto, cerca de 13,5ml/Kg (75µl), mas com uma frequência de ciclagem mais baixa (80 ciclos/minuto) nos fetos do grupo C e obtivemos taxa mínima de falhas. Tentamos utilizar o mesmo volume para os fetos do grupo N, porém, a taxa de complicações como pneumotórax, pneumomediastino ou falha de cateterização traqueal foi muito alta, respectivamente 35 e 66,7 % nos fetos N- e HDC. Recalculamos o volume de acordo com o peso dos fetos expostos ao nitrofen, que são menores (13,5ml/kg@63µL), porém, mesmo ventilando com volume menor, a taxa de complicações ainda se manteve alta, em especial nos fetos HDC, respectivamente 54,5 e 85,7 % nos fetos N- e HDC. Reduzimos o volume ventilatório (10,5ml/Kg e 50µl) e obtivemos maior sucesso nos fetos com HDC, com uma taxa de complicação mais aceitável, respectivamente 37,1 e 46,7 % nos fetos N- e HDC. Finalmente, baixamos o volume para 30µl e, mesmo com o feto corretamente intubado, a visualização da expansão torácica com esse volume foi extremamente difícil, por isso consideramos o volume de 50µl como o volume ideal para ventilação dos fetos do grupo nitrofen.

Como há uma limitação de como diferenciar os fetos do grupo nitrofen se tem ou não hérnia antes do sacrifício sem um ultrassom especial para pequenos animais, tivemos que utilizar um volume que não sobrecarregasse os pulmões dos fetos HDC, mas que também pudesse ventilar e expandir adequadamente os pulmões dos fetos N-. Losty et al. avaliaram a complacência pulmonar estática de fetos de ratos normais e com HDC, e observaram uma diminuição desta nos fetos expostos e, em especial, nos fetos com HDC26, justificando a necessidade de um volume menor no grupo N. Esses resultados também corroboram os achados de um estudo recente do nosso grupo que observou menores volume pulmonar e espaço aéreo nos fetos HDC27.

Após a passagem da curva de aprendizado, a taxa de sucesso na ventilação dos fetos C foi eficiente, enquanto que nos fetos do grupo N a curva de aprendizado foi mais demorada e a taxa de sucesso da ventilação foi bem menor, parte deste insucesso pode ser explicado por Xia et al. que relataram a presença de malformações traqueais nos fetos expostos ao nitrofen com e sem HDC28. Foram observados anéis incompletos em 48 e 70 %, estenoses em 12 e 21 % e anéis vasculares em 12 e 11 %, respectivamente nos grupos N- e HDC.

Os resultados da morfologia fetal e pulmonar estão de acordo com estudos prévios que observaram fetos de tamanho progressivamente menor quando expostos ao Nitrofen (N-) e com HDC, hipoplasia pulmonar em ambos, sendo maior na HDC do que em relação aos fetos C14 , 29 , 30. A ventilação por um tempo curto não alterou significativamente este padrão.

Portanto, no modelo de HDC em ratos, a ventilação a volume controlado e ciclado a tempo foi factível com aproximadamente 50% de sucesso usando o volume de 50µl. Além do mais, a ventilação de curta de duração (30 minutos) não mudou o padrão histológico do parênquima pulmonar demonstrando sinais indiretos de menor complacência no pulmão dos fetos com HDC.

A ventilação de fetos de rato com HDC induzida por Nitrofen é possível usando um ventilador volume-controlado e ciclado a tempo. Após a passagem da curva de aprendizado, a taxa de sucesso na ventilação é excelente nos fetos C e razoável nos fetos N, devido a malformações traqueais. A ventilação por um curto período não altera a morfologia fetal ou pulmonar.

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Fonte de financiamento: FAPESP - #11/00794-1.

Recebido: 28 de Agosto de 2013; Aceito: 28 de Setembro de 2013

Endereço para correspondência: Lourenço Sbragia E-mail: sbragia@fmrp.usp.br

Conflito de interesse: nenhum.

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